帕金森病大鼠模型中转基因表达对多巴胺水平的调控研究

目的 究设计一种病毒载体介导的体内调节系统，依据诱导性Cre重组酶来调控转基因治疗帕金森病大鼠的基因表达。方法 将重组腺相关病毒（AAV）、载体表达的Cre重组酶融合到雌激素受体的配体结合区，与AAV载体表达的多巴胺合成酶一起转导到帕金森病大鼠模型中。用合成的雌激素受体调节剂他莫昔芬处理。结果 诱导位于LoxP侧面的酪氨酸羟化酶（TH）序列选择性的敲掉，导致多巴胺的合成减少，而芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）的表达不受影响，从而保持左旋多巴的疗效。结论病毒载体介导的诱导性的Cre重组酶在体内的应用可作为一种分子开关，对转基因表达进行时空调控．从而增加基因治疗的安全性。     

帕金森病大鼠三重目的基因共表达的长期行为改善

目的　探讨多巴胺合成酶基因的三重共转导对帕金森病基因治疗的效果。方法　分别构建编码酪氨酸羟化酶 (TH)、芳香族氨基酸脱羧酶 (AADC)和三磷酸鸟苷环水解酶I(GCH)基因的腺伴随病毒 (AAV)载体 ,用复合感染的方式将AAV TH、AAV AADC及AAV GCH通过立体定向法注射入帕金森病大鼠损毁侧纹状体。采用免疫组化方法确定TH、AADC和GCH的表达 ;并连续观测基因转导后大鼠行为改善的情况长达 1年。结果　组织学依据显示TH、AADC和GCH基因均可在纹状体内长期有效而稳定的进行表达 ;三重基因转导可引起大鼠较TH和AADC共转导更为显著的行为改善(P <0 0 1)。结论　AAV载体介导的TH、AADC和GCH三重基因纹状体内共表达对于帕金森病大鼠的基因治疗更为有效。     

帕金森病基因治疗的实验研究

帕金森病(PD)的主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元变性,表达的酪氨酸羟化酶(TH)减少或者活性降低。目前外源性多巴是最有效的抗PD药物,但常在数年后失去其有效的治疗作用。用胚胎脑细胞移植虽有效果,但胚胎脑来源困难。因此需要探索新的有效治疗方法。本研究将遗传修饰的成肌细胞植入偏侧PD鼠模型纹状体进行基因治疗。移植转TH基因的成肌细胞(治疗组,n=24)和未经遗传修饰的成肌细胞(对照组,n=10)于偏侧PD鼠损毁侧纹状体。用阿朴吗啡(APO)诱发旋转行为,RT-PCR、TH免疫组化检测TH基因的表达和TH蛋白的合成以及HPLC-ECD检测纹状体多巴胺及代谢产物含量以此评估基因治疗的效果。治疗组移植治疗后APO诱发的旋转行为明显改善(P<0.01),且可持续13个月,而对照组APO诱发的旋转行为无改善(P>0.05),应用RT-PCR、TH免疫组化和HPLC-ECD在治疗组移植部位检测到TH基因的表达、TH蛋白的合成和移植侧纹状体部多巴胺及其代谢产物含量增高。遗传修饰的成肌细胞能够在体内长时间、有效地表达TH,并改善PD鼠的病理行为,是PD基因治疗的合适靶细胞之一。     

帕金森病大鼠TH和AADC基因的共转导研究

目的：探讨在多巴胺水平对帕金森病进行直接转基因调控。方法应用腺伴随病毒（ＡＡＶ）载体共转导酪氨酸羟化酶（ＴＨ）和芳香族氨基酸脱羧酶（ＡＡＤＣ）基因于模型大鼠纹状体，以复合感染方式将ＡＡＶＴＨ和ＡＡＶＡＡＤＣ通过立体定向法注射入帕金森病大鼠病损侧纹状体，连续观测转导后大鼠行为改善情况，并以免疫组化方法测定ＴＨ和ＡＡＤＣ表达。结果ＴＨ和ＡＡＤＣ基因共转导较单纯ＴＨ基因转导更明显改善大鼠行为（Ｐ＜００１），组织学证据表明两基因在纹状体内获有效而稳定的共表达。结论ＴＨ和ＡＡＤＣ基因的共转导策略，对提高帕金森病基因治疗疗效有重要意义。     

Nurrl在MN9D细胞中的过表达及其对酪氨酸羟化酶的影响

目的：观察MN9D细胞中Nurrl的表达和分布及Nurrl过表达对酪氨酸羟化酶的影响。方法：应用高压液相色谱、免疫细胞化学、转基因、Westernblot和Northemblot等方法检测了MN9D细胞中多巴胺及其代谢物的水平和Nurr1蛋白在细胞中的分布，建立了过表达Nurr1的细胞株并观察了Nurr1过表达对TH基因的影响。结果：MN9D细胞裂解液中含有大量多巴胺及其代谢物；Nurr1蛋白主要分布在MN9D细胞的胞质中，尤以核周最多；MN9D细胞中有Nurr1的mRNA存在和蛋白质的表达；过表达Nurr1的MN9D细胞A1株酪氨酸羟化酶表达增高。结论：Nurr1与多巴胺能神经元发育有关。有可能用于帕金森病的基因治疗。     

Nurr1在MN9D细胞中的过表达及其对酪氨酸羟化酶的影响

目的:观察MN9D细胞中Nurr1的表达和分布及Nurr1过表达对酪氨酸羟化酶的影响.方法:应用高压液相色谱、免疫细胞化学、转基因、Western blot和Northern blot等方法检测了MN9D细胞中多巴胺及其代谢物的水平和Nurr1蛋白在细胞中的分布,建立了过表达Nurr1的细胞株并观察了Nurr1过表达对TH基因的影响.结果:MN9D细胞裂解液中含有大量多巴胺及其代谢物;Nurr1蛋白主要分布在MN9D细胞的胞质中,尤以核周最多;MN9D细胞中有Nurr1的mRNA存在和蛋白质的表达;过表达Nurr1的MN9D细胞A1株酪氨酸羟化酶表达增高.结论:Nurr1与多巴胺能神经元发育有关,有可能用于帕金森病的基因治疗.     

Nurr1在MN9D细胞中的过表达及其对酪氨酸羟化酶的影响

目的 :观察MN9D细胞中Nurr1的表达和分布及Nurr1过表达对酪氨酸羟化酶的影响。 方法 :应用高压液相色谱、免疫细胞化学、转基因、Westernblot和Northernblot等方法检测了MN9D细胞中多巴胺及其代谢物的水平和Nurr1蛋白在细胞中的分布 ,建立了过表达Nurr1的细胞株并观察了Nurr1过表达对TH基因的影响。结果 :MN9D细胞裂解液中含有大量多巴胺及其代谢物 ;Nurr1蛋白主要分布在MN9D细胞的胞质中 ,尤以核周最多 ;MN9D细胞中有Nurr1的mRNA存在和蛋白质的表达 ;过表达Nurr1的MN9D细胞A1株酪氨酸羟化酶表达增高。结论 :Nurr1与多巴胺能神经元发育有关 ,有可能用于帕金森病的基因治疗。     

Nurr1基因在体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞的表达

目的获得表达孤儿核受体（Nurr1）基因的骨髓源性神经干细胞（BMSCs-NSCs）。方法构建携带Nurr1基因的重组腺相关病毒（AAV）载体AAV-pcDNA3．1-Nurr1，提取质粒，用脂质体转染法转染大鼠BMSCs-NSCs，并用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测阳性细胞。结果经酶切鉴定和DNA测序，证实得到了序列正确的重组pAAV-Nurr1，获得了Nurr1阳性的BMSCs-NSCs。结论重组AAV携带的Nurr1基因能够在BMSCs-NSCs中表达，本研究为进一步探讨将该基因工程细胞用于帕金森病基因治疗提供了可能性，     

转基因成肌细胞移植治疗帕金森病的实验研究

评价转基因成肌细胞移植治疗帕金森病（ＰＤ）的疗效。方法移植转酪氨酸羟化酶（ＴＨ）基因的成肌细胞（ｎ＝２４）和未经遗传修饰的成肌细胞（ｎ＝１０）于偏侧ＰＤ鼠损毁侧纹状体。用阿朴吗啡（ＡＰＯ）诱发旋转行为，反向聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、ＴＨ免疫组化检测ＴＨ基因的表达和ＴＨ蛋白的合成以及高效液相色谱仪－电化学检测器（ＨＰＬＣ－ＥＣＤ）检测纹状体多巴胺及代谢产物含量以此评估基因治疗的效果。结果治疗组移植治疗后ＡＰＯ诱发的旋转行为明显改善（Ｐ＜０．０１），且可持续１３个月，而对照组ＡＰＯ诱发的旋转行为无改善（Ｐ＞０．０５），应用ＲＴ－ＰＣＲ、ＴＨ免疫组化和ＨＰＬＣ－ＥＣＤ在治疗组移植部位检测到ＴＨ基因的表达、ＴＨ蛋白的合成和移植侧纹状体部多巴胺及其代谢产物含量增高。结论遗传修饰的成肌细胞能够在体内长时间、有效地表达ＴＨ，并改善ＰＤ鼠的病理行为，是ＰＤ基因治疗的合适靶细胞之一。     

酪氨酸羟化酶cDNA移植治疗帕金森病的实验研究

帕金森病(PD)的主要病因是黑质多巴胺能神经元损伤,表达的酪氨酸羟化酶(TH)减少。本文在应用6-羟多巴胺(6-OHDA)制备偏侧PD大鼠模型的前提下,首次将TH cDNA移植到PD大鼠纹状体内,模型动物的旋转行为明显改善,用免疫组化法及PCR法证实了外源性THcDNA可以进入脑细胞内,并表达出有生物活性的TH。     

转基因成肌细胞脑内移植后帕金森病大鼠纹状体多巴胺含量的变化

为评价转鼠酪氨酸羟化酶（TH）基因的成肌细胞脑内移植对偏侧帕金森病（PD）大鼠模型纹状体区多巴胺及代谢产物含量的影响，应用6－羟多巴胺损毁SD大鼠单侧黑质制备偏侧帕金森病臣模型。模型稳定必个月后，移植转TH基因的成肌细胞（n＝24）或未转基国的成肌细胞（n＝10）于偏侧PD鼠损毁侧纹状体。移植治疗后6个月，用高效液相色谱电化学法（HPLC－ECD）检测偏侧PD鼠模型纹状体区多巴胺、3，4－二羟苯乙酸（DOPAC）以及高香草酸（HVA）含量。结果转TH基因成肌细胞植入组PD鼠纹状体区多巴胺及代谢产物含量明显增高（P＜0．01），其中多巴胺含量从治疗前平均39．20Pg／mg提高至治疗后的985．71Pg／mg，相当于正常侧纹状体的49．99％．对照组植入未转基因的成肌细胞后纹状体多巴胺及代谢产物含量无明显变化（P＞0．05）。可见转鼠TH基因的成肌细胞脑内移植能够部分改善偏侧PD鼠模型纹状体区多巴胺的缺乏，成肌细胞是PD基因治疗的合适靶细胞之一。     

帕金森病基因治疗的实验研究

帕金森病基因治疗的实验研究周国庆周孝达陈生弟帕金森病（ＰＤ）是中老年期常见的神经系统变性疾病。其主要病因是黑质致密斑多巴胺（ＤＡ）神经元损伤，表达的酪氨酸羟化酶（ＴＨ）减少或活性降低，导致脑内ＤＡ含量明显减少。目前外源多巴胺替代治疗只能控制症状却无法...     

AADC和NURR1基因联合c17.2神经干细胞移植治疗帕金森病的实验研究

目的研究芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因和NURR1基因联合c17．2神经干细胞脑内移植后对帕金森病模型大鼠的治疗效果。方法人类神经元性AADC基因和NURR1基因真核表达载体分别转染至c17．2神经干细胞内。将帕金森病(PD)模型大鼠随机分为4组,分别予以脑内毁损侧纹状区移植含空质粒的c17．2神经干细胞(A组),pCDNA3-AADC转染后的c17．2神经干细胞(B组),pCDNA3-NURR1转染后的c17．2神经干细胞(C组)以及含有pCDNA3-AADC和pCDNA3-NURR1转染后的c17．2 神经干细胞(D组)。观察其病理性旋转行为的改善,采用酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组化方法研究脑内多巴胺含量的变化,并用荧光示踪方法观察c17．2细胞在PD模型脑内的移行。结果各组动物脑内移植后动物旋转行为较前均有改善(P<0．05),尤以D组改善最为明显,其行为学最大改善达73．7％,且同A、B、C组间差异具有显著性(P<0．05)。免疫组化可见各组移植TH阳性细胞明显增多,TH染色的神经元树突或轴突密集,体内TH阳性区域明显较PD模型组扩大,其中尤以D组病理学改善最为明显。荧光示踪观察c17．2神经干细胞有突触形成,并与临近的细胞建立突触联系。结论 AADC基因联合NURR1基因共转染c17．2神经干细胞脑内移植后改善了动物的旋转行为,增加了脑内多巴胺的表达,且植入的神经干细胞可同宿主神经元形成突触联接,为研究多基因联合神经干细胞移植治疗帕金森病提供了新方法。     

通用腺相关病毒载体构建及表达报告基因GFP的研究

目的　构建基因治疗通用型 AAV载体并检测它转导外源基因作用。方法　使用限制性内切酶切出p SSV9int-质粒中的 AAV病毒 Rep和 Cap基因元件后 ,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒 -p ACCMVp L p A的含有CMV启动子、多克隆位点 (MCS)和多聚腺苷酸信号 (Poly A)的表达盒 ,构建了重组 AAV通用载体质粒 p SSHG-CMV。在该质粒 MCS插入 GFP基因后 ,我们使用 p SSHG-CMV-GFP、p GF14 0和 p AAV/Ad 3种质粒共转染 2 93包装细胞 ,制备 GFP重组 AAV,应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度度 ,并将该病毒感染新生大鼠星形胶质细胞 ,荧光显微镜观察 GFP表达。结果　重组 AAV的滴度在浓缩前可达 2× 10 11,浓缩后可达 2× 10 13 ,表明成功的构建了重组 AAV载体 ,插入外源基因 GFP后 ,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下 ,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组 GFP-AAV的大鼠星形胶质细胞表达了明显的 GFP荧光。结论　本文构建的重组 AAV通用载体 p SSHG-CMV,可转导外源基因 ,用于基因治疗的研究     

GFP-Nurr1基因修饰神经干细胞的建立及过表达Nurr1对神经干细胞向多巴胺神经元分化的影响

目的利用慢病毒载体建立GFP-Nurr1基因修饰的原代神经干细胞(NSCs)模型并观察Nurr1过表达后NSCs向多巴胺神经元的分化影响。方法利用基因重组构建pLenO-DCE-Nurr1慢病毒载体,用慢病毒转染第三代NSCs,转染72 h后荧光检测转染效果;设置空白对照组、空载体组及DCE-Nurr1组,分别用Western blot及PCR检测Nurr1的表达差异;并将转染后的NSCs分化培养7 d后分别用免疫细胞化学检测、Western blot及PCR检测酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果慢病毒转染NSCs 72 h后,转染率可达90%,与对照组相比DCE-Nurr1组高表达Nurr1。经慢病毒载体感染后的NSCs仍具备分化潜能,分化培养后发现DCE-Nurr1组分化的神经细胞中TH阳性细胞分化率90.60%,对照组为21.2%。结论慢病毒载体可高效转染NSCs过表达Nurr1;Nurr1基因过表达可以促进中脑腹侧来源NSCs向TH阳性多巴胺能神经元方向分化。     

重组腺伴随病毒载体在肿瘤基因治疗中的作用

腺伴随病毒(adeno-associated virus,AAV)是一种辅助依赖型的微小病毒。在基因治疗研究中,重组逆转录病毒和重组腺伴随病毒在基因转移载体中一直占主导地位,特别是用AAV作为基因转移载体已成为基因治疗研究的热点。本文仅就重组腺伴随病毒载体在肿瘤基因治疗中的作用的相关研究     

TH和GDNF双转基因工程细胞对多巴胺能神经元的保护作用

目的将人的外源基因TH和GDNF共同转染SH-SY5Y细胞,建立一种可同时高效稳定表达TH和GDNF的工程细胞,探讨其在帕金森病(PD)基因治疗中的作用。方法将人GDNF和TH的cDNA构建于表达载体PcDNA3.0和PcDNA3.1,形成重组真核表达载体PcDNA3.1/hGDNF、和PcDNA3.0/hTH,同时转染至SH-SY5Y细胞系,利用RT-PCR鉴定筛选出高效稳定表达阳性克隆,将此工程细胞与大鼠原代多巴胺(DA)能神经元共培养,免疫细胞化学检测观察DA能神经元的数目和生长状态。结果成功建立了可同时高效稳定表达人TH和GDNF双基因的工程细胞,并且该细胞可防止DA能神经元退变死亡,有助于DA能神经元抵抗MPP+的毒性损伤。结论人TH和GDNF双转基因工程细胞对DA能神经原有防治兼顾的保护作用。、     

神经细胞黏附分子在正常老化大鼠黑质致密部多巴胺能神经细胞的表达

目的：观察神经细胞黏附分子（NCAM）和酪氨酸羟化酶（TH）在大鼠黑质致密部（SNc）多巴胺（DA）能神经细胞表达的变化,探讨其发生机制。方法：健康雄性SD大鼠24只,分为成年组（4—5月龄）和老年组（≥24月龄）,取中脑黑质,分别进行TH和NCAM的免疫组织化学染色及免疫印迹检测蛋白表达,显微镜下计数免疫组化染色阳性神经细胞,灰度分析电泳条带。结果：SNc的DA能神经细胞几乎都表达NCAM,老年大鼠SNcTH阳性细胞总数及蛋白量均无减少（P〉0．05）,但尾侧段TH阳性细胞减少（P〈0．05）;NCAM在阳性细胞总数及蛋白量均减少（P〈0．05）,但各段阳性细胞的减少无统计学意义（P〉0．05）。结论：正常老化后大鼠的SNcDA能神经细胞DA合成降低,并且NCAM可能参与了这种DA的合成下降。     

过表达多巴胺脱羧酶、酪氨酸羟化酶和三磷酸鸟苷环化水解酶1重组慢病毒构建及其在帕金森病大鼠模型治疗作用的研究

目的构建同时表达3种多巴胺(DA)合成相关酶的重组慢病毒(rLV),验证其在6-羟基多巴胺(6-OHDA)帕金森病(PD)大鼠模型中治疗作用,为PD临床基因治疗提供实验基础。方法构建过表达多巴胺脱羧酶(DDC)、酪氨酸羟化酶(TH)和三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)rLV及对照rLV。6-OHDA制备的PD模型大鼠,随机分为生理盐水组(n=6)、阴性病毒组(n=6)和阳性病毒组(n=12),分别经立体定向向大鼠纹状体注射生理盐水、对照rLV和DDC+TH+GCH1-rLV。观察构建病毒对PD大鼠旋转行为的影响,免疫荧光法检测病毒转染情况,同时使用高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)检测纹状体内DA及其代谢产物改变情况。结果 PD大鼠纹状体注射后,阳性病毒组行为改变与生理盐水组、阴性病毒组比较,差异有显著统计学意义(P0.01);阳性病毒组呈现显著的旋转行为改善。免疫荧光显示阳性病毒转染表达有TH活性的阳性细胞。阳性病毒组纹状体内DA及其代谢产物与生理盐水组、阴性病毒组比较,显著增高(P0.01)。结论成功构建过表达DDC+TH+GCH1-rLV,并且在PD模型大鼠中呈现显著的行为改善及DA水平增加,为PD的基因治疗提供实验基础。     

TH基因修饰细胞脑内移植治疗猴帕金森病的实验研究

目的 评价包囊化酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroylase,TH）基因修饰的基因工程细胞脑内移植治疗帕金森病的疗效。方法 将pcDNA3/hTH质粒转染人神经母细胞瘤细胞系SYTY细胞，筛选出阳性克隆，微包囊化处理后的含有TH基因修饰细胞植入PD猴模型脑内，观察其行为、CSF中DA含量的变化，用免疫组化法检查移植细胞的存活情况。结果 （1）pcDNA3/hTH基因经亚克隆，提取纯化的质粒，经ECORI酶切后产生1.9Kb和5.5Kb的片段。转基因后的SY5Y细胞免疫细胞化学染色显示TH染色强阳性；（2）移植后PD猴症状明显改善，脑脊液中DA含量升高；（3）SABC免疫组化发现移植区存在大量TH阳／性细胞。结论 构建的TH基因工程细胞体外和体内均表达人类TH基因；微包囊化处理后的基因工程细胞在PD猴脑内存活并发挥治疗作用。