体内外不同环境对大鼠胚胎神经干细胞分化的影响

目的 探讨体内外不同环境条件对大鼠胚胎神经干细胞分化影响。方法 孕龄16天的大鼠胚胎神经干细胞体外扩增后移植至大鼠脑内尾状核出血部位；同时体外将其与新生大鼠Schwann细胞共培养，应用免疫组织化学和免疫荧光方法分另检测神经细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性标志蛋白tubulin-β、MAP2，GFAP和GalC的表达。结果 移植到脑内的BrdU阳性细胞环绕脑出血区域分布，大部分细胞GFAP阳性，少部分细胞tubulin-β或ＧalC阳性；而与Ｓchwann细胞共培养后，神经干细胞大部分呈tubulin-β和ＭＡＰ２免疫荧光阳性，少部分呈ＧＦＡＰ或ＧalC免疫荧光阳性。结论 脑内尾状核出血环境诱导神经干细胞主要分化成神经胶质细胞；而体外与Ｓchwann细胞共培养主要诱导其分化成神经细胞。     

神经干细胞在创伤性脑损伤灶周边的成活和迁移*

背景：成年人中枢神经系统再生困难,颅脑损伤后,损伤灶周边区域神经细胞的存活数量直接影响患者的预后。如何有效地使移植入创伤性脑损伤灶周边的神经干细胞存活分化,是目前神经修复再生研究的重点。 目的：探讨神经干细胞移植入大鼠创伤性脑损伤灶周边的成活、迁移和分化情况。 方法：利用无血清培养技术,加入表皮生长因子、碱性成纤维生长因子诱导刺激大鼠胚胎源性前脑神经干细胞生长增殖,并在体外进行克隆培养,移植前行BrdU标记,采用免疫组化和免疫荧光法检测其增殖特性和多向分化潜能,并观察其移植到Fenney’s落体脑损伤模型鼠脑皮质内的成活和迁移情况。 结果与结论：免疫组化及免疫荧光检测结果显示克隆细胞球呈nestin和BrdU阳性,分化后呈NSE,GFAP,MAP-2阳性。免疫组化及荧光双标检测结果显示移植后7,14 d损伤灶周边散在BrdU阳性细胞,并且GFAP阳性细胞增多。提示前脑神经干细胞在体外培养中能够增殖,并分化为神经元和神经胶质细胞,移植后能够在创伤性脑损伤灶周边存活和迁移,形态上显示出与脑组织整合的特点。     

人脐血单个核细胞移植在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的迁移及分化

背景：研究发现脐血单个核细胞脑内移植后可以存活，并减轻缺氧缺血性脑损伤程度，显著改善脑损伤大鼠的远期行为学，但作用机制仍未阐明。 目的：将人脐血单个核细胞经侧脑室移植入缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内，观察植入细胞在脑内的迁移与分化。 设计、时间及地点：细胞学体内观察，于2007-12/2008-08在潍坊医学院分子影像学研究中心完成。 材料：脐血来源于健康、足月妊娠产妇，由潍坊医学院附属医院产科提供。清洁级健康7 d龄SD新生大鼠50只，由山东省中医药大学动物中心提供。 方法：Ficoll法体外分离培养人脐血单个核细胞，移植前3 d行BrdU标记。50只大鼠均采用Rice-Vannucci法复制缺氧缺血性脑损伤模型，造模后24 h，在左侧侧脑室(AP：-0.5 mm，ML：-2 mm，DV：-2 mm)注入脐血单个核细胞悬液，2 μL/点，共1×105个活细胞。分别于细胞移植后24 h，3 d，7 d，14 d，28 d取材制备脑组织切片，10只/时间点。 主要观察指标：采用免疫荧光双标法检测移植脐血单个核细胞的脑内迁移、神经干细胞的表达、分化情况。 结果：50只大鼠均进入结果分析。①移植后24 h侧脑室内可见BrdU+细胞；移植后3，7 d移植细胞迁移到室管膜下区；移植后14，28 d移植细胞迁移到大脑皮质及海马。②移植后24 h侧脑室内可见BrdU+nestin+细胞；移植后3 d室管膜下区出现BrdU+nestin+细胞；移植后7 d BrdU+nestin+细胞数增加；移植后14 d BrdU+nestin+细胞数下降。③移植后14 d大脑皮质、海马开始出现BrdU+NSE+细胞与BrdU+GFAP+细胞，移植后28 d双阳性细胞数进一步增加，BrdU+NSE+ 细胞及BrdU+ GFAP+细胞占BrdU+的比例也增加。 结论：脐血单个核细胞侧脑室移植入脑内后可以继续存活，并迁移到大脑皮质与海马部位，分化为成熟的神经元与神经胶质细胞。     

大鼠脑损伤后脑内移植骨髓基质细胞的研究

目的研究大鼠脑损伤后骨髓基质细胞(BMSCs)颅内移植对内源性神经干细胞(NSCs)的作用。方法 48只雄性Wistar大鼠随机分为3组:正常对照组、移植组、非移植组。大鼠脑损伤后24 h立体定向下局部注射BMSCs,然后每天腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)2次。损伤后14 d和28 d随机处死取脑,行BrdU免疫组化染色以及BrdU和神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化双染色。结果局部注射BMSCs的移植组大鼠表达BrdU/NSE阳性的细胞较非移植组为多。结论大鼠脑损伤后BMSCs对内源性NSCs的分化有促进作用。     

大鼠骨髓基质细胞经枕大池移植后在损伤脑组织中的存活和分化

目的:探讨MSCs经枕大池移植到创伤性脑损伤模型大鼠的蛛网膜下腔后迁移到损伤脑组织存活并分化为神经细胞的能力。方法:采用Feeney’s自由落体脑创伤模型,建立23个大鼠脑创伤模型。从SD大鼠的后肢骨髓分离培养得MSCs,将第三代的MSCs以BrdU在体外标记。随机取15个脑创伤大鼠模型接受MSCa枕大池注射(脑创伤细胞移植组);随机取6个脑创伤大鼠模型接受枕大池注射生理盐水(脑创伤生理盐水组);取6个正常大鼠接受枕大池注射MSCs(正常大鼠细胞移植组)。定期杀死大鼠制作脑组织石蜡切片,行BrdU、BrdU-GFAP、BrdU-MAP2的免疫组织细胞化学染色。另取两个脑创伤大鼠在创伤1周后脑石蜡切片行HE染色。结果:观察到脑创伤细胞移植组石蜡切片BrdU染色可见BrdU阳性细胞,细胞进入皮质下的最大距离为3 mm。双标记染色可见部分BrdU阳性细胞胞质呈现GFAP或MAP_2染色阳性。而另外两组均未见阳性细胞。结论:大鼠MSCs具有从蛛网膜下腔迁移入损伤脑组织存活一定时期并分化为神经细胞的能力。     

神经干细胞脑室内移植治疗大鼠脑缺血的实验研究

目的 探讨大鼠胚胎神经干细胞移植治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的可行性。方法 取胎龄8～10d大鼠神经干细胞体外扩增．采用免疫组织化学方法检测神经干细胞及其分化后代的特异性标志巢蛋白（nestin）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达。以Brdu标记神经干细胞，分别于缺血后24h和4周移植至局灶性脑缺血大鼠模型的脑室内和梗死中心，比较不同移植部位和不同移植时间神经干细胞的存活、增殖和迁移情况。结果 移植后可见移植细胞存活至少8周以上．移植部位不同不影响细胞存活。脑室内移植细胞向脑缺血区域迁移．且以缺血后24h移植组较缺血后4周移植组迁移趋向性更强。结论 大鼠胚胎神经干细胞移植至局灶性脑缺血大鼠脑室内和梗死中心均可长期存活并广泛迁移．其迁移趋化能力与缺血后移植时间有关。     

大鼠脑损伤后经枕大池及立体定向脑内移植神经干细胞的对比研究

目的 探讨大鼠脑损伤后，将神经干细胞（neural stem cells，NSCs）经枕大池移植到蛛网膜下腔及立体定向移植到脑内，观察神经功能恢复情况。方法 体外培养的NSCs取自胎鼠皮层，采用Feeney自由落体脑创伤模型制成大鼠脑损伤模型，伤后24小时将NSCs经枕大池移植到蛛网膜下腔及经立体定向移植到脑内。伤前24小时、伤后24小时及1、2周行动物运动神经功能评分。结果 接受NSCs移植的两组大鼠神经运动功能评分均较损伤对照组明显提高（P〈0．05），两移植组大鼠神经运动功能评分无明显差别。结论 经枕大池移植的NSCs具有远距离迁移能力，并能像脑内移植一样明显有助于大鼠神经运动功能的恢复。     

神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤实验研究

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞移植治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的可行性。方法孕龄8~10d的大鼠神经干细胞在体外扩增后,用免疫组织化学方法分别检测神经干细胞及其分化后代的特异性标志蛋白nestin、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。分别于缺血后不同时间窗将神经干细胞移植到局灶性脑缺血大鼠模型的缺血半暗带和梗塞中心,移植4w后比较不同移植部位神经干细胞存活、增殖和迁移的差异。结果从胎鼠中成功培养出悬浮生长的可表达nestin的神经球,其在含血清条件下可分化为表达GFAP的胶质细胞和表达NSE的神经元。神经干细胞移植4w后可见所有移植动物的细胞都存活,梗塞中心移植的细胞存活、增殖水平明显低于半暗带移植的细胞。结论大鼠胚胎神经干细胞移植到局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠梗塞中心和半暗带均可长期存活,其增殖能力与移植部位密切相关。     

神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的实验研究

目的探讨胎鼠皮质培养的神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的可行性及疗效。方法取孕龄15d Sprague-Dawley(SD)胎鼠皮质细胞培养为神经干细胞;用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型;将24只健康SD大鼠分为假手术组、缺血对照组、缺血移植组,在移植后2周、4周依据Garcia的18分评分法对各组大鼠的神经功能进行评分;行脑灌注固定取材,免疫组化染色观察移植后神经干细胞的分化、迁移和整合情况。结果用胎鼠皮质培养的细胞nestin表达阳性;缺血移植组大鼠的神经功能评分明显高于缺血对照组(P<0.05);缺血移植组免疫组织化学染色能够检测到存活的BrdU阳性细胞,移植后4周时可见移植细胞向周围迁移、分化、参与血管形成,并可见梗死区边缘微血管明显增生;缺血移植组大鼠脑GFAP阳性细胞数较缺血对照组明显增多(P<0.05)。结论分离、培养胎鼠皮质细胞Nestin表达阳性,即是大鼠的神经干细胞;移植体外培养的神经干细胞能在脑缺血大鼠脑内存活、迁移、分化,并且对脑梗死大鼠的神经功能修复起到了积极作用。     

胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植β-淀粉样蛋白损伤大鼠海马后的靶向迁移与分化(英文)

目的观察小鼠胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植β-淀粉样蛋白(amyloidβpeptide,Aβ)损伤大鼠海马后的靶向迁移及在体分化。方法采用无血清培养法将表达绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的小鼠胚胎干细胞定向诱导为神经前体细胞,移植至Aβ_(1-40)、单侧损伤的大鼠海马;免疫荧光观察移植细胞的迁移距离、迁移方向与分化情况:对移植细胞的平均迁移距离与平均分化率作相关性分析。结果胚胎干细胞经改良的无血.清培养法生长可分化为nestin阳性神经前体细胞。移植后第16周,神经前体细胞平均迁移距离比第4周增长了约5倍。移植细胞中,胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)阳性细胞的平均分化率从(30.41±1.45)%增长到(49.25±1_23)%;神经丝蛋白200(neurofilament 200,NF200)细胞的平均分化率从(16.68±0.95)%增长到(27.94±1.21)%;靶向迁移至Aβ斑块同侧的GFAP阳性细胞的比例从60.2%增长到81.3%,靶向迁移至Aβ斑块的NF200阳性细胞的比例从61.3%增至84.1%。相关性分析结果显示平均迁移距离与神经元分化率之间存在显著线性相关(r=0.991),与胶质细胞分化率之间也存在显著线性相关(r=0.953)。结论胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植Aβ损伤模型大鼠海马后能够靶向迁移至Aβ损伤区并分化为胶质细胞和神经元。     

神经干细胞移植治疗大鼠创伤性脑外伤的实验研究

目的 将神经干细胞(NSCs)移植于大鼠创伤性脑损伤部位,观察NSCs对创伤性脑损伤的治疗作用.方法 首先进行NSCs的体外培养,同时采用5-2-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记,脑外伤模型采用自由落体撞击大鼠左侧大脑皮质运动感觉区来制作,脑外伤后24h内移植NSCs,分别于脑外伤前、脑外伤后1、2、3周时行神经运动行为学评分(NMFE)和免疫组织化学染色检测BrdU、巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷酯(GalC)蛋白表达和TUNEL原位杂交染色,经计算机图像分析系统处理.结果 大鼠自由落体撞击伤后,右下肢神经运动功能障碍明显.神经运动行为学评分在第1周时,实验组与对照组无明显差异,而在第2、3周时,实验组的评分明显低于对照组,有统计学意义(P＜0.05).第2、3周时实验组NSE、GFAP和GalC染色阳性细胞数要多于对照组,nestin染色在第1周时表达最高,而后逐渐下降.BrdU阳性细胞在损伤灶中心区最多,在损伤灶的远隔部位也有少许发现,而TUNEL染色则对照组明显比NSCs组高,有统计学意义(P＜0.05).结论 脑外伤移植NSCs可以在损伤区存活、增殖及分化,并在损伤的远隔部位有少许NSCs迁移、分化.NSCs移植有利于大鼠脑自由落体撞击伤后期的功能恢复.     

Nogo-6受体基因沉默神经干细胞立体定向移植治疗重型脑损伤

Inhibition of neurite growth, which is mediated by the Nogo-66 receptor (NgR), affects nerve regeneration following neural stem cell (NSC) transplantation. The present study utilized RNA interference to silence NgR gene expression in NSCs, which were subsequently transplanted into rats with traumatic brain injury. Following transplantation of NSCs transfected with small interfering RNA, typical neural cell-like morphology was detected in injured brain tissues, and was accompanied by absence of brain tissue cavity, increased growth-associated protein 43 mRNA and protein expression, and improved neurological function compared with NSC transplantation alone. Results demonstrated that NSC transplantation with silenced NgR gene promoted functional recovery following brain injury.     

脑皮层创伤灶注射法移植神经干细胞实验研究

目的 观察食蟹猴自体骨髓源神经干细胞移植到大脑皮层创伤灶内的存活、生长情况.方法 取骨髓分离、纯化骨髓基质细胞,培养诱导成神经干细胞,nestin染色表达阳性后再加入细胞标记物BrdU进行共培养7d待移植用.移植前将BrdU标记的神经干细胞收集、离心,制成干细胞悬液,要求活细胞＞80%.食蟹猴在采用Allen's打击法制作皮层创伤灶后,分即时移植(术后即在创伤灶注入,n=3)和延迟移植组(术后30 d在创伤灶注入,n=3),用微量注射针将干细胞悬液注入到猴脑皮质损伤灶.同时设置对照组(n=1),在动物的左侧皮层制作创伤灶并按上述方法注射含同样浓度BrdU的神经干细胞培养液0.5 mL,右侧皮层注入干细胞悬液.移植后1、3、6个月即时移植组、延迟移植组各灌杀1只食蟹猴,移植后6月灌杀对照组食蟹猴,做移植区组织切片染色检查.结果 即时移植组和延迟移植组都可观察到脑皮层创伤灶内有棕褐色的BrdU标记阳性细胞,而对照组组织切片中则未见BrdU阳性表达细胞.移植后BrdU阳性表达细胞早期呈簇状分布,随后散在分布,6个月后细胞形态多样.移植后6个月在移植区邻近的脑白质内也可观察到有BrdU阳性表达的细胞.结论 移植的骨髓源性神经干细胞在脑皮层创伤灶内有存活并可向邻近区域迁移.     

Exercise increases neural stem cell proliferation surrounding the area of damage following rat traumatic brain injury

Exercise enhances neuronal stem cell (NSC) proliferation and neurogenesis. However, the effect of exercise on NSC proliferation surrounding the area of damage after traumatic brain injury (TBI) is unknown. Here, we investigate the effect of running on NSC proliferation following TBI in the rat. Wistar rats received TBI and were randomly divided into two groups: (1) non-exercise group and (2) exercise group. The exercise group ran on a treadmill for 30 min/day at 22 m/min for 7 consecutive days. Immunohistochemistry was used to monitor NSC proliferation around the damaged area, and ex vivo techniques were used to isolate NSCs from the damaged region in both groups. The number of nestin- and Ki67-positive cells observed at 3 and 7 days after TBI was significantly greater in the exercise group than in the non-exercise group (P < 0.01). Furthermore, most nestin-positive cells in the exercise group co-localized with Ki67-positive cells. In ex vivo studies, spheres could be isolated from injured brain tissue from the exercise group at 3 and 7 days following TBI, but at only 3 days in the non-exercise group. The number of spheres isolated from injured brain tissue was greater in the exercise group than in the non-exercise group. Spheres were immunopositive for nestin and comprised NSCs that could differentiate into neurons and glia. Exercise increases the proliferation of NSCs around the damaged area following TBI. Therefore, exercise therapy (rehabilitation) in the early phase following TBI is important for recuperation from cerebral dysfunction induced by TBI.     

不同来源成体神经干细胞促进大鼠脊髓损伤功能修复的比较研究

目的 评价大脑、骨髓和脂肪组织3种不同来源的神经干细胞对大鼠脊髓挫伤的治疗效果.方法 选取来源于同一大鼠成体中大脑、骨髓和脂肪的3个部位的组织,分离、诱导分化为不同来源的神经干细胞;应用自由落体损伤模型装置造成大鼠脊髓挫伤.将不同来源的神经干细胞分别移植入大鼠脊髓损伤部位,通过BBB评分比较修复脊髓损伤功能的效果,应用免疫荧光染色检测不同移植细胞在损伤脊髓中的存活、分布、迁移的情况.另设假手术对照组和生理盐水对照组.结果 与假手术对照组和生理盐水对照组比较,3个细胞处理组BBB评分在2～8周开始增加,9周以后更加明显,差异开始有统计学意义(P<0.05).在移植后1周和4周,细胞移植组中脑源性神经干细胞(SVZ-NSs)组Brdu/nestin+>神经元存活的数目明显高于其他2组.但差异没有统计学意义(P>0.05);到了第8周,3组均仅有少量Brdu/nestin+>细胞存活,相互之间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 植入来源于大脑、骨髓和脂肪组织的神经干细胞都可以在一定程度上提高脊髓损伤后运动功能恢复,但SVZ-NSs组的脊髓损伤大鼠运动功能恢复要比脂肪来源的神经干细胞(AD-NSs)组及骨髓来源的神经干细胞(BM-NSs)组更好.AD-NSs由于来源广泛和强有力的增殖能力,相比其他来源的神经干细胞,可能是更好的选择.     

SPIO标记神经干细胞治疗小脑萎缩大鼠的实验研究

目的探讨超顺磁性氧化铁（SPIO）标记胎鼠神经干细胞（NSC）的脑内MRI示踪效果及NSC对小脑萎缩大鼠共济运动的影响。方法将24只小脑萎缩大鼠模型随机等分为对照组、标记组、未标记组及灭活标记组,每组6只,用生理盐水、SPIO标记NSC、未标记NSC及灭活的NSC悬液分别注射于各组大鼠的小脑齿状核;进行步距行为学检测、活体MRI示踪扫描、脑组织切片普鲁士蓝染色,观察移植NSC的分布。结果与对照组、灭活标记组比较,标记组、未标记组大鼠移植后步距行为学明显改善（P〈0.05）;与灭活标记组比较,标记组MRI显示移植4周后移植区低信号影响范围较广,普鲁士蓝染色阳性细胞向周围迁移距离较远。结论MRI可显示SPIO标记的NSC在移植大鼠脑内的分布和存活情况;移植NSC能改善小脑萎缩大鼠的共济运动功能。     

胎鼠神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及凋亡抑制基因Bcl-2表达的影响

目的研究胎鼠神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后神经细胞凋亡及凋亡抑制基因Bcl-2表达的影响。方法 40只SD大鼠随机分为正常对照组(Normal组),脊髓损伤组(SCI组),神经干细胞组(NSC组),神经干细胞标记组(BrdU+NSCs组)。采用电控脊髓损伤打击装置制作模型,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Br-dU)法标记处于对数生长期的NSCs,SCI后即刻进行NSCs移植。免疫组化法观察BrdU标记NSCs的存活、迁移及凋亡抑制基因Bcl-2的表达,TUNEL法标记凋亡细胞(免疫组化及免疫荧光显色),改良Rivlin法观察大鼠后肢运动功能的恢复情况。结果 BrdU+NSCs组在损伤脊髓区域可检测到BrdU标记的阳性NSCs。BrdU+NSC组与NSC组各时间点凋亡阳性细胞数均比SCI组减少(P<0.01),Bcl-2免疫阳性细胞光密度值比SCI组明显增加(P<0.01),且Bcl-2表达高峰延长至伤后7d;移植后7d、14d、28d后肢运动功能评分较SCI组明显升高(P<0.01)。Br-dU+NSC组与NSC组之间比较无明显差异(P>0.05)。结论体外培养的胚胎大鼠NSCs可在脊髓损伤区域存活、迁移,并能通过上调Bcl-2的表达来抑制大鼠脊髓损伤后神经细胞的凋亡,从而促进大鼠瘫痪肢体功能的恢复。