Duchenne肌营养不良模型鼠基因型及肌肉病理的研究

目的研究Duchenne肌营养不良(DMD)模型鼠mdx基因型及肌肉病理改变。方法分别采用光镜、免疫荧光、EvansBlue染料、电镜等方法研究mdx小鼠与正常对照组C57/BL6小鼠腓肠肌病理改变,并检测mdx小鼠的基因型。结果经Dys-3、δ-sarcoglican抗体染色后mdx小鼠肌膜基本未见绿色荧光,正常对照组C57/BL6小鼠肌膜呈明显网状绿色荧光;荧光显微镜观察EvansBlue红色荧光染料,mdx小鼠肌纤维呈明显红色荧光,而肌膜完整的正常对照组C57/BL6小鼠肌纤维不摄取红色荧光染料。mdx模型鼠肌丝排列紊乱,方向不一,肌细胞核位于肌纤维中央,Z盘模糊,肌膜局部不连续,C57/BL6小鼠肌丝排列整齐,Z盘清晰可见。结论mdx小鼠以肌纤维变性、坏死为特征,肌细胞膜缺损是mdx小鼠主要病理改变之一。mdx小鼠dystrophin基因缺陷同时伴有dystrophin相关蛋白缺失,mdx小鼠肌肉病理为DMD进一步治疗研究奠定了基础。     

骨髓移植治疗Duchenne型肌营养不良症模型鼠后dystrophin相关蛋白表达

目的观察骨髓移植治疗Duchenne型肌营养不良症(DMD)模型鼠—mdx鼠后，β-dystroglycan和α-sarcoglycan在肌膜上的表达情况。方法以正常C57鼠作为供体，以mdx鼠作为受体进行骨髓移植，在移植后2、4、6个月分别进行mdx鼠骨骼肌的β-dystroglycan和α-sarcoglycan免疫荧光染色，计算阳性细胞的荧光积分光密度，与C57鼠及未移植的mdx鼠进行比较。结果在骨髓移植后2、4、6个月mdx鼠骨骼肌肌膜上β-dystroglycan和α-sarcoglycan的表达量均有随时间的延长逐渐增加的趋势．至移植后6个月时，二者的表达量明显高于未治疗的mdx鼠。结论骨髓移植可使mdx鼠的dystrophin相关蛋白在病损骨骼肌细胞膜上表达增加．其对维持肌膜的稳定性、促进肌肉的恢复有重要意义。     

mdx小鼠骨骼肌组织成肌、成脂、成骨基因的特异性表达**

背景：干细胞移植是治疗肌营养不良症的有效方法之一,但移植的干细胞在病理骨骼肌中成肌表达较低。 目的：通过比较mdx小鼠和C57小鼠的骨骼肌形态及成肌、成脂、成骨基因表达的差异,探讨mdx小鼠骨骼肌病理改变的可能机制。 方法：取mdx小鼠与C57小鼠的骨骼肌组织行冰冻切片,苏木精-伊红染色和Vonkossa染色观察两种小鼠肌肉组织的形态特征;提取mdx小鼠和C57小鼠骨骼肌组织总RNA,real-time PCR检测成肌、成脂、成骨相关基因的表达。 结果与结论：mdx小鼠骨骼肌有肌纤维坏死和再生,伴有轻度脂肪、纤维结缔组织增生,Vonkossa染色可见钙结节沉积,而C57小鼠的骨骼肌细胞形态清晰,核位于细胞周边。与C57小鼠比较,mdx小鼠肌肉组织成骨、成脂基因表达有不同程度的上调(P < 0.05),而成肌基因表达下调(P < 0.05)。dystrophin基因缺失及成肌基因表达下调、成骨和成脂基因上调是造成mdx小鼠肌肉组织变性坏死的原因。     

Duchenne型肌营养不良症模型小鼠神经肌肉接头特征研究

目的观察Duchenne型肌营养不良症模型小鼠骨骼肌肌膜抗肌萎缩蛋白(dystrophin)表达变化和神经肌肉接头形态,分析其可能机制。方法 C57BL/6和mdx小鼠各8只,HE染色观察肌细胞组织学形态,免疫荧光染色检测腓肠肌肌膜dystrophin蛋白表达变化和神经肌肉接头形态。结果C57BL/6小鼠腓肠肌肌细胞大小基本一致,呈多角形,胞核位于细胞周边、极少数位于肌纤维中心;肌膜均匀表达dystrophin蛋白;神经肌肉接头形态完好。Mdx小鼠腓肠肌肌细胞大小不一致,呈圆形,部分胞核趋中心化;仅少量或个别肌细胞表达dystrophin蛋白;mdx种鼠突触后膜乙酰胆碱受体断裂成小片段,突触前膜神经末梢突起增多、变细,而mdx幼鼠神经肌肉接头形态与C57BL/6小鼠基本一致;mdx小鼠神经肌肉接头数目明显减少,突触前膜和突触后膜横截面积明显减小,肌细胞间神经轴突明显变细。结论Mdx小鼠骨骼肌肌膜dystrophin蛋白缺失并非导致神经肌肉接头改变的直接因素,可能与病情进展有关。     

Duchenne肌营养不良模型鼠骨髓移植后dystrophin的表达

目的　观察Duchenne型肌营养不良模型鼠 (mdx鼠 )不同成分骨髓细胞移植后dystrophin的表达。方法　用体外培养的C57BL雄鼠的骨髓细胞、骨髓悬浮细胞、骨髓基质细胞分别经鼠尾静脉注射到放疗后的mdx鼠体内 ,动态观察受体雌性mdx鼠骨骼肌dystrophin的表达 ,并取受体mdx雌鼠血 ,用聚合酶链反应进行Sry基因检测。结果　骨髓细胞、悬浮细胞、基质细胞移植后 1～ 2个月 ,较少肌纤维表达dystrophin(<1 % ) ,3～ 4个月分别约有 7%、6 %、4 %的肌纤维表达dystrophin。Sry基因检测均扩增出受体雌鼠Y染色体上 449bp的DNA片段 ,提示供体细胞在受体内存活。结论　骨髓细胞、悬浮细胞、基质细胞分别移植到mdx鼠体内后 ,mdx鼠骨骼肌均有dystrophin的表达     

免疫组织化学dystrophin染色诊断Duchenne型肌营养不良症的研究

目的 探讨Duchenne型肌营养不良症(DMD)肌萎缩蛋白(dystrophin)表达规律和临床意义.方法 收集我院7例DMD患者作为试验组,7例非DMD患者为对照组.使用抗dystrophin杆状结构域单抗、免疫组织化学染色,观察肌膜dystrophin表达.结果 7例DMD患者肌细胞膜dystrophin阴性,7例非DMD患者dystrophin染色阳性.结论 证实DMD患者肌细胞膜dystrophin表达阴性,揭示dystrophin缺失是其发病机制,可以作为确诊DMD手段,对临床诊断DMD有实际意义.     

DMD、BMD患者骨骼肌、皮肤立毛肌肌营养不良蛋白同时欠损

目的研究、对比肌营养不良蛋白(dystrophin)在杜兴型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)和贝克型肌营养不良(Becker muscular dystrophy,BMD)患者活检骨骼肌、皮肤立毛肌中的表达。方法用肌营养不良蛋白三个不同区域的单克隆抗体(Dystrophin-N、-C、-R)对11例DMD患者,5例BMD患者和3例其他神经肌病患者同时行活检骨骼肌、皮肤免疫组织化学染色分析。结果与对照例相比,11例DMD患者抗Dystro-phin-N、-C、-R单克隆抗体免疫组织化学染色显示:骨骼肌肌纤维膜Dystrophin-N、-C、-R呈完全欠损;皮肤立毛肌Dystrophin-N、-R完全欠损,Dystrophin-C轻微表达。5例BMD患者抗Dystrophin-N、-C、-R单克隆抗体免疫组织化学染色显示:肌营养不良蛋白在骨骼肌肌纤维膜和皮肤均呈不完全欠损。结论DMD和BMD患者肌营养不良蛋白在骨骼肌肌纤维膜、皮肤立毛肌呈完全/不完全欠损,与骨骼肌活检相同,皮肤活检也是分子病理学诊断DMD、BMD简便、易行、可靠的方法。     

DMD/BMD肌细胞抗肌营养不良蛋白免疫荧光组化研究

目的:研究Duchenne/Becker型肌营养不良症(DMD/BMD)患者肌细胞中抗肌营养不良蛋白(dystrophin)的表达及其诊断意义。方法:采用免疫荧光抗体染色技术对5例DMD,2例BMD肌细胞中抗肌营养不良蛋白进行检测,以2例正常人的肌细胞作为以照。结果:对照组肌细胞膜上染色阳性,胞核及胞浆呈阴性;DMD患者肌膜完全无显色;BMD患者染色弱阳性,可见沿肌细胞膜分布的间断斑片状荧光带。结论:抗肌营养不良蛋白缺乏或表达异常是DMD/BMD基本病理基础。应用免疫荧光抗体染色法检测抗肌营养不良蛋白,有助于DMD和BMD的确诊及鉴别诊断     

Dystrophin在不同类型肌营养不良症中的变化及诊断价值

目的研究dystrophin在不同类型肌营养不良症中的变化及分型诊断价值.方法用抗dystrophin抗体对107例肌营养不良症患者肌组织标本行免疫组织化学分析.结果Duchenne型肌营养不良(DMD)患者肌细胞膜上无显色,Becker型肌营养不良(BMD)患者肌细胞膜上显色浅淡、不连续或呈斑片状.肢带型肌营养不良(LGMD)患者肌细胞膜上染色正常.结论dystrophin免疫组化染色对于年龄较小临床不易区分的DMD/BMD患者,可区分开来,以早期预测功能影响程度.该方法也有助于区分临床表现相似的成年散发BMD和LGMD患者,对于正确地进行遗传咨询具有重要意义.     

重组腺相关病毒（rAAV）介导基因SMCKA3999对Duchenne肌营养不良病理和功能的影响

目的　 研究重组腺相关病毒 (rAAV)载体介导的dystrophin小基因SMCKA3999治疗DMD模型鼠mdx ,从病理和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效。方法　以dystrophin小基因SMCK A3999为目的基因 ,将SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAVSMCKA3999,以 5× 10 10 病毒颗粒单点注射于DMD模型鼠mdx腓肠肌 ,基因治疗后 4个月及 7个月 ,采用免疫荧光、光镜组织病理、肌电图等方法 ,从形态和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效。 结果　rAAVSMCKA3999使肌膜缺失的dys trophin恢复并稳定表达持续 7个月以上 ,肌肉组织病理改变好转 ,肌病肌电图改变明显改善 ,疗效持续 4个月以上。 结论　rAAVSMCKA3999能改善mdx小鼠骨骼肌的病理及功能 ,采用rAAV介导的dystrophin小基因SMC KA3999对Duchenne肌营养不良基因治疗是有希望的治疗方法。     

针吸型肌肉活检联合免疫荧光在假肥大型肌营养不良诊断中的应用

目的 探讨应用针吸型肌肉活检结合免疫荧光染色诊断假肥大型肌营养不良症的应用价值及意义。方法 应用针吸型活检术取533例假肥大型肌营养不良症患者(415例DMD, 118例BMD)的肌组织,采用HE染色观察肌细胞形态,免疫荧光染色技术检测抗肌营养不良蛋白, 以2 例正常人的肌细胞作为对照。结果 正常人肌细胞膜上抗肌萎缩蛋白染色阳性,可见沿肌细胞膜分布完整的荧光条带; DMD 患者肌膜染色阴性,肌细胞膜完全不显色; BM D患者染色弱阳性, 可见沿肌细胞膜分布的间断斑片状荧光带。结论 应用针吸型活检术联合免疫荧光染色可以有效的检测抗肌营养不良蛋白的表达, 有助于DMD 和BMD 的确诊及鉴别诊断。     

Mdx鼠的骨骼肌细胞凋亡的实验研究

目的 研究mdx鼠体内骨骼肌细胞凋亡情况，探讨凋亡对Duchenne型肌营养不良症（DMD）的发生发展所起的作用。方法 采用流式细胞仪碘化丙啶（PI）排斥法测定不同渗透压下成肌细胞的凋亡数目，用TUNEL法测定不同鼠龄的mdx鼠骨骼肌细胞的凋亡情况。结果 mdx鼠的成肌细胞在外界渗透压变化的情况下，发生凋亡的细胞数较C57鼠明显增加，且随mdx鼠鼠龄的增长而增加。结论 抗肌萎缩蛋白（dys）的缺失引起的凋亡在DMD疾病的启动和病程进展中可能起重要作用。     

杆状病毒修饰后的脂肪干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究

目的利用经杆状病毒基因载体系统进行micro-dystrophin基因修饰后的脂肪干细胞(ADSCs)移植治疗Duchenne型肌营养不良症模型(mdx)鼠,探讨ADSCs移植治疗DMD的安全性及可行性。方法 Mdx鼠60只,分为mdx对照组(30只)和mdx移植组(30只);正常C57小鼠为C57对照组(30只)。体外分离培养小鼠ADSCs,利用杆状病毒基因载体进行micro-dystrophin基因修饰;将基因修饰后的ADSCs经尾静脉移植到mdx鼠体内。于移植后检测mdx鼠的运动功能(采用主动牵引实验和被动转棒实验)、血清CK水平、肌肉病理改变以及肌肉micro-dystrophin表达水平。结果经micro-dystrophin基因修饰的ADSCs移植后,能够重建mdx鼠的micro-dystrophin表达,一定程度上减轻并逆转肌肉的病理损害,进而降低血清CK水平,mdx鼠整体运动功能也有一定改善。结论 ADSCs治疗mdx鼠后,可部分重建模型鼠的dystrophin表达,改善肌肉的病理损害,表明ADSCs是有希望治愈DMD的方法之一。     

强直性肌营养不良症19例骨骼肌病理分析

目的探讨强直性肌营养不良症(DM)骨骼肌病变的病理学特点。方法选择19例经临床和肌电图确诊的强直性肌营养不良症患者为研究对象,骨骼肌标本采用恒冷冰冻切片和酶组织化学染色方法,在光镜下观察骨骼肌组织的病理学变化特点。结果在HE染色,19例患者的骨骼肌标本均可见不同程度的肌纤维萎缩,但变性坏死肌纤维较少见,有7例患者在肌纤维中可见到肌质块。在组织化学MGT染色中,6例患者肌纤维中可见数量不等的破碎红边纤维(RRF),肌质块在MGT染色上呈深绿色,在NADH染色中肌质块呈深蓝色,较HE染色更易识别。在ATP酶染色中,19例患者有11例存在Ⅰ、Ⅱ型肌纤维分布异常现象,其中9例以Ⅰ型纤维明显占优势,2例以Ⅱ型纤维稍占优势,8例患者肌纤维分布基本正常。结论强直性肌营养不良症的骨骼肌病理改变,除常见的肌核增多内移,肌核聚集成核袋及核链现象以外,肌质块的出现和Ⅰ、Ⅱ型肌纤维分布异常应视为强直性肌营养不良症重要的特征性病理改变,肌肉活检对本病的诊断与鉴别诊断有一定的临床意义。     

重组腺相关病毒载体介导的小基因SMCKA3999治疗Duchenne肌营养不良小鼠的研究

目的研究重组腺相关病毒载体(rAAV)介导的人抗肌萎缩蛋白(dystrophin)小基因SMCKA3999对Duchenne肌营养不良(DMD)在病理、肌电图、肌力方面的治疗作用。方法将dystrophin小基因SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAV SMCKA3999病毒,以5×109病毒颗粒多点注射于DMD模型鼠(mdx鼠)腓肠肌,基因治疗4个月后,以免疫荧光双标法检测肌膜dystrophin基因表达,采用Nicolet肌电及诱发电位仪记录mdx鼠肌电图,基因治疗5个月后以肌肉离体灌注电刺激法测定腓肠肌肌力,观察rAAV SMCKA3999对DMD动物模型鼠的治疗作用。结果rAAVSMCKA3999能有效稳定表达,并使肌膜缺失的dystrophin恢复,明显改善DMD肌电图表现,肌力恢复。结论rAAV SMCKA3999对mdx鼠治疗有效,能显著改善其肌肉功能,应用rAAV介导的dystrophin小基因SMCKA3999基因治疗是临床治疗DMD有希望的方法。     

重组腺相关病毒载体介导的小基因SMCKA3999治疗对Duchenne肌营养不良肌力的影响

目的研究重组腺相关病毒载体(rAAV)介导的人dystrophin小基因SMCKA3999对DMD病理、肌力改变的治疗作用.方法将dystrophin小基因SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAVSMCKA3999病毒,以5×109病毒颗粒多点注射于DMD模型鼠mdx腓肠肌,基因治疗4月后免疫荧光法检测肌膜dystrophin基因表达,治疗5月后采用肌肉离体灌注电刺激测定腓肠肌肌力,观察rAAVSMCKA3999对mdx鼠肌力的疗效.结果rAAVSMCKA3999有效稳定表达并使肌膜缺失的dystrophin恢复,明显改善mdx鼠肌力.结论rAAVSMCKA3999对DMD治疗有效,能显著改善mdx鼠肌肉功能,应用重组腺相关病毒载体介导的dystrophin小基因SMCKA3999是治疗DMD有希望的方法.     

骨髓干细胞移植治疗Duchenne型肌营养不良鼠的实验研究

目的　研究骨髓干细胞移植治疗Duchenne型肌营养不良鼠 (mdx鼠 )的效果。方法　取 4～ 5周龄昆明鼠骨髓干细胞 ,体外培养 3d ,静脉移植到 7Gyγ射线预处理 7～ 8周龄mdx鼠体内。临床监测受体鼠移植物抗宿主病 (GVHD)表现 ,并对移植 12周mdx鼠的运动功能、肌电生理、dystrophin蛋白表达情况进行检测。 结果　 5只 7Gy剂量放疗mdx鼠 ,静脉移植 4 8× 10 6骨髓干细胞 ,3个月后 ,肌电图指标有了部分改善 ;10 %肌纤维表达了dystrophin蛋白。结论　静脉移植同种非同系鼠骨髓干细胞治疗mdx鼠有效 ,显示骨髓干细胞移植治疗DMD有着理想的前景。     

成肌细胞治疗DMD模型-mdx鼠体内骨骼肌细胞dystrophin/utrophin蛋白的表达

目的 研究成肌细胞移植入放疗的mdx鼠后dystrophin/utrophin的表达变化.方法 培养大鼠L6骨骼肌成肌细胞株(L6 SkM),进行肌内注射于Duchenne型模型鼠-mdx鼠.移植后1个月、2个月、3个月分别取实验鼠的四肢骨骼肌,运用免疫荧光法、Western blot检测dystrophin及utrophin的表达情况.另分别取5只正常C57BL/6鼠和mdx鼠作阳性和阴性对照.结果 成肌细胞移植后1、2和3个月后mdx鼠的dystrophin表达随移植时间延长增多,而utrophin的表达随移植时间延长下降.结论 成肌细胞移植后dystrophin表达对utrophin有一定的抑制作用,两者存在互补关系.     

微量标本Western blot在诊断肢带型肌营养不良2A型中的应用

目的 探讨微量标本Western blot在诊断肢带型肌营养不良2A型中的应用.方法 对73例以肢体近端肌肉受累为首要临床表现的进行性肌营养不良患者行开放式骨骼肌活体组织检查,标本行组织化学染色以及抗dystrophin-N、C、R,α、β、γ、δ-sarcoglycan,dysferlin,caveolin-3单克隆抗体免疫组织化学染色.对其中已经除外dystrophin、sarcoglycans、dysferlin、caveolin-3蛋白异常的29例患者再行骨骼肌Western blot抗calpain-3、caveolin-3单克隆抗体免疫反应.结果 共有10例患者被确诊为肢带型肌营养不良2A型,其临床特点均为肢体近端肌无力起病,血清肌酸激酶不同程度升高,肌电图呈肌源性改变.组织化学染色见肌纤维大小不一,可见不同程度肌纤维变性、坏死和再生,结缔组织增生,6例见分叶状肌纤维;免疫组织化学染色见肌纤维中dystrophin、sarcoglycan、dysferlin、caveolin-3蛋白均正常表达.Western blot发现该10例患者相对分子质量94 000条带(calpain-3)与Duchenne/Becker型肌营养不良对照相比,呈完全(8例)或部分(2例)缺失;30 000区域附加条带均呈弱表达,22 000区域条带(caveolin-3)均正常表达.结论 骨骼肌微量标本Western blot是诊断LGMD2A的有效方法,适用于临床LGMD的分型诊断.     

神经肌肉病患者肌肉中utrophin和dystrophin蛋白表达的相关性

目的探讨utrophin和dystrophin蛋白在神经肌肉病患者肌肉中的表达及其相关性。方法采用免疫荧光方法观察26例共8种神经肌肉疾病患者及2名无神经肌肉疾病者的正常肌肉活检标本冰冻切片utrophin和dystrophin蛋白的表达。结果dystrophin蛋白在Duehenne型肌营养不良（DMD）患者显示为大部分肌纤维荧光圈带缺失、荧光圈带亮度减弱或荧光圈带呈不连续状；在非DMD的肌营养不良、脂肪累积性肌病、强直性肌营养不良、神经源性肌萎缩、多发性肌炎、线粒体脑肌病、肌源性肌萎缩患者肌肉膜上呈现一圈完整的强荧光圈带；在对照组肌肉膜上呈现一圈完整的强荧光圈带。utrophin蛋白在dystrophin蛋白重度减少的DMD患者少部分肌纤维肌膜上呈现不连续的荧光圈带，但强度较弱；在dystrophin蛋白中度减少的DMD患者、非DMD的肌营养不良及其他6种神经肌肉病患者肌肉膜上不显示荧光；在对照组肌肉膜上不显示荧光。结论DMD患者肌肉的dystrophin蛋白表达重度减少的同时，出现utrophin蛋白的表达；而包括DMD患者dystrophin蛋白中度减少、非DMD的肌营养不良在内的其他神经肌肉病患者肌肉的dystrophin蛋白正常表达时，其utrophin未出现表达。