Micro-dsytrophin基因修饰的骨髓间充质干细胞移植后mdx鼠腓肠肌病理改变及micro-dystrophin的表达

目的探讨自体骨髓间充质干细胞(mMSCs)携带micro-dystrophin基因在移植鼠体内分化为有功能肌细胞的可能性。方法采用脂质体介导micro-dystrophin基因转染mdx小鼠mMSCs,通过尾静脉注射移植治疗mdx鼠,在移植后不同时间点对腓肠肌进行HE染色、计数核中心移位纤维(CNF)比例,并用免疫荧光法检测micro-dystrophin的表达。结果移植后各时间点腓肠肌病理改变较对照组有所改善,CNF比例下降,差异有统计学意义,部分肌细胞膜能表达micro-dystrophin蛋白,并随移植时间延长micro-dystrophin阳性肌纤维比例增加,分别达到3%(8周时)、6%(12周时)和8%(16周时)。结论自体mMSCs可携带外源性micro-dys-trophin基因在受体鼠体内分化为micro-dystrophin阳性肌细胞。     

Duchenne肌营养不良模型鼠基因型及肌肉病理的研究

目的研究Duchenne肌营养不良(DMD)模型鼠mdx基因型及肌肉病理改变。方法分别采用光镜、免疫荧光、EvansBlue染料、电镜等方法研究mdx小鼠与正常对照组C57/BL6小鼠腓肠肌病理改变,并检测mdx小鼠的基因型。结果经Dys-3、δ-sarcoglican抗体染色后mdx小鼠肌膜基本未见绿色荧光,正常对照组C57/BL6小鼠肌膜呈明显网状绿色荧光;荧光显微镜观察EvansBlue红色荧光染料,mdx小鼠肌纤维呈明显红色荧光,而肌膜完整的正常对照组C57/BL6小鼠肌纤维不摄取红色荧光染料。mdx模型鼠肌丝排列紊乱,方向不一,肌细胞核位于肌纤维中央,Z盘模糊,肌膜局部不连续,C57/BL6小鼠肌丝排列整齐,Z盘清晰可见。结论mdx小鼠以肌纤维变性、坏死为特征,肌细胞膜缺损是mdx小鼠主要病理改变之一。mdx小鼠dystrophin基因缺陷同时伴有dystrophin相关蛋白缺失,mdx小鼠肌肉病理为DMD进一步治疗研究奠定了基础。     

骨髓移植治疗Duchenne型肌营养不良症模型鼠后dystrophin相关蛋白表达

目的观察骨髓移植治疗Duchenne型肌营养不良症(DMD)模型鼠—mdx鼠后，β-dystroglycan和α-sarcoglycan在肌膜上的表达情况。方法以正常C57鼠作为供体，以mdx鼠作为受体进行骨髓移植，在移植后2、4、6个月分别进行mdx鼠骨骼肌的β-dystroglycan和α-sarcoglycan免疫荧光染色，计算阳性细胞的荧光积分光密度，与C57鼠及未移植的mdx鼠进行比较。结果在骨髓移植后2、4、6个月mdx鼠骨骼肌肌膜上β-dystroglycan和α-sarcoglycan的表达量均有随时间的延长逐渐增加的趋势．至移植后6个月时，二者的表达量明显高于未治疗的mdx鼠。结论骨髓移植可使mdx鼠的dystrophin相关蛋白在病损骨骼肌细胞膜上表达增加．其对维持肌膜的稳定性、促进肌肉的恢复有重要意义。     

重组腺相关病毒载体介导的小基因SMCKA3999治疗对Duchenne肌营养不良肌力的影响

目的研究重组腺相关病毒载体(rAAV)介导的人dystrophin小基因SMCKA3999对DMD病理、肌力改变的治疗作用.方法将dystrophin小基因SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAVSMCKA3999病毒,以5×109病毒颗粒多点注射于DMD模型鼠mdx腓肠肌,基因治疗4月后免疫荧光法检测肌膜dystrophin基因表达,治疗5月后采用肌肉离体灌注电刺激测定腓肠肌肌力,观察rAAVSMCKA3999对mdx鼠肌力的疗效.结果rAAVSMCKA3999有效稳定表达并使肌膜缺失的dystrophin恢复,明显改善mdx鼠肌力.结论rAAVSMCKA3999对DMD治疗有效,能显著改善mdx鼠肌肉功能,应用重组腺相关病毒载体介导的dystrophin小基因SMCKA3999是治疗DMD有希望的方法.     

mdx小鼠骨骼肌组织成肌、成脂、成骨基因的特异性表达**

背景：干细胞移植是治疗肌营养不良症的有效方法之一,但移植的干细胞在病理骨骼肌中成肌表达较低。 目的：通过比较mdx小鼠和C57小鼠的骨骼肌形态及成肌、成脂、成骨基因表达的差异,探讨mdx小鼠骨骼肌病理改变的可能机制。 方法：取mdx小鼠与C57小鼠的骨骼肌组织行冰冻切片,苏木精-伊红染色和Vonkossa染色观察两种小鼠肌肉组织的形态特征;提取mdx小鼠和C57小鼠骨骼肌组织总RNA,real-time PCR检测成肌、成脂、成骨相关基因的表达。 结果与结论：mdx小鼠骨骼肌有肌纤维坏死和再生,伴有轻度脂肪、纤维结缔组织增生,Vonkossa染色可见钙结节沉积,而C57小鼠的骨骼肌细胞形态清晰,核位于细胞周边。与C57小鼠比较,mdx小鼠肌肉组织成骨、成脂基因表达有不同程度的上调(P < 0.05),而成肌基因表达下调(P < 0.05)。dystrophin基因缺失及成肌基因表达下调、成骨和成脂基因上调是造成mdx小鼠肌肉组织变性坏死的原因。     

肌营养不良症模型鼠骨骼肌的组织病理学研究

目的　比较肌营养不良症模型 (mdx)鼠、C57鼠和Duchenne型肌营养不良症 (DMD)患者骨骼肌的组织病理学改变 ,以及dystrophin在肌细胞膜上的分布。方法　取mdx鼠、C57鼠和DMD患者骨骼肌作常规HE染色 ,比较其组织学改变 ;同时对mdx鼠、C57鼠骨骼肌作dystrophin的免疫组化染色 ,比较dystrophin在肌细胞膜上的分布。结果　mdx鼠骨骼肌肌纤维大小不等 ,轮廓变圆 ,肌间隙增宽 ,少量脂肪、结缔组织增生 ,细胞核中心移位增多 ,部分肌纤维变性坏死 ,而DMD患者骨骼肌的改变和mdx鼠基本一致。mdx鼠肌细胞膜缺乏完整环行棕色条带 ,而C57鼠则呈一完整环行棕色条带 ,提示mdx鼠dystrophin蛋白缺乏。结论　mdx鼠有类似于DMD患者的骨骼肌组织病理学改变     

骨髓干细胞移植治疗Duchenne型肌营养不良鼠的实验研究

目的　研究骨髓干细胞移植治疗Duchenne型肌营养不良鼠 (mdx鼠 )的效果。方法　取 4～ 5周龄昆明鼠骨髓干细胞 ,体外培养 3d ,静脉移植到 7Gyγ射线预处理 7～ 8周龄mdx鼠体内。临床监测受体鼠移植物抗宿主病 (GVHD)表现 ,并对移植 12周mdx鼠的运动功能、肌电生理、dystrophin蛋白表达情况进行检测。 结果　 5只 7Gy剂量放疗mdx鼠 ,静脉移植 4 8× 10 6骨髓干细胞 ,3个月后 ,肌电图指标有了部分改善 ;10 %肌纤维表达了dystrophin蛋白。结论　静脉移植同种非同系鼠骨髓干细胞治疗mdx鼠有效 ,显示骨髓干细胞移植治疗DMD有着理想的前景。     

Duchenne型肌营养不良症模型小鼠神经肌肉接头特征研究

目的观察Duchenne型肌营养不良症模型小鼠骨骼肌肌膜抗肌萎缩蛋白(dystrophin)表达变化和神经肌肉接头形态,分析其可能机制。方法 C57BL/6和mdx小鼠各8只,HE染色观察肌细胞组织学形态,免疫荧光染色检测腓肠肌肌膜dystrophin蛋白表达变化和神经肌肉接头形态。结果C57BL/6小鼠腓肠肌肌细胞大小基本一致,呈多角形,胞核位于细胞周边、极少数位于肌纤维中心;肌膜均匀表达dystrophin蛋白;神经肌肉接头形态完好。Mdx小鼠腓肠肌肌细胞大小不一致,呈圆形,部分胞核趋中心化;仅少量或个别肌细胞表达dystrophin蛋白;mdx种鼠突触后膜乙酰胆碱受体断裂成小片段,突触前膜神经末梢突起增多、变细,而mdx幼鼠神经肌肉接头形态与C57BL/6小鼠基本一致;mdx小鼠神经肌肉接头数目明显减少,突触前膜和突触后膜横截面积明显减小,肌细胞间神经轴突明显变细。结论Mdx小鼠骨骼肌肌膜dystrophin蛋白缺失并非导致神经肌肉接头改变的直接因素,可能与病情进展有关。     

重组腺相关病毒载体介导的小基因SMCKA3999治疗Duchenne肌营养不良小鼠的研究

目的研究重组腺相关病毒载体(rAAV)介导的人抗肌萎缩蛋白(dystrophin)小基因SMCKA3999对Duchenne肌营养不良(DMD)在病理、肌电图、肌力方面的治疗作用。方法将dystrophin小基因SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAV SMCKA3999病毒,以5×109病毒颗粒多点注射于DMD模型鼠(mdx鼠)腓肠肌,基因治疗4个月后,以免疫荧光双标法检测肌膜dystrophin基因表达,采用Nicolet肌电及诱发电位仪记录mdx鼠肌电图,基因治疗5个月后以肌肉离体灌注电刺激法测定腓肠肌肌力,观察rAAV SMCKA3999对DMD动物模型鼠的治疗作用。结果rAAVSMCKA3999能有效稳定表达,并使肌膜缺失的dystrophin恢复,明显改善DMD肌电图表现,肌力恢复。结论rAAV SMCKA3999对mdx鼠治疗有效,能显著改善其肌肉功能,应用rAAV介导的dystrophin小基因SMCKA3999基因治疗是临床治疗DMD有希望的方法。     

重组腺相关病毒（rAAV）介导基因SMCKA3999对Duchenne肌营养不良病理和功能的影响

目的　 研究重组腺相关病毒 (rAAV)载体介导的dystrophin小基因SMCKA3999治疗DMD模型鼠mdx ,从病理和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效。方法　以dystrophin小基因SMCK A3999为目的基因 ,将SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAVSMCKA3999,以 5× 10 10 病毒颗粒单点注射于DMD模型鼠mdx腓肠肌 ,基因治疗后 4个月及 7个月 ,采用免疫荧光、光镜组织病理、肌电图等方法 ,从形态和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效。 结果　rAAVSMCKA3999使肌膜缺失的dys trophin恢复并稳定表达持续 7个月以上 ,肌肉组织病理改变好转 ,肌病肌电图改变明显改善 ,疗效持续 4个月以上。 结论　rAAVSMCKA3999能改善mdx小鼠骨骼肌的病理及功能 ,采用rAAV介导的dystrophin小基因SMC KA3999对Duchenne肌营养不良基因治疗是有希望的治疗方法。     

Duchenne 型肌营养不良模型鼠骨髓移植后的行为学观察

目的确立Duchenne型肌营养不良模型鼠(mdx鼠)骨髓移植前的有效放疗剂量，观察不同数量、不同成分的骨髓细胞对受体mdx鼠造血功能的重建和保护作用。方法用不同数量的体外培养6～8周C57BL/6雄鼠的骨髓细胞、骨髓基质细胞、骨髓悬浮细胞，经鼠尾静脉注射给不同剂量放疗后的mdx鼠，观察受体鼠的存活率及行为学改变。结果10只mdx鼠移植前3天12Gyγ射线照射，在移植后7天内全部死亡，且注射细胞数较多者，存活时间相对较长，而8Gyγ射线照射的6只mdx鼠，移植后30天5例存活，1例死亡。结论本实验条件下，移植前8Gyγ射线放疗较合理，在有效剂量放疗破坏受体骨髓造血系统后，移植同系鼠的骨髓细胞、基质细胞、悬浮细胞，mdx鼠均能耐受并存活，且以移植细胞数量为1×10     

Mdx小鼠骨骼肌纤维化及Spp1基因表达

目的通过观察Duchenne型肌营养不良的模型鼠mdx小鼠骨骼肌中纤维化情况,研究Spp1基因在mdx小鼠及其对照鼠中不同时期的表达,探讨在mdx小鼠中Spp1与肌纤维化的关系。方法选取雄性C57BL/10Sc Sn-Dmdmdx/JNju鼠为实验组,雄性C57BL/6Sc Sn小鼠为对照组,根据年龄分为2w组、4w组、8w组、12w组。每组选取6只,3只用于冰冻切片的苏木精-伊红染色及马松(masson)染色,3只用于基因芯片及q RT-PCR。结果 2w及4w时mdx小鼠无明显结缔组织增生,8w时,mdx小鼠可见轻度结缔组织增生;12w时,mdx小鼠结缔组织增生程度较8w稍加重,仍为小片状区域的纤维化,对照组小鼠不同时期均未见纤维化;mdx小鼠2w与12w股四头肌基因芯片表达谱对比,其中Spp1基因在mdx小鼠2w与12w相比fold-change值为-15.1354,变化明显;Spp1在mdx小鼠股四头肌不同时期表达量比较:8w组较4w组明显升高,12w组较8w组表达量下降,但仍高于4w组,8w组与12w组Spp1表达量较同期对照组明显升高,差异具有统计学意义。结论 mdx小鼠早期(2w~4w)肌纤维化表现不明显,8w时骨骼肌内可见少量结缔组织增生,随后缓慢进展。2 Spp1基因在mdx小鼠成熟期(8w~12w)表达量明显增加,推测其在mdx小鼠肌纤维化中发挥一定作用。     

骨髓基质干细胞在肌营养不良模型鼠中的分布及移植途径对分布的影响

目的研究干细胞在mdx鼠体内较长时间的动态分布以及移植途径对它的影响。方法用3H-TdR掺入标记骨髓基质干细胞,用4×106个/只静脉及腹腔移植放疗mdx鼠各30只,在24h、48h、2周、1个月、2个月、4个月时间点处死小鼠,取血、心、肝、脾、肺、肾、肌、脑、骨髓消化测定放射计数,计算%ID/g值。结果①静脉移植的mdx鼠脑、骨髓在2周才达到它自身的最高水平,心肌、骨骼肌4个月时达到高峰;而每个时间点各器官含量相比早期基本是肺、肝、骨髓分布多,心肌、肌肉2个月后仅次于骨髓。②腹腔移植mdx鼠血、肺、肾、肝、脾脏、脑到达它各自的高峰比静脉注射均有不同时间延迟,早期还是在骨髓、肝、肺分布多,肌肉2个月后仅次于骨髓。③心、肌肉、脑、骨髓含量静脉移植比腹腔移植高,均具有显著的统计学意义(P<0.01)。结论干细胞移植mdx鼠后4个月达高峰,移植途径对干细胞的分布有影响,3H-TdR能长时间动态观察干细胞分布。     

成肌细胞治疗DMD模型-mdx鼠体内骨骼肌细胞dystrophin/utrophin蛋白的表达

目的 研究成肌细胞移植入放疗的mdx鼠后dystrophin/utrophin的表达变化.方法 培养大鼠L6骨骼肌成肌细胞株(L6 SkM),进行肌内注射于Duchenne型模型鼠-mdx鼠.移植后1个月、2个月、3个月分别取实验鼠的四肢骨骼肌,运用免疫荧光法、Western blot检测dystrophin及utrophin的表达情况.另分别取5只正常C57BL/6鼠和mdx鼠作阳性和阴性对照.结果 成肌细胞移植后1、2和3个月后mdx鼠的dystrophin表达随移植时间延长增多,而utrophin的表达随移植时间延长下降.结论 成肌细胞移植后dystrophin表达对utrophin有一定的抑制作用,两者存在互补关系.     

Duchenne肌营养不良模型鼠骨髓移植后dystrophin的表达

目的　观察Duchenne型肌营养不良模型鼠 (mdx鼠 )不同成分骨髓细胞移植后dystrophin的表达。方法　用体外培养的C57BL雄鼠的骨髓细胞、骨髓悬浮细胞、骨髓基质细胞分别经鼠尾静脉注射到放疗后的mdx鼠体内 ,动态观察受体雌性mdx鼠骨骼肌dystrophin的表达 ,并取受体mdx雌鼠血 ,用聚合酶链反应进行Sry基因检测。结果　骨髓细胞、悬浮细胞、基质细胞移植后 1～ 2个月 ,较少肌纤维表达dystrophin(<1 % ) ,3～ 4个月分别约有 7%、6 %、4 %的肌纤维表达dystrophin。Sry基因检测均扩增出受体雌鼠Y染色体上 449bp的DNA片段 ,提示供体细胞在受体内存活。结论　骨髓细胞、悬浮细胞、基质细胞分别移植到mdx鼠体内后 ,mdx鼠骨骼肌均有dystrophin的表达     

重组腺相关病毒介导的Dystrophin小基因载体构建及在mdx鼠中表达

目的 :研究重组腺相关病毒载体 (rAAV)介导的人Dystrophin小基因 (SMCKA3 999)载体构建及在DMD模型鼠 (mdx鼠 )的表达。方法 :将SMCKA3 999质粒 ,包装质粒pXX2、腺病毒成分辅助质粒pXX6共转染 2 93细胞 ,包装重组腺相关病毒载体介导的SMCKA3 999基因 (rAAVSMCKA3 999) ,以斑点杂交法测定病毒滴度 ,将rAAVSMCKA3 999单点注射到mdx鼠腓肠肌 ,于注射后 7个月取肌肉提取蛋白质行Westernblot检测。结果 :经三质粒共转染法构建的rAAVSMCKA3 999病毒滴度为 5 0× 10 10 ,在mdx鼠骨骼肌表达持续 7个月以上。结论 :构建的rAAVSMCKA3 999载体为进一步DMD基因治疗研究奠定了基础。     

Mdx小鼠骨骼肌中炎症反应和mpeg1的表达

目的探讨mdx小鼠不同时期骨骼肌的炎性病理改变,观察mpeg1在mdx小鼠及对照鼠中的表达。方法选取雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju鼠为实验组,对照组为雄性C57BL/6Sc Sn小鼠,根据年龄分为2 w、4 w、8 w、12 w 4个亚组。通过HE染色、MGT染色、ACP染色观察骨骼肌光镜下的形态学改变,总结mdx小鼠骨骼肌炎性病理变化。通过RNA提取,基因芯片的检测及mpegl的qRT-PCR检测,观察mpeg1的表达情况。结果常规组织染色中,2 w的mdx小鼠肌肉偶见高度浓染的肌纤维,未见肌细胞坏死,炎症细胞浸润,4 w可见巨噬细胞吞噬现象散在分布,8 w时炎细胞浸润灶融合成片,12 w时炎性病灶面积减小;利用基因芯片技术筛选出mdx小鼠中有关炎症反应的基因30余个,结果显示与2 w相比,炎症反应相关基因表达量均增加,在8 w时达到峰值,12 w有所下降,但较2 w时仍有升高;qRT-PCR结果显示从4 w开始,mdx小鼠中mpeg1的含量逐渐增加,8 w时含量最高。结论 (1)炎症反应参与mdx小鼠疾病的发生发展:从2 w开始出现,8 w达到高峰,12 w趋于平稳;(2)Mpeg1在mdx小鼠炎症反应中发挥了一定的作用。     

不同放疗剂量对肌营养不良鼠骨髓干细胞移植的影响

目的　使用不同剂量γ射线对Duchenne型肌营养不良鼠 (mdx鼠 )照射 ,研究骨髓干细胞移植后mdx鼠缺失蛋白表达的情况。方法　将 18只 7～ 8周mdx鼠随机平均分为A、B、C 3组 ,依次给予 7Gy、7.5Gy、8Gyγ射线预处理 ;3天后行骨髓干细胞移植。移植骨髓干细胞取自 4～ 5周的C5 7BL/6鼠 ,体外培养 3d ,按 1 2× 10 7个细胞 /每只剂量移植给 3组预处理后的mdx鼠。连续观察受体鼠的移植物抗宿主病 (GVHD)程度 ;移植 12周后 ,检测受体鼠体内抗肌萎缩蛋白表达情况。结果　C组GVHD反应较明显 ;A、B、C 3组的股骨肌肌纤维dystrophin蛋白表达率分别为 8%、9%和 13 %。各组间缺失蛋白表达率有显著差异。结论　对 7～ 8周mdx鼠 ,给予不同剂量的γ射线预处理 ,骨髓干细胞移植后 ,8Gyγ射线表达最多 ,7Gy射线照射表达量最少 ;但 8Gyγ射线照射GVHD反应较明显。     

mdx小鼠与C57小鼠骨髓基质细胞体外分化能力的比较**

背景：肌营养不良症是一种渐进性致死性X连锁隐性遗传性肌肉疾病,目前无特效治疗。肌营养不良症模型鼠(mdx小鼠)的骨髓基质细胞增殖及定向分化能力是否正常,自身骨髓移植是否合适还有待研究。 目的：观察mdx小鼠骨髓基质细胞体外培养时的增殖及多向分化能力。 方法：取mdx小鼠与C57小鼠胫股骨骨髓基质细胞体外培养,经吉姆萨染色后观察其形成成纤维细胞集落形成单位的能力;通过不同诱导液使骨髓基质细胞定向分化为成骨、成脂、成肌细胞,观察其形态学特性;并分别用Von kossa 染色、油红O染色、免疫荧光检测desmin阳性细胞对已分化细胞进行鉴定和分化率比较;培养1周时,提取分化细胞总RNA,反转录后,用real-time PCR检测各分化细胞相关基因表达。 结果与结论：mdx小鼠骨髓基质细胞形成的成纤维细胞集落形成单位数目和体积均小于C57小鼠。其成骨、成肌分化的效率均明显低于C57小鼠(P < 0.01),两种小鼠的骨髓基质细胞成脂分化效率差异无显著性(P > 0.05)。real-time PCR检测结果显示,与C57小鼠相比,mdx小鼠的骨髓基质细胞成骨、成肌基因表达均有不同程度下降,而成脂基因表达无明显差异。结果提示,mdx小鼠的骨髓基质细胞体外培养时的增殖及定向分化能力较C57小鼠下降,与Dystrophin 基因缺失有关,mdx小鼠自体骨髓移植将会受限。     

骨髓移植治疗DMD的研究新进展

Duchenne型肌营养不良症 (DMD)是一种致死的X -性连锁隐性遗传病 ,目前尚无有效的治疗方法。通过对肌营养不良动物模型鼠 (mdx鼠 )进行骨髓移植 ,即将同种异体骨髓或造血干细胞以及一种新的肌源性干细胞静脉注入宿主体内 ,供体衍生物掺入宿主肌组织 ,在受累肌肉部分恢复了dys trophin的表达 ,提示骨髓移植可能成为治疗DMD及其它肌萎缩症的一种新途径。