重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及大鼠胚胎神经干细胞转染的研究

目的 探讨携带GDNF基因的神经干细胞表达载体的构建方法。方法 采用RT-PCR方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出该基因的全序列cDNA，并克隆到增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-C1中，经酶切鉴定及测序分析对重组质粒pEGFP-GDNF作进一步鉴定。采用阳离子脂质体将重组质粒pEGFP-GDNF转染至鼠胚胎神经干细胞。结果 大鼠GD-NF cDNA已正确地克隆到真核表达载体pEGFP-C1中，而构建成重组大鼠质粒pEGFP-GDNF，GDNF基因在细胞中可稳定表达。结论 神经干细胞可直接作为基因靶细胞，能被GDNF真核细胞表达载体pEGFP-GDNF有效的感染。     

含GDNF基因真核载体的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建含GDNF基因真核表达载体,并分析其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达。方法从SD大鼠脑中提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增GDNF基因,测序鉴定后将GDNF基因克隆入p CDNA3.1中,构建真核表达载体p CDNA3.1-GDNF;原代培养大鼠间充质干细胞,以脂质体介导法将构建好的真核表达载体p CDNA3.1-GDNF转染至间充质干细胞;RT-PCR、细胞免疫荧光、Western blot检测GDNF在间充质干细胞中的表达。结果扩增的大鼠GDNF基因序列与Gen Bbank的参考序列完全一致,GDNF基因已经正确克隆到真核表达载体p CDNA3.1中;转染骨髓间充质干细胞4 h后,GDNF的mRNA和蛋白能在细胞中正确表达。结论 p CDNA3.1-GDNF真核表达载体构建成功,并能在大鼠间充质干细胞中正确表达,这为下一步研究携带GDNF的骨髓间充质干细胞治疗癫痫奠定了实验基础。     

pEGFPN1-GDNF真核表达载体的构建及其表达

目的 构建人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因真核表达载体并观察其在COS-7细胞内的表达.方法 应用RT-PCR从U251细胞总RNA中扩增GDNF cDNA,将其克隆至真核表达载体pEGFPN1,经酶切鉴定及序列分析后,以Fugene HD介导转染COS-7细胞,应用免疫细胞化学和Western blot鉴定其在细胞内的表达.结果 RT-PCR产物为650bp的特异片段,重组质粒pEGFPN1-GDNF经双酶切产生650bp和4.7kb的片段,测序分析结果与文献报道结果完全一致.将其转染COS-7细胞后,免疫细胞化学、Western blot结果表明GDNF蛋白能在COS-7细胞中正确表达.结论 成功构建了pEGFPN1-GDNF真核表达载体,为进一步开展帕金森病的基因治疗研究奠定了基础.     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2) 是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。 目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。 设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07/2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。 材料：pcDNA3.1(+)载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。 方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录-聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM-T- hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T- hBMP-2质粒和pcDNA3.1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3.1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP-2的表达。 主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA 反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM-T-hBMP-2 和pcDNA3.1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。 结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1.2 kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3.1- hBMP-2构建正确;该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及真核细胞转染

目的　构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因的真核细胞表达载体,为应用GDNF进行如帕金森综合征之类的神经元退化性疾病的基因治疗打基础。方法　采用RT- PCR方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出该基因的c DNA序列,并克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体p EGFP- C1中,对重组质粒p EGFP- GDNF进一步鉴定。采用电转及阳离子脂质体将重组质粒p EGFP- GDNF转染至SH- SY5 Y细胞。结果　大鼠GDNF c DNA已正确地克隆到真核表达载体p EGFP- C1中,而构建成重组大鼠质粒p EGFP-GDNF。GDNF基因可稳定表达在细胞中。结论　真核细胞表达载体p EGFP- GDNF以及表达GDNF工程细胞SH-SY5 Y的成功构建,为进一步开展GDNF基因治疗PD等中枢神经系统疾病奠定了基础。     

pcDNA3.1(+)GDNF真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建pcDNA3.1( )胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达。方法：将GDNF逆转录聚合酶链 式反应（RT－PCR）产物克隆至pcDNA3.1( ）真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以FuGene6介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及春表达蛋白折生物学活性。结果：RT－PCR产物为640bp特异性片段,pcDNA3.1( )GDNF重组体经酶切后分别出现640bp和300bp片段,测序分析与文献报道结果完全一致,表明重组pcDNA3.1( )GDNF表达质粒克隆成功,可见pcDNA3.1( )GDNF质粒在真核动物细胞中得到表达,GDNF蛋白能刺激含多巴胺的细胞生长,表明重组质粒能在真核动物细胞中出具有活性的GDNF蛋白。结论以FuGene6介导pcDNA3.1( )GDNF质粒传染真核细胞为基因治疗帕金森病奠定了一定基础。     

人CD80基因转染U251瘤株细胞的实验研究

目的 构建编码人CD80基因的真核表达载体，转染神经胶质瘤细胞株U251，并检测CD80基因在U251中的表达。方法 PCR法扩增人类CD80基因的开放阅读框（ORF）全长，酶切法连接入真核表达载体pcDNA3．1。构建为重组质粒pcDNA3．1／CD80，双酶切及测序鉴定。利用脂质体法将pcDNA3．1／CD80转染U251细胞株，应用RT-PCR、流式细胞术、免疫细胞化学法、Western blotting等技术从细胞及分子水平检测人CD80分子在U251细胞表面的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3．1／CD80双酶切可切出约900bp目的片段。测序结果和NCBI检索CD80序列吻合；RT-PCR检测到pcDNA3．1／CD80转染后的U251细胞中CD80mRNA表达；荧光显微镜下观察可见大量免疫荧光标记的绿色荧光细胞，检测转染效率约31．8％；Western blotting可检测到约60kD蛋白条带。结论 本实验成功构建了pcDNA3．1／CD80真核表达载体，并实现了在神经胶质瘤细胞株U251中的表达，为后续研究CD80的表达对肿瘤细胞免疫原性的影响以及制备神经胶质瘤肿瘤疫苗提供了重要的实验材料。     

纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达☆

目的：构建增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced-green fluorescent protein，EGFP）标记的人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor, hIGF-1）真核表达载体，转染至兔骨髓间充质干细胞，为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞。 方法：实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成。根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物，从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1，亚克隆至pMD-T18载体，测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞，通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达。 结果：成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达。 结论：新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法，经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择。     

pEGFP-ING4真核表达载体的构建及在人脐静脉内皮细胞中的表达

目的构建携带生长抑制因子4(ING4)基因的真核表达载体pEGFP-ING4并转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC),为进一步研究ING4对胶质瘤血管生成影响提供基础。方法提取人胎盘细胞中总RNA,RT-PCR扩增ING4并克隆至pEGFP-C2载体,酶切电泳鉴定出阳性克隆送测序,利用靶向转染试剂jetPEI-HUVEC转染HUVEC,通过免疫组化检测转染细胞中ING4的表达。结果 成功扩增ING4基因,基因全长747 bp。重组质粒pEGFP-ING4的酶切鉴定及测序结果均证明ING4基因成功克隆到真核表达载体中。酶切片段电泳结果表明:目的条带与ING4的开放读码框大小相符;测序结果和ING4的开放读码框比对相似性为100%。转染重组质粒后的HUVEC中ING4蛋白表达水平增强。结论本实验成功构建携带ING4基因的真核表达载体pEGFP-ING4,并可在HUVEC中获得ING4蛋白的增强表达。     

脑源性神经营养因子(rBDNF)转基因小鼠载体的构建和体外表达

目的构建大鼠脑源性神经营养因子(rBDNF)的条件性转基因小鼠载体,鉴定其在体外细胞系中的表达。方法用PCR方法扩增rBDNF片断,插入pNAO载体(lox-Stop-lox-IRES-EGFP),构建成rBDNF条件性基因载体(lox-Stop-lox-rBDNF-IRES-EGFP),使用Fugene 6转染试剂,将其同Cre重组酶表达质粒pGK-Cre共同导入HEK-293细胞系中,通过荧光显微镜观察、PCR及ELISA方法确定Cre-lox同源重组。结果经酶切和测序鉴定,rBDNF条件性基因载体构建成功。共转染后的HEK-293细胞中,观察到绿色荧光蛋白(EGFP)的强荧光表达;细胞基因组DNA中检测到Cre-lox基因重组;对rBDNF定量检测的ELISA结果显示,细胞内有大量的rBDNF释放到细胞外。结论rBDNF条件性基因载体构建成功,在体外细胞系中,检测到rBDNF及EGFP强表达,为转基因显微注射打下基础。     

Expression of transcription factor Oct-4 and other embryonic genes in CD133 positive cells from human umbilical cord blood

A significant number of hematopoietic stem/progenitor cells (HSPC) in human umbilical cord blood could serve as a reservoir for the placental vasculature, yet, their morphological and functional features are not completely understood. Here, we describe the characterization of purified CD133(+) progenitor cells from umbilical cord blood, a subset of CD34(+) hematopoietic progenitors that were grown in proliferation medium containing Flt3-ligand, thrombopoietin and stem cell factor. Following isolation and enrichment of the CD133(+) cells by immunomagnetic cell sorting, they remained non-adherent for up to 40 days in culture and expressed different pluripotency markers including Sox-1, Sox-2, FGF-4, Rex-1 and Oct-4.Oct-4 expression was confirmed by laser-assisted single cell picking with subsequent quantitative real-time RT-PCR. The expression of Oct-4 indicates a pluripotent phenotype of CD133(+) cells and appears to be of functional relevance: After three weeks in endothelial differentiation medium, suspended cells became adherent, developed an endothelial cell-like morphology, bound fluoresceine isothiocyanate-labeled Ulex europaeus agglutinin-1, took up acetylated Di-LDL, and expressed other endothelial markers such as PECAM-1 or VEGFR-2. Concomitantly, Oct-4 expression was significantly reduced. Moreover, following treatment with retinoic acid, CD133(+) cells exhibited neural morphology associated with the expression of beta-III-tubulin. CD133(+) cells were found to express the luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin (LH/hCG) receptor, detected by RT-PCR and immunocytochemistry. The recombinant human chorionic gonadotropin induced proliferation of the CD133(+) cells in a dose-specific manner. Our results indicate that CD133(+) HSPC from umbilical cord blood may have a greater differentiation potential than previously recognized and give rise to proliferative endothelial cells participating in placental vasculogenesis.     

脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞的定向诱导*

背景：骨髓间充质干细胞存在取材困难、供体有限、可能病毒污染等缺陷,限制了其临床应用,而目前已证实间充质干细胞不仅存在于骨髓,还存在于外周血,尤其是脐血。 目的：探讨人脐血间充质干细胞的体外分离、扩增纯化方法及其神经分化潜能。 设计、时间及地点：应用研究,体外细胞学观察,于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成。 材料：新鲜脐血来自南方医科大学南方医院足月剖宫产新生儿脐带,取脐血前征得新生儿监护人的知情同意。 方法：无菌条件下收集脐血,去除红细胞,采用低糖DMEM/F12进行培养;取扩增第3或4代的人脐血间充质干细胞,培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和全反式维甲酸。 主要观察指标：用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志;用免疫组化法检测诱导后细胞神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白表达。 结果：人脐血间充质干细胞强表达CD13、CD 29、CD44和CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD33和CD45。培养基添加神经营养因子诱导后的细胞呈现典型的神经元样表型,诱导后高表达巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白。 结论：人脐血富含间充质干细胞,分离培养后于培养基添加神经营养因子能够分化为神经元样细胞。     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰CD34+细胞静脉移植治疗高血压大鼠脑梗死

背景：近年来,已有实验证实经颅直接给予胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF)或携带GDNF基因病毒载体有显著减少脑梗死体积、促进神经功能恢复的疗效,但其治疗方法有创,临床应用有限。 目的：观察GDNF基因转染的人脐血CD34+细胞经静脉移植对自发性高血压大鼠脑梗死的疗效,并探讨其机制。 方法：分离人脐血CD34+细胞,脂质体方法转染pEGFP-GDNF质粒和pEGFP空载体至CD34+细胞制备pEGFP-GDNF-CD34+和pEGFP-CD34+细胞;制备60只雄性自发性高血压大鼠大脑中动脉栓死模型并随机分为3组：pEGFP-GDNF-CD34+细胞移植组(基因细胞组)、pEGFP-CD34+细胞移植组(单纯细胞组)、生理盐水组。改良神经功能损害评分评价神经功能恢复状况;图像分析法观察TTC染色脑梗死体积;酶联免疫法检测细胞培养液与脑组织匀浆GDNF水平,荧光显微镜及免疫组织化学检测绿色荧光蛋白标记CD34+细胞及其人神经胶质纤维酸性蛋白和人神经元核抗原表达。 结果与结论：经静脉移植pEGFP-GDNF-CD34+细胞向自发性高血压大鼠脑缺血区域迁移、存活、并向神经细胞定向分化,促进神经功能恢复。GDNF基因转染CD34+细胞在脑组织存活、向神经细胞分化及对大脑神经功能保护作用优于CD34+细胞。脑组织GDNF水平可能是GDNF基因转染CD34+细胞和单纯CD34+细胞移植治疗自发性高血压大鼠局灶性脑缺血疗效差异机制之一。     

脐带间充质干细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的影响

背景：体外扩增是目前解决脐带血干细胞移植所面临的单份脐血造血干祖细胞数不足问题的主要手段。已有许多关于不同来源的间充质干细胞联合不同细胞因子支持脐血造血干祖细胞体外扩增的报道,而单独应用间充质干细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增的报道仍很少。 目的：观察应用脐带源间充质干细胞作基质层的体外培养体系对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2006-03/2007-05在中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所、实验血液学国家重点实验室完成。 材料：经产妇知情同意,采集健康足月分娩胎儿脐带9份。 方法：应用贴壁培养的方法从正常足月出生儿脐带中分离培养间充质干细胞,通过细胞形态学、免疫表型、分化实验进行鉴定。利用免疫磁珠分离法从正常足月出生儿脐带血中分离CD34+细胞。应用3种不同培养体系进行脐血CD34+细胞的体外扩增：单独应用脐带源间充质干细胞作基质层、细胞因子培养体系和间充质干细胞联合细胞因子培养体系。 主要观察指标：应用细胞计数法、集落培养计数法和流式细胞学检测法对扩增后细胞数量、集落形成能力和免疫表型进行分析比较。RT-PCR检测间充质干细胞中细胞因子的表达情况。 结果：培养第14天后,间充质干细胞组的CD34+细胞比例明显高于细胞因子联合间充质干细胞组;CD34+细胞总数为培养前的(4.19±1.37)倍,明显高于细胞因子组。培养第7天和第14天,间充质干细胞组的CD34+CD38-细胞亚群比例均高于另两组。RT-PCR结果显示,脐带源间充质干细胞体外可表达干细胞因子和血小板生成素早期干细胞效应因子。 结论：单独应用脐带源间充质干细胞可有效地对脐血CD34+细胞进行体外扩增,更有利于保持较早期干、祖细胞的扩增。 关键词：间充质干细胞;脐带;脐血;CD34+细胞;体外扩增     

细胞因子介导的人脐血单个核细胞体外扩增并重建NOD/SCID小鼠造血及免疫功能

背景：细胞因子介导的脐血造血细胞体外扩增有望能解决脐血移植数量不足的问题。 目的：实验拟确立在无基质培养条件下体外扩增脐血单个核细胞最合适的细胞因子组合及干细胞因子、FLT3配基协同促聚核细胞生成因子对造血及免疫重建功能的影响。 方法：将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d,根据不同细胞因子组合分组,将3因子干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子组合在无血清无基质条件下扩增培养7 d前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠。在扩增培养0,7 d检测脐血CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数。脐血移植6周后通过流式细胞仪,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞。 结果与结论：移植6周后,存活小鼠体内均可检测到人源性CD45+细胞,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠存活率和人特异性基因捡出率均高于新鲜脐血移植组和高于生理盐水移植组 (P < 0.05)。扩增脐血组存活NOD/SCID小鼠骨髓中可检测到人髓系细胞(CD33+),T淋巴细胞(CD4+),B淋巴细胞(CD19+)和人造血干细胞成分(CD34+)细胞的表达。结果提示干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子3因子组合脐血造血细胞体外扩增是最合适的细胞因子组合,其扩增的脐血单个核细胞能够植入并重建NOD/SCID小鼠的造血及免疫功能。     

hTERT介导脐带间充质干细胞实现永生化的研究

目的 通过转染人端粒酶逆转录酶催化亚单位(hTERT)建立永生化脐带间充质干细胞(UCMSCs),用以获得足够多的UCMSCs满足体外研究与临床需要. 方法 原代分离培养人UCMSCs,取第4代UCMSCs行流式细胞术检测UCMSCs表面特异标志物表达:利用脂质体介导pLXSN-hTERT正义表达质粒转染UCMSCs,建立永生化UCMSCs:RT-PCR检测转染前后hTERTmRNA表达水平,细胞免疫荧光方法检测hTERT蛋白表达,流式细胞术观察hTERT转染后细胞周期改变. 结果 流式细胞术结果显示UCMSCs强表达CD29、CD44、CDl05,极低表达CD31、CD34、CD45,检测结果符合人UCMSCs特征;RT-PCR检测单纯UCMSCs低表达hTERT mRNA,pLXSN-hTERT正义表达质粒转染后hTERT mRNA表达明显增高;细胞免疫荧光显示hTERT全部表达于细胞核,转染后胞核荧光强度明显增强;细胞周期检测结果显示转染后处于S期UCMSCs数目明显增多,细胞可获得长期稳定传代(＞35代). 结论 以hTERT转染UCMSCs在体外可获得长期稳定传代培养细胞,可基本满足体外研究与临床需要.     

人脐血间充质干细胞向类肝细胞分化*

背景：研究表明共培养条件下,骨髓间充质干细胞可向心肌细胞、肝样细胞等方向分化。 目的：探讨人脐血间充质干细胞与人肝细胞在体外共培养条件下,诱导人脐血间充质干细胞分化为类肝细胞的可行性。 方法：无菌条件下采集新生儿脐带血,采用密度梯度离心法与贴壁法分离纯化脐血间充质干细胞,待细胞融合至80%时胰蛋白酶消化传代。应用具有微孔滤膜的插入式细胞培养皿和培养板构建人脐血间充质干细胞-肝细胞共培养模型,脐血间充质干细胞按1×107 L-1密度接种于下层6孔板内,LO2人肝细胞按1×105 L-1密度接种到上层插入式培养皿中。以上、下两层均接种人脐血间充质干细胞作为对照组。采用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志,倒置相差显微镜观察共培养后细胞形态变化,RT-PCR法检测肝细胞表面抗原mRNA的表达。 结果与结论：贴壁细胞呈长梭形,强表达CD44和CD29,不表达造血细胞表型CD34和CD45。共培养组5 d时长梭形细胞数量减少,随共培养时间的延长,不规则圆形或多角形的细胞逐渐增多,与肝细胞形态相似;对照组培养4周时,人脐血间充质干细胞仍呈形态均一的长梭形。共培养组5 d时甲胎蛋白mRNA呈阳性表达,其余均为阴性;14 d时细胞角蛋白19 mRNA、白蛋白mRNA开始表达,随着时间延长有增强趋势,甲胎蛋白mRNA表达则较前减弱;对照组各抗原的表达均呈阴性。提示与LO2人肝细胞共培养后,人脐血间充质干细胞可诱导分化为类肝细胞。     

重组小鼠pEGFP-GDNF质粒的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的 克隆小鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)并转染骨髓基质于细胞，制备转基因工程细胞。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从新生小鼠大脑皮层细胞克隆出GDNFcDNA片断，以pEGFP-C1质粒为载体导入骨髓基质于细胞，用流式细胞仪检测转染率，用荧光显微镜和免疫细胞化学方法检测蛋白质的表达。结果 流式细胞仪检测转染率约50％，荧光显微镜下见转染pEGFP／GDNF质粒的骨髓基质干细胞(MSC)发出明亮的绿色荧光，免疫细胞化学方法检测发现转基因MSC抗GDNF蛋白染色成强阳性，正常MSC染色成阴性。结论 成功制备了高效表达外源性基因GDNF的MSC。绿色荧光蛋白作为报告基因可反应GDNF表达情况。