白细胞介素3与白细胞介素6对人脐血单个核细胞体外扩增及黏附分子和趋化因子受体4表达的影响**★

背景：体外扩增脐血造血细胞对增加脐血造血细胞数量及植入能力至关重要，合适的细胞因子组合介导的体外扩增不仅能使造血细胞数量增加，而且能够上调和归巢有关的黏附分子和趋化因子受体4的表达。 目的：实验拟观察白细胞介素3和白细胞介素6在人脐血单个核细胞体外扩增中的作用及对扩增后黏附分子和趋化因子受体4表达的影响。 设计、时间及地点：随机区组开放性实验，于2007-03/12在广西壮族自治区人民医院及广州医学院附属广州市第一人民医院血液实验室完成。 材料：10份足月顺产健康新生儿脐血标本。 方法：将自新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d，根据不同细胞因子组合实验分组为: 对照组（无细胞因子组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子组(A组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素6组(B组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素3 (C组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素6组+白细胞介素3 (D组) 。 主要观察指标：在0,7 d检测有核细胞数, CD34+细胞数及CD34+CXCR4+，CD34+CD62L+，CD34+CD49d+的细胞数和集落形成单位数。 结果：与对照组相比, A，B，C，D组均可有效的扩增脐血造血细胞(P < 0.05), C，D两组扩增效果均优于A，B组,差异显著（P < 0.05），但A，B两组之间无明显区别（P > 0.05）, D组能有效的扩增脐血细胞，并优于C组（P < 0.05）。A，B，C，D组细胞因子组合均可提高脐血CD34+细胞上CD49d, CD62L和趋化因子受体4的表达， A，B两组之间差异不显著（P > 0.05）,但均优于C组（P < 0.05），D组CD34+CXCR4+，CD34+CD62L+和CD34+CD49d+的细胞数扩增倍数优于A，B，C组（P < 0.05）。 结论：白细胞介素6组+白细胞介素3可协同扩增脐血细胞，并能促进和归巢有关的CD49d，CD62L及趋化因子受体4表达。     

骨髓基质细胞对多细胞因子介导人脐血单个核细胞体外扩增的影响*

背景：体外扩增脐血造血细胞的目的是促进脐血造血细胞的植入能力,细胞因子介导的脐血造血细胞能使细胞数有效扩增,但同时也耗竭了具有分化潜能的造血干细胞。 目的：观察骨髓基质细胞对多细胞因子组合介导人脐血单个核细胞体外扩增及扩增后黏附分子和CXCR4表达的影响。 方法：将分离的人脐血单个核细胞接种在预先建立的人骨髓基质细胞层上,分组培养：对照组仅含有脐血单个核细胞;多种细胞因子+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+多种细胞因子+脐血单个核细胞组。培养0,7 d检测有核细胞数, CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数。 结果与结论：单纯骨髓基质细胞和单用细胞因子组均可有效地扩增脐血造血细胞,并提高造血细胞上CD49d,CD62L及 CXCR4表达。而单用细胞因子组促进脐血造血细胞扩增能力较单纯骨髓基质细胞强,提高造血细胞CD49d,CD62L及 CXCR4表达能力较单纯骨髓基质细胞差。提示骨髓基质细胞虽可支持脐血造血细胞扩增,但难以实现造血细胞的大量扩增,但在骨髓基质细胞层的支持下,多细胞因子可有效地促进脐血造血细胞的扩增,并优于单用细胞因子及骨髓基质细胞,证实骨髓基质细胞可协同多细胞因子有效地促进脐血单个核细胞的扩增,促进造血干细胞的黏附和趋化能力。     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血单个核细胞表面抗原表达的影响**

背景：课题组已建立胎儿骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系,该培养体系能否有效扩增各个发育阶段的造血细胞有待验证。 目的：观察骨髓基质细胞联合细胞因子培养体系对脐血单个核细胞表面抗原CD133、CD34表达的影响。 方法：将从脐血标本中分离出来的单个核细胞接种于无血清培养体系,实验分为3组：①F组：干细胞因子+Flt3配体+促血小板生成素+单个核细胞。②S组：基质细胞+单个核细胞。③SF组：基质细胞+干细胞因子+Flt3配体+促血小板生成素+单个核细胞。在第0,6,10,14天检测有核细胞总数、CD133+、CD34+、CD133+CD34+细胞数以及集落形成单位数。 结果与结论：SF组有核细胞总数在各个检测时间点均比其他两组高;除了第14天外,第6、10天两个时间点SF组中CD133+、CD34+、CD133+CD34+细胞及集落形成单位数均高于其他组;含骨髓基质细胞的S组和SF组中CD133+细胞/有核细胞、CD34+细胞/有核细胞、CD133+CD34+细胞/有核细胞的比例保持在较高的水平。结果说明骨髓基质细胞联合细胞因子能有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133+、CD34+、CD133+CD34+细胞,基质细胞对维持造血干细胞的原始性具有重要的作用。     

人骨髓及脐血单个核细胞移植构建人源化非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷

背景：人源化非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficient,NOD/SCID)小鼠模型在生物及医学科学研究中被广泛应用,而提高人源化NOD/SCID小鼠模型中的人源化水平是研究者的迫切需要。 目的：探讨提高人源化NOD/SCID小鼠模型人源化水平的措施。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-11/2009-01在广西医科大学实验动物中心及广西医科大学第一附属医院完成。 材料：雄性NOD/SCID小鼠14只,体质量(25.0±1.5)g;1例骨髓标本约6 mL(多部位分层次采集)取自健康志愿者;1例足月脐带血标本大约90 mL,取自广西医科大学第一附属医院产科,为健康产妇。 方法：无菌抗凝的正常骨髓及足月脐带血样本均在采集后6 h内处理。密度梯度离心法分离单个核细胞。将14只小鼠标号电脑随机分为5组：全身照射/环磷酰胺骨髓移植组(n=3),全身照射/环磷酰胺脐血移植组(n=3),全身照射骨髓移植组(n=3),全身照射脐血移植组(n=3),空白对照组(n=2)。将人骨髓或脐血单个核细胞分别移植给经不同方案和剂量预处理的各组小鼠,移植后给小鼠腹腔注射重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子及重组人促红细胞生成素。 主要观察指标：各组小鼠输注的细胞数,小鼠存活情况并计算死亡率,移植6周后流式细胞仪检测小鼠骨髓及外周血人CD45+细胞比例。 结果：全身照射/环磷酰胺骨髓移植组、全身照射骨髓移植组和全身照射/环磷酰胺脐血移植组、全身照射脐血移植组小鼠输注人单个核细胞数分别为(0.656 0±0.008 9) ×106和(4.077 5±0.845 0)×106。全身照射/环磷酰胺组死亡率均为100%,全身照射组死亡率均为33.3%。全身照射后再加环磷酰胺,小鼠不能耐受;而全身照射剂量越大,死亡率越高,当达400 cGy时,死亡率100%。存活小鼠移植6周后,流式细胞仪检测小鼠骨髓中人CD45+细胞的比例,全身照射脐血移植组13号和6号小鼠分别为59.61%和21.46%,而全身照射骨髓移植组2号和8号小鼠其比例均为0,空白对照组小鼠比例均为0。而在13号小鼠骨髓细胞中,CD33+细胞比例为13.13%,GlyA+CD45-细胞比例为20.21%。 结论：要建立人源化NOD/SCID小鼠模型,所输入的造血干细胞数量一定要达到阈剂量,而在可耐受的范围内,尽可能提高预处理的强度,并使用人细胞因子可提高人源化NOD/SCID小鼠模型的人源化比例。     

人羊膜间充质干细胞支持造血的体外实验

背景：骨髓是目前间充质干细胞的主要来源，但由于取材不便、细胞数量受年龄限制等原因，其应用具有一定局限性。近年来，羊膜作为间充质干细胞的新来源受到越来越广泛的关注。 目的：探讨人羊膜来源间充质干细胞在体外对造血干细胞的扩增是否有支持作用，以及怎样提高羊膜间充质干细胞和造血干细胞共移植成功率。 方法：利用组织块培养法，从足月分娩的人羊膜中分离培养羊膜间充质干细胞。密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，采用免疫磁珠分选技术分选其中CD34+细胞。分别用脐血单个核细胞和CD34+细胞与羊膜间充质干细胞共培养，连续4周，每周计悬浮细胞浓度，并以骨髓间充质干细胞组及无滋养层组作为对照。采用集落形成实验，把扩增的脐血单个核细胞和CD34+细胞分别接种至甲基纤维素半固体培养基中，14 d后根据典型形态特征计数造血集落数。 结果与结论：羊膜间充质干细胞可促进人脐血单个核细胞和CD34+细胞扩增，扩增后两者在甲基纤维素半固体培养基中能够形成造血祖细胞集落，其造血支持作用与骨髓间充质干细胞相似，两者对比无明显统计学差异。提示，羊膜间充质干细胞体外具有与骨髓间充质干细胞相似的造血支持作用，有可能为造血干细胞体外扩增及临床间充质干细胞与造血干细胞联合移植、提高造血干细胞移植成功率提供一种更加理想的间充质干细胞新来源。     

脐带间充质干细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的影响

背景：体外扩增是目前解决脐带血干细胞移植所面临的单份脐血造血干祖细胞数不足问题的主要手段。已有许多关于不同来源的间充质干细胞联合不同细胞因子支持脐血造血干祖细胞体外扩增的报道,而单独应用间充质干细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增的报道仍很少。 目的：观察应用脐带源间充质干细胞作基质层的体外培养体系对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2006-03/2007-05在中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所、实验血液学国家重点实验室完成。 材料：经产妇知情同意,采集健康足月分娩胎儿脐带9份。 方法：应用贴壁培养的方法从正常足月出生儿脐带中分离培养间充质干细胞,通过细胞形态学、免疫表型、分化实验进行鉴定。利用免疫磁珠分离法从正常足月出生儿脐带血中分离CD34+细胞。应用3种不同培养体系进行脐血CD34+细胞的体外扩增：单独应用脐带源间充质干细胞作基质层、细胞因子培养体系和间充质干细胞联合细胞因子培养体系。 主要观察指标：应用细胞计数法、集落培养计数法和流式细胞学检测法对扩增后细胞数量、集落形成能力和免疫表型进行分析比较。RT-PCR检测间充质干细胞中细胞因子的表达情况。 结果：培养第14天后,间充质干细胞组的CD34+细胞比例明显高于细胞因子联合间充质干细胞组;CD34+细胞总数为培养前的(4.19±1.37)倍,明显高于细胞因子组。培养第7天和第14天,间充质干细胞组的CD34+CD38-细胞亚群比例均高于另两组。RT-PCR结果显示,脐带源间充质干细胞体外可表达干细胞因子和血小板生成素早期干细胞效应因子。 结论：单独应用脐带源间充质干细胞可有效地对脐血CD34+细胞进行体外扩增,更有利于保持较早期干、祖细胞的扩增。 关键词：间充质干细胞;脐带;脐血;CD34+细胞;体外扩增     

微囊微环境体外扩增人脐血造血干/祖细胞

背景：由于单份脐血所含的造血细胞数量有限,目前只能用于儿童或低体质量成人血液病和急性辐射损伤等疾病患者,有效扩增脐血造血干/祖细胞已成为研究热点。 目的：观察微囊微环境对脐血造血干/祖细胞扩增的影响,以及此过程中可否使造血干/祖细胞在扩增的同时仍维持其未分化状态。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2006-06/2007-09在中国科学院大连化学物理研究所完成。 材料：正常足月产新生儿脐带血由大连市妇产医院提供,提供者知情同意。 方法：Ficoll法梯度分离人脐血单个核细胞,采用静电液滴法在生理条件下进行微囊化包封和体外培养。以同条件平面培养的脐血单个核细胞作为对照。 主要观察指标：观察微囊化脐血细胞的生长特点及脐血细胞总数的变化;流式细胞仪检测培养过程中CD34+细胞扩增情况;应用甲基纤维素半固体培养法观察扩增细胞的集落形成能力。 结果：脐血细胞在微胶囊内持续增殖,并以聚集成团的三维方式生长,两种培养方式对脐血细胞总数均无明显影响(P > 0.05)。对比CD34+细胞扩增和细胞集落的生成发现,微囊化培养脐血细胞的CD34+细胞数量和集落密度均在培养第6天达到高峰,明显高于平面培养3 d时所达到的峰值;之后逐渐下降,至12 d后平面培养细胞的CD34+细胞和集落形成能力几乎检测不到,而此时微囊化培养的CD34+细胞数量和集落密度仍与平面培养的扩增高峰相近。 结论：微囊化培养能有效扩增人脐血造血干/祖细胞,并显著减缓造血干/祖细胞的分化进程,维持其多分化潜能,提示微囊为造血干/祖细胞维持未分化状态的扩增提供了特殊的微环境。     

不同细胞饲养层支持脐血CD34+细胞体外扩增的效果比较

背景：成纤维细胞饲养层与基质细胞饲养层一样能分泌多种细胞因子，其中包括起正性作用和负性作用的细胞因子，它们对共培养体系内的干/祖细胞起双向调节作用，但何时表现为抑制性或促进性作用目前尚无定论。 目的：分析比较骨髓基质细胞及皮肤成纤维细胞饲养层对脐血CD34+细胞体外扩增的影响，以了解共培养体系对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2003-08/2004-05在广东医学院附属医院中心实验室完成。 材料：原代成纤维细胞、骨髓标本由广东医学院附属医院提供，脐血标本由广东医学院附属医院妇产科及湛江市妇幼保健院妇产科提供。 方法：体外分离培养人脐血单个核细胞，应用免疫磁珠(阳性)分选法提取脐血CD34+细胞。设立3组：液体培养对照组为脐血CD34+细胞(3×108 L-1)+ RPMI 1640培养液(含体积分数为10%牛血清白蛋白、10 μg/L粒-巨噬细胞集落刺激因子、10 μg/L干细胞因子、10 μg/L白细胞介素3)，接种于24孔培养板；骨髓基质细胞饲养层组、成纤维细胞饲养层组分别将体外分离培养的第4代人骨髓基质细胞/皮肤成纤维细胞接种于24孔培养板，70%融合时加入等量脐血CD34+细胞及相同成分的RPMI 1640培养液。 主要观察指标：脐血CD34+细胞增殖情况与集落形成能力。 结果：与骨髓基质细胞饲养层组比较，液体培养对照组、成纤维细胞饲养层组脐血CD34+细胞增殖率及集落形成能力均显著降低(P均< 0.01)；后2组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论：骨髓基质细胞饲养层培养体系能促进脐血CD34+细胞体外扩增，并可以较好地保持脐血CD34+细胞的干细胞特性，效果显著优于成纤维细胞饲养层及液体培养体系。     

卵黄囊移植人脐血CD34+细胞构建人源化血液系统小鼠模型

背景：与较为成功的羊等大型动物宫内移植方法相比，利用小鼠等小型动物宫内移植异种造血干细胞仍面临困境，在外周血内检测到的异种血液细胞重建率仍在1%以下。 目的：观察小鼠卵黄囊移植人脐血来源CD34+造血干细胞后的异种造血重建效率，并与腹腔移植的效果进行比较。 设计、时间及地点：细胞学体内移植实验，于2007-10在北京大学干细胞与再生生物学实验室完成。 材料：健康新生儿脐血取自北京海淀区妇幼保健院。ICR小鼠由北京大学医学部实验动物中心提供，孕8.5 d鼠8只，孕 12.5 d鼠9只。藻红蛋白标记的抗人CD45单克隆抗体与流式细胞仪均为BD公司产品。 方法：采用Ficol1法梯度离心获得人脐血单个核细胞，经磁珠分选系统纯化获得CD34+细胞。将孕8.5 d鼠麻醉后，打开腹腔并暴露子宫，显微镜下抽取5~10 μL脐血CD34+细胞（5×104个），缓慢注入胎鼠的卵黄囊中。相同操作条件下将等量脐血CD34+细胞注射到孕12.5 d胎鼠的腹腔中。快速抽针，将孕鼠子宫归位并缝合腹腔，继续妊娠，等待分娩。待小鼠出生后3个月，经尾静脉取血，在避光状态下加入藻红蛋白标记的抗人CD45单克隆荧光抗体，流式细胞仪检测血细胞表面标记CD45的表达，通过其阳性率判断人血液细胞在小鼠体内的重建效果。 主要观察指标：不同移植方式对小鼠造血重建的影响。 结果：CD34+细胞通过卵黄囊移植方式共获得健康出生小鼠52只，3个月后86.5%（45/52）小鼠CD45呈阳性表达，嵌合率高达4.34%。通过腹腔移植方式共获得健康出生小鼠48只，3个月后81.3%（39/48）小鼠CD45呈阳性表达，明显低于卵黄囊移植方式（t=2.363, P < 0.05）。 结论：早期卵黄囊移植可以获得人造血干细胞在小鼠体内的长期重建，效果优于腹腔移植，同时也证明了通过胎鼠卵黄囊移植人脐血造血干细胞取得人源化造血系统小鼠模型的可行性。     

靶基因调控的脐血干/祖细胞体外长期扩增与调控**★

背景：脐血干细胞是基因治疗最理想的靶细胞之一，但基因转移率低下是目前面临的主要障碍。酪氨酸激酶JAK2在造血干/祖细胞自我更新中扮演着重要的作用，为了克服脐血基因转移率低下的障碍，根据基因调控表达技术原理，是否可开发一个可以靶向扩增JAK2基因修饰的脐血CD34+细胞体系。 目的：探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性。 单位：卫生部北京医院血液科。 材料：实验于2003-06/2006-04在卫生部北京医院血液科实验室完成。脐血取自健康、足月、自然分娩后立即断脐的脐血。脐血由北京医院妇产科提供，产妇及家属均知情同意，实验经医学伦理委员会批准。MiniMACS磁性分离仪、免疫磁珠吸附CD34单抗购自德国Miltenyi Biotec公司， 流式细胞仪购自美国FACScalibur，人重组干细胞因子、Flt3配体、人白介素-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、血小板生成素为PeproTec产品，SPF级裸鼠购自北京医科大学动物中心。 方法：构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2，内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v，F2)组成。AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导。该载体同时含有绿色荧光蛋白报告基因，用作检测细胞增殖的标记。应用MiniMACS免疫磁珠分选系统纯化分离脐血CD34+ 细胞，用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34+细胞。转导后的CD34+ 细胞在集落刺激因子、Flt3配体、血小板生成素、白介素-6细胞因子的联合培养条件下，以不加或加入AP20187分别作为对照组和实验组。 主要观察指标：①应用流式细胞仪测定两组CD34+细胞中所含绿色荧光蛋白细胞的百分率，确定基因转移率。②扩增后的脐血祖细胞集落培养结果。③取培养10周的脐血CD34+细胞于裸鼠的胁部皮下注射，30 d后观察成瘤情况。 结果：①实验组与对照组均可获得CD34+ 细胞大量扩增。随着培养时间的延长，实验组扩增的CD34+细胞GFP阳性率由基线水平逐渐上升于第11周时达到95%以上，而对照组绿色荧光蛋白报告基因阳性率逐渐下降到基线水平以下并逐渐消失。②实验组转基因CD34+ 细胞于12周后仍可产生造血祖细胞集落红系祖细胞、粒单系祖细胞、脐血多向造血祖细胞，所形成的造血祖细胞集落以粒单系祖细胞为主。③裸鼠实验无致瘤特性。 结论：转染JAK2 基因的人脐血CD34+ 细胞协同其他细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞，对今后开展干细胞治疗某些遗传性血液病有潜在的应用价值。     

Presence of endothelial progenitor cells, distinct from mature endothelial cells, within human CD146+ blood cells

CD146 is an adhesion molecule present on endothelial cells throughout the vascular tree. CD146 is also expressed by circulating endothelial cells (CECs) widely considered to be mature endothelial cells detached from injured vessels. The discovery of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) originating from bone marrow prompted us to investigate whether CD146 circulating cells could also contains EPCs. We tested this hypothesis using an approach combining elimination of CECs by an adhesion step, followed by immunomagnetic sorting of remaining CD146+ cells from the non adherent fraction of cord blood mononuclear cells. When cultured under endothelial-promoting conditions, these cells differentiated as late outgrowth endothelial colonies: they grew as a cobblestone monolayer, were uniformly positive for endothelial markers and did not express leukocyte antigens. They highly proliferated and were expanded in long-term culture without alterations of their phenotypic and functional properties (Dil-ac-LDL uptake, wound repair, capillary-like network formation, and TNFalpha response). Moreover, these cells colonized a Matrigel plug in immunodeficient mice (NOD/SCID). Finally, using 4-color flow cytometry analysis of purified CD34+ cells, we clearly discriminated, CD146+ EPCs (CD146+ CD34+ CD45+ CD133+ or CD117+), and CD146+ CECs (CD146+ CD34+, CD45- CD133- or CD117-), both in cord and adult peripheral blood.The relative proportions of the two CD146+ subsets varied in patients with myocardial infarction as compared to healthy subjects. Our study establishes that, beside CECs, CD146+ circulating cells contain a subpopulation of EPCs with potential use in proangiogenic therapy. In addition, the dual measurement of CD146+ CECs and CD146+ EPCs offers a promising tool for monitoring vascular injury/regeneration processes in clinical situations.     

Flt3配体胞外域的原核表达纯化及对脐血CD34+细胞的扩增作用*

背景：Fms 样酪氨酸激酶3配体(Flt3配体)是一种重要的生长因子,通过激活特定的酪氨酸激酶受体,调控造血细胞的生长、生存和/或分化,具有促进造血干细胞体外扩增的应用潜力。 目的：构建pET32a(+)-hFLext原核表达载体,表达、纯化hFLext蛋白,观察其对脐血CD34+细胞的扩增作用。 方法：克隆hFLext,构建pET32a(+)-hFLext重组表达载体。转化大肠杆菌 BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白。磁珠分选脐血CD34+细胞,单独加入hFLext或联合干细胞因子、血小板生成素孵育1周,观察体外扩增作用。 结果与结论：成功克隆hFLext,并构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体。在大肠杆菌BL21成功表达Trx-hFLext融合蛋白,经8 mol/L尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白。Trx-hFLext融合蛋白不仅具有维持及轻度刺激CD34+细胞体外扩增的作用,并且与干细胞因子及血小板生成素具有协同作用,为造血干/祖细胞体外扩增研究奠定了基础。     

造血干细胞移植在肝脏疾病治疗中的应用与进展

造血干细胞基本来源于骨髓、脐带血及外周血,而终末期肝脏疾病患者身体状况很差,几乎不能耐受较大的创伤,因此用外周血干细胞移植的方法来获得转分化后的肝细胞,是一种很有发展潜力的方法。外周血干细胞移植时如果要获取足够数量的干细胞,必须对外周血进行动员,目前干细胞动员剂分为3种类型：化疗药物、硫酸葡聚糖等聚阴离子制剂、各种重组的人造血细胞刺激因子。对于有着严重肝脏疾病的患者来说,选用各种重组的人造血细胞刺激因子是相对安全的。在造血干细胞的分离方法中,目前应用最广泛的是密度梯度离心法,它可以获得富含单个核细胞的白细胞层,从而初步富集CD34+细胞。随着针对CD34+不同抗原决定簇的单克隆抗体的不断发现,准确、大量、快速阳性分选CD34+细胞的免疫学技术也在迅速开展,如固相分选技术、流式细胞仪分选等。利用造血干细胞的高度增殖能力及多向分化潜能,对其进行体外扩增和定向诱导分化,从而在短时间内产生大量的早期造血祖细胞,以及定向扩增的多种细胞如肝细胞等而应用于移植,目前应用骨髓造血干细胞转分化为肝细胞己获得成功。为判断在移植器官中真正转分化的细胞是否来源于输注的干细胞,常在移植前对输入细胞进行标记,标记的方法包括荧光标记、特殊染色、基因标记、染色体鉴定等,然后应用免疫学和分子生物学、荧光化学技术加以检测。现阶段应用造血干细胞移植治疗肝脏疾病多为基础实验,临床上尚未得到广泛运用。     

Biogenesis of G-protein mediated calcium signaling in human megakaryocytes.

To understand how platelet signal transduction pathways develop during megakaryocytopoiesis, we isolated human stem cells from umbilical cord blood and cultured the cells in the presence of thrombopoietin (TPO). Based on the early expression of CD61 and late expression of CD42b, immature (CD61+/CD42b(low)) and mature (CD61+/ CD42b(high)) megakaryocytes were immunomagnetically purified and, together with stem cells (CD34+), characterized for Galpha-protein expression and agonist-induced [Ca2+]i increases. Megakaryocytopoiesis was accompanied by down-regulation of the 43 kDa and 46 kDa variants of G16alpha, constant expression of Gsalpha, and up-regulation of Gqalpha and Gialpha1/2. The increase in Gqalpha and Gialpha1/2 expression was accompanied by an increase in Ca2+ signaling triggered by thrombin and other agonists known to signal to Ca2+ via these G-proteins in platelets. The prostacyclin analog iloprost and TPO also induced [Ca2+]i increases, and the iloprost-induced Ca2+ response disappeared during maturation. These data reveal sharp changes in Ca2+ regulation during megakaryocytopoiesis.     

Expression of transcription factor Oct-4 and other embryonic genes in CD133 positive cells from human umbilical cord blood

A significant number of hematopoietic stem/progenitor cells (HSPC) in human umbilical cord blood could serve as a reservoir for the placental vasculature, yet, their morphological and functional features are not completely understood. Here, we describe the characterization of purified CD133(+) progenitor cells from umbilical cord blood, a subset of CD34(+) hematopoietic progenitors that were grown in proliferation medium containing Flt3-ligand, thrombopoietin and stem cell factor. Following isolation and enrichment of the CD133(+) cells by immunomagnetic cell sorting, they remained non-adherent for up to 40 days in culture and expressed different pluripotency markers including Sox-1, Sox-2, FGF-4, Rex-1 and Oct-4.Oct-4 expression was confirmed by laser-assisted single cell picking with subsequent quantitative real-time RT-PCR. The expression of Oct-4 indicates a pluripotent phenotype of CD133(+) cells and appears to be of functional relevance: After three weeks in endothelial differentiation medium, suspended cells became adherent, developed an endothelial cell-like morphology, bound fluoresceine isothiocyanate-labeled Ulex europaeus agglutinin-1, took up acetylated Di-LDL, and expressed other endothelial markers such as PECAM-1 or VEGFR-2. Concomitantly, Oct-4 expression was significantly reduced. Moreover, following treatment with retinoic acid, CD133(+) cells exhibited neural morphology associated with the expression of beta-III-tubulin. CD133(+) cells were found to express the luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin (LH/hCG) receptor, detected by RT-PCR and immunocytochemistry. The recombinant human chorionic gonadotropin induced proliferation of the CD133(+) cells in a dose-specific manner. Our results indicate that CD133(+) HSPC from umbilical cord blood may have a greater differentiation potential than previously recognized and give rise to proliferative endothelial cells participating in placental vasculogenesis.     

CD34-positive cells in human umbilical cord blood express nerve growth factor and its specific receptor TrkA

In this study, we investigated whether hematopoietic stem cells (HSC) and progenitors present in human cord blood can express nerve growth factor (NGF)-specific receptors, TrkA and p75. Our results showed a marked expression of TrkA and NGF in cord blood CD34(+) cells. A gradient of TrkA and NGF expression exists and is highest in cord blood CD34(+) cells, reduced in cord blood mononuclear cells (MNC) and minimal in mononuclear cells isolated from adult peripheral blood.Our findings suggest that NGF may play a role in the differentiation of hematopoietic progenitors and indicate a different requirement for NGF by immune cells, depending on their state of maturity.