抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的制备抗恶性疟原虫EBA—175的单克隆抗体（McAb），为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法以恶性疟原虫EBA-175（Ⅱ区F2段）重组抗原免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株．测定其免疫球蛋白亚类及其效价，ELISA、Western blot试验分析其特异性。结果筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4Al、4C3、4H9，6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1，1株为IgG2a，6株McAb的培养上清ELISA效价为1：256～1：512，腹水效价为1：12800-1：25600，间接ELISA显示其中4株McAb 1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合，而只有1F3、4A1、4H9在Western blot试验中识别恶性疟原虫Mr约35000的虫源蛋白。结论获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。     

抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的 制备抗恶性疟原虫EBA-175的单克隆抗体(McAb),为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法 以恶性疟原虫EBA-175(II区F2段)重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。结果 筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4A1、4C3、4H9,6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1,1株为IgG2a,6株McAb的培养上清ELISA效价为1:256~1:512,腹水效价为1:12800~1:25600,间接ELISA显示其中4株McAb1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合,而只有1F3、4A1、4H9在Westernblot试验中识别恶性疟原虫M_r约35000的虫源蛋白。结论 获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。     

抗前列腺特异性膜抗原膜外区多肽单克隆抗体的研制及初步应用

目的 建立前列腺特异性膜抗原(PSMA)膜外区多肽杂交瘤细胞株,并对其分泌的PSMA单克隆抗体进行初步鉴定,为PSMA的功能研究和人源化抗体的制备奠定基础,以求进一步用于前列腺癌的诊断和治疗.方法 使用人工合成多肽免疫BABL/c小鼠,采用PEG融合技术建立杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体.通过免疫荧光法、酶联免疫吸附法及斑点金标法确定单克隆抗体的交叉反应性、亲和力及免疫球蛋白的类型和亚类.结果 获得两株可稳定分泌PSMA单克隆抗体的杂交瘤细胞,4F4为IgG1类.IF1为IgG3类.两株单抗均能识别LNCap细胞表达的PSMA蛋白.与不表达PSMA的PC-3、SP2/0等细胞无交叉反应.杂交瘤细胞株1F1培养上清效价为1:40,腹水效价为1:6400:而杂交瘤细胞株4F4培养上清效价为1:80,腹水效价为1:8000.结论 成功地制备出两株抗PSMA单克隆抗体,均具有良好的特异性和亲和力,为进一步建立免疫分析方法,进行PSMA相关研究奠定了基础.     

EB病毒GST-Rta150融合蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备EB病毒GST—Rta150融合蛋白的单克隆抗体并鉴定其特性．方法取经GST-Rta150融合蛋白免疫小鼠的脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞常规融合，依次进行阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆，接种杂交瘤细胞至小鼠腹腔，收集腹水并纯化。制备的单克隆抗体以琼脂双向扩散法鉴定抗体类及亚类．间接ELISA法测定抗体的效价，Western-blot检测抗体的特异性。结果获得一株稳定分泌抗GST-Rta150融合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A9，细胞培养上清效价为10^-3，腹水效价为10^-5，纯化的抗体效价为10^-6．经鉴定GST-Rta150融合蛋白单克隆抗体的亚类为IgGl。Western-blot结果显示此单克隆抗体能特异结合GST-Rta150融合蛋白．将杂交瘤细胞株在液氮中冻存3个月后复苏，其分泌的单克隆抗体效价不变。结论通过上述方法制备出来的单克隆抗体特异性强，稳定性好，为研究EB病毒立即早期基因产物Rta蛋白以及EB病毒相关疾病的诊断和治疗奠定了基础。     

抗H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立稳定分泌抗H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞系,为进一步研究禽流感诊断技术奠定基础。方法以纯化的H5亚型禽流感病毒按常规方法免疫BALBc小鼠,最后一次免疫后第3天取其脾细胞与SP20细胞在聚乙二醇作用下融合,用选择性培养、有限稀释法克隆和血凝抑制试验进行筛选,对获得阳性克隆株用ELISA方法进行亚型鉴定,并用37株H5、H7、H9亚型AIV测定其特异性、覆盖性。结果最后获得了3株分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,命名为1E5、4A4、4B1,经长期体外培养和冻存后复苏能稳定地分泌抗体。经鉴定,其亚型均为IgG1、kappa链。腹水HI效价1∶210～1∶216,细胞培养上清HI效价1∶26～1∶28。3株杂交瘤所分泌的单克隆抗体均能与本中心保存的全部20株H5亚型禽流感病毒分离株发生反应,而与15株H9亚型禽流感病毒分离株、2株H7亚型禽流感病毒分离株以及H1H4、H6H15亚型禽流感病毒标准毒株均不反应,与鸡新城疫病毒、鹅新城疫病毒、鹅腺病毒和鸡产蛋下降综合征病毒等均无交叉反应。结论所获3株单克隆抗体可用于禽流感病毒特异性诊断试剂的研制。     

抗重组人红细胞生成素单克隆抗体的制备与鉴定

目的:获得能特异性识别人红细胞生成素(hEPO)的单克隆抗体(McAb).方法:用重组人红细胞生成素(rHuEPO)作抗原免疫Balb/c小鼠,以细胞融合、酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选和克隆化技术获得抗hEPO的杂交瘤细胞株.用生物学方法鉴定杂交瘤细胞,用免疫学方法鉴定McAb的特异性.结果:获得3株稳定分泌抗hEPO-McAb的杂交瘤细胞株(1H7、4G11、1B4). 培养上清的ELISA效价分别为:1∶1 024、1∶512、1∶512 ;腹水效价为: 1×107、1×106、2×104.阻断法表明1H7识别的hEPO上的抗原决定簇和4G11、1B4识别的不同.结论:成功建立了3株稳定分泌抗hEPO-McAb的杂交瘤细胞株,它们分别识别hEPO上2个不同的抗原位点,有望作为EPO定量检测的特异性抗体.     

抗hnRNP B1单克隆抗体的制备与鉴定

目的　建立分泌抗不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hn RNP) B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对分泌的单克隆抗体进行免疫学鉴定。方法　用人工合成的19肽hn RNP B1作为免疫原,采用皮下多点注射及腹腔注射方法免疫BAL B/ c小鼠,取其脾细胞与SP2 / 0小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞采用间接EL ISA法筛选。结果　获得稳定分泌抗hn RNP B1单克隆抗体的杂交瘤细胞2株。EL ISA法检测腹水效价为1∶1.8×10 5,免疫组织化学染色法显示该单克隆抗体特异性强。结论　成功构建hn RNP B1单克隆抗体抗体杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体对肺癌的诊断具有较好的特异性。     

幽门螺杆菌CagL蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的: 制备幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）CagL蛋白单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）,并鉴定其特性。方法： 用原核表达并纯化的CagL融合蛋白免疫BALB/c小鼠,6周后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经亚克隆筛选获得阳性杂交瘤细胞株;ELISA法鉴定mAb的亚型;间接ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清和腹腔积液效价及其相对亲和力;相加ELISA法分析mAb的识别表位;蛋白质印迹法鉴定mAb特异性;冻溶法检测杂交瘤细胞株的稳定性。结果： 获得3株能稳定分泌抗CagL的杂交瘤细胞株,其中两株单抗属IgM类,一株单抗属IgG2a类,轻链型别均为κ型;杂交瘤细胞培养上清效价在1∶64～1∶128之间,腹腔积液的效价均达1∶16 000以上;相对亲和力较高;3株mAb识别3种不同的抗原表位;3株mAb都能与融合蛋白反应,其中两株能与H.pylori全菌蛋白发生特异性反应;杂交瘤细胞经冻存复苏后,体外传代仍能稳定分泌mAb。结论： 成功制备了抗H.pylori CagL蛋白的单克隆抗体,为深入研究幽门螺杆菌CagL蛋白的功能和Ⅳ型分泌系统的致病机制奠定了基础。     

肠道病毒71型VP1蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)VP1外壳蛋白单克隆抗体。方法:利用重组纯化的EV71-VP1蛋白为抗原免疫BALB/c鼠,按常规杂交瘤技术进行细胞融合,对阳性杂交瘤细胞进行筛选及亚克隆,获得1株能稳定分泌抗EV71-VP1抗体的杂交瘤细胞株6F2B9,细胞体外扩大培养后的上清用Protein G柱纯化,超滤后用BCA法测其浓度,用免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型,间接ELISA方法检测其效价和特异性,间接免疫荧光法检测其与EV71病毒的特异性结合能力。结果:本研究得到的抗EV71-VP1抗体DSE-136,纯化后浓度为1.9 g/L,免疫球蛋白亚类为IgG2b,轻链属于κ链;间接ELISA检测效价为1∶3.2×105;间接免疫荧光结果显示其可与EV71病毒特异性结合。结论:成功制备出1个效价高、特异性好的抗EV71-VP1单克隆抗体DSE-136,为VP1抗原诊断、疫苗研发及其效果评价奠定了基础。     

人附睾蛋白4单克隆抗体的制备和鉴定

目的建立人附睾蛋白4(HE4)杂交瘤细胞株,并对其分泌的HE4单克隆抗体进行鉴定和初步应用,为HE4的功能研究和人源化抗体的制备奠定基础。方法使用pcDNA3.0-HE4重组质粒免疫BALB/C小鼠,采用PEG融合技术建立杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体。通过免疫荧光法、有限稀释法及金标斑点法测定单克隆抗体的交叉反应性及免疫球蛋白的类型和亚类。结果获得2株可稳定分泌HE4单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1C5和1C8,均为IgMκ类。2株单抗能够与表达HE4蛋白的卵巢癌细胞发生反应,而不与Sp2/0细胞、CHO细胞等发生交叉反应。杂交瘤细胞株1C5培养上清效价为1∶160,腹水效价为1∶1 280,而杂交瘤细胞株1C8培养上清效价为1∶128,腹水效价为1∶1 024。结论成功地制备出两株抗HE4单克隆抗体,均具有良好的特异性,为进一步建立免疫分析方法,进行HE4相关研究奠定了良好的基础。     

Preparation and identification of monoclonal antibodies against Penicillium marneffei]

OBJECTIVE: To prepare and identify monoclonal antibodies (mAbs) against Penicillium marneffei. METHODS: Recombinant mannoprotein1 (MP1) of Penicillium marneffei was used to immunize BALB/c mice, and anti-MP1 mAbs were obtained by means of hybridoma. Screening and identification of the mAbs were subsequently performed with indirect enzyme-linked immunosorbent assay and Western blotting, respectively. RESULTS: Four hybridomas producing antibodies against Penicillium marneffei were obtained, and the IgG isotypes of the 4 mAbs were identified as IgG1 with affinity constants (K) of 8.2x10(-9), 4.7x10(-9), 6.5x10(-9) and 2.7x10(-9), respectively. Western blotting demonstrated specific recognition of Aspergillus fumigatus MP1 by the obtained mAbs. CONCLUSION: The 4 hybridomas producing anti-MP1 mAbs with high specificity and affinity can be of significant value in the diagnosis of Penicilliosis marneffei infections.     

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的快速、高效制备的方法研究

OBJECTIVE: To develop a rapid and efficient method for preparing monoclonal antibodies (mAb) against SARS-associated coronavirus (SARS-Cov) nucleocapsid (N) protein. METHODS: BALB/c mice were injected with the recombinant N protein of SARS-Cov into the foot-pads for the immunization, and the popliteal lymph nodes were isolated 15 d later for mAb-producing hybridomas, from which the mAbs against the N protein of SARS-Cov were screened. The identification of the mAb against the N protein of SARS-Cov was performed using indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), indirect fluorescent-antibody assay (IFA), and Western immunoblotting. RESULTS: Four strains of hybridomas were obtained that produced the mAb specific to the N protein without detectable cross-reactivity with other pathogens. Of the 4 strains, 2 were identified as the immunoglobulin G1 (IgG1) isotype, 1 IgG2a, and the other IgG2b, with affinity constants (Ka) of 2 of the strains being 4.14 x 10(-9)M and 3.19 x 10(-9)M respectively. CONCLUSION: This is the first report on the preparation of mAb that is specific to the SARS-Cov, and the high-specificity and high-affinity mAb produced by the 4 strains of hybridomas provide a basis for further researches on the pathogenesis and early diagnosis of SARS.     

SARS冠状病毒单克隆抗体制备及在肺尸检标本染色中的应用

目的制备抗SARS冠状病毒的单克隆抗体,用于SARS的实验室诊断。方法灭活SARS冠状病毒(PUMC01)全病毒免疫BALB／C小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(NS-1)融合,用酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光法(IFA)及免疫印迹法对所获得的细胞克隆进行筛选和鉴定,并用其中一株(M2)杂交瘤诱生的腹水单克隆抗体对SARS患者尸检肺组织切片进行免疫组织化学染色。结果共筛选出6株杂交瘤细胞,ELISA及IFA法证实其分泌的单克隆抗体与SARS冠状病毒有特异性反应,与其他常见呼吸道病原体均无交叉反应。免疫双扩散方法鉴定1株杂交瘤细胞(M2)为免疫球蛋白IgG3型,其余5株均为IgG1型。免疫印迹试验显示1株杂交瘤细胞(M2)分泌的抗体与相对分子质量68000的蛋白有特异性反应;4株杂交瘤细胞分泌的抗体与相对分子质量27000的蛋白有特异性反应,1株在免疫印迹上未见到结果。SARS患者尸检肺组织病理切片免疫组织化学染色阳性,在肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞及巨噬细胞的胞浆均可见阳性颗粒。结论我们制备的6株单克隆抗体是抗SARS冠状病毒的特异性单克隆抗体,用于SARS尸检肺组织免疫组化染色,结果阳性。     

抗人ξ珠蛋白链不同表位单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备和鉴定抗ξ珠蛋白链单克隆抗体。方法用纯化的重组ξ珠蛋白链免疫Balb／c小鼠，取其脾细胞与NS-1细胞融合制备杂交瘤，经重组的ξ珠蛋白链筛选和3次克隆化，从制备的腹水中纯化单克隆抗体。结果和结论获得3株杂交瘤细胞IA12、3H9及4D11，其分泌单抗的亚型分别为IgG2a、IgG1和IgG1；双抗体夹心ELISA结果证明3株单抗均可结合重组的及东南亚（--^SEA）缺失型地中海贫血基因携带者血中的ξ珠蛋白链，且其中IA12和3H9识别的位点为不同表位。这三株抗体将为筛选地中海贫血基因携带者的免疫检测提供有力工具。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的 在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上，制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法 原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段Slc(N端249-667氨基酸残基)，其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB／c小鼠，按常规方法制备单克隆抗体，并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果 筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株，IgG亚类鉴定1株为IgG1，2株为IgG2a，经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论 获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体。为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

抗人ζ珠蛋白链不同表位单克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备和鉴定抗ζ珠蛋白链单克隆抗体。方法 用纯化的重组ζ珠蛋白链免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与NS-1细胞融合制备杂交瘤,经重组的ζ珠蛋白链筛选和3次克隆化,从制备的腹水中纯化单克隆抗体。结果和结论 获得3株杂交瘤细胞1A12、3H9及4D11,其分泌单抗的亚型分别为IgG2a、IgG1和IgG1;双抗体夹心ELISA结果证明3株单抗均可结合重组的及东南亚(--^SEA)缺失型地中海贫血基因携带者血中的ζ珠蛋白链,且其中1A12和3H9识别的位点为不同表位。这三株抗体将为筛选地中海贫血基因携带者的免疫检测提供有力工具。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上,制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段S1c(N端249-667氨基酸残基),其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定1株为IgG1,2株为IgG2a,经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体,为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

抗人IgM单克隆抗体的制备及其特征研究

以人IgM作为抗原免疫Balb/C小鼠,采用杂交瘤技术获得5株分泌抗人IgM单抗的杂交瘤细胞株.通过酶联免疫吸附试验、免疫双向扩散试验证明:该组单抗仅与人IgM起反应,而不与其他各类免疫球蛋白反应。间接免疫荧光试验证明:该组单抗测得不同人群外周血淋巴细胞阳性数与用抗B细胞单抗和直接免疫荧光法测得的结果接近.免疫转印试验证明抗体作用的分子量为50～70kd(dalten法定单位为u,换算系数0.9921,下同).提示为IgM.本文还对单抗应用价值进行了讨论。     

PREPARATION OF ANTI-IDIOTYPIC ANTIBODIES SPECIFIC FOR ANTI- HEL AND ANALYSIS OF THEIR FUNCTIONAL MIMICRY

Objective. This study is to investigate the functional mimicry by using anfi-idiotypic antibodies of enzymes. Methods. Monoclonal anti-idiotypic antibodies against anfi-HEL(hen egg-white lysozyme, HEL) antibodies were obtained by fusion of Sp2/0 myeloma ceils with spleen ceils of syngeneic mice immunized with monoclonal anti-HEL antibodies against HEL‘s different antigenic epitopes. Then bacteriolysis of the anti-idiotypic antibodies were ohserved. Results. Eight hybridomas strains secreting anti-idiotypic antibodies were observed and characterized. It was shown that two of eight anti-idiotypic antibodies secreted by two hybridomas( 1A10C9 and 2AllC1B3) could mimic HEL catalytic activity to lyse Micrococcus lysodeikticus and that the catalytic effect of mixed anti-idiotypic antibodies of 1A10 G9 and 2A11C1B3 was stronger than that of one of them, but less than HEL. Conclusion. The results demonstrated that the anti-idiotypic antibodies that could mimic enzyme activity existed in the idiotype network during anti-enzymatic immune response.