细胞因子GM-CSF和结核杆菌Ag85A融合表达载体的构建与鉴定

目的：构建并鉴定细胞因子GM—CSF和结核杆菌Ag85A融合表达质粒，为研究新型抗结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。方法：用PCR方法从pc-mGM—CSF质粒中扩增出GM—CSF，构建于pcDNA3．1质粒上，成为pcDNA3．1-GM-CSF。从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出结核杆菌Ag85A基因序列并插入到质粒pcDNA3．1-GM-CSF上，将基因GM-CST的3’端与基因Ag85A的5’端直接连接构建融合表达质粒pcGM85A。结果：经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确。结论：细胞因子GM-CSF和结核杆菌Ag85A融合表达载体构建成功，为研制新型结核病基因疫苗奠定了基础。     

乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体的构建

目的：构建乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达质粒。方法：用PCR方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出结核杆菌HSP70基因序列,应用T－A克隆技术,克隆到质粒pGEM-T vector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( ),构建成pcDNA3.1-HSP70重组质粒,然后,再用PCR方法,从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因,并克隆到质粒pcDNA3.1-HSP70,将HBsAg基因的C端与HSP70基因N端连接,构建HBsAg和HSP70融合表达质粒pcDNA3。1－SHSP70,结果：经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确,结论：乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体构建成功。     

SARS冠状病毒核蛋白与mGM-CSF融合质粒的构建及表达

目的构建SARS冠状病毒(SARS—COV)核蛋白(N)与mGM—CSF的融合真核表达质粒，借助mGM—CSF的免疫佐剂作用，提高SARSDNA疫苗的免疫效果。方法采用PCR方法扩增N和mGM—CSF基因片段，用分子克隆和基因融合的方法将目的片段定向插入真核表达载体中，构建融合表达质粒pVAX 1／N—mGM—CSF，并以融合质粒转染细胞，用免疫细胞化学和Western Blot的方法鉴定融合质粒在体外的表达。结果经酶切鉴定及DNA序列测定证实融合质粒构建正确，细胞转染实验表明，融合质粒能在COS-7细胞中表达。结论成功构建SARS—COV核蛋白与mGM—CSF的融合表达质粒，重组质粒能在真核细胞内表达。     

以HBc颗粒为呈现载体的真核表达载体pcDNA3．1-HBc^Hhel的构建

目的构建含乙肝核心C基因的真核表达载体pcDNA3．1-HBc^Hhel探索其作为DNA疫苗载体的可能性。方法采用分子克隆技术在原核表达质粒pTrc—core的HBcAg el—loop处添加Nhel酶切位点，双酶切此重组载体pTrc-core^Nhel及真核表达载体pcDNA3．1，产物经纯化、T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选抗Amp^＋克隆并提取质粒进行酶切及PCR鉴定。结果成功构建了真核表达质粒pcDNA3．1-HBc^Hhel。结论该重组质粒可作为治疗性及预防性疫苗的候选载体，为深入研究预防性及治疗性疫苗奠定了基础。     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2真核表达载体的构建及在SHG-44细胞的表达

目的：为探讨O-糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用和功能，构建pcDNA3／ppGalNAc-T2真核表达质粒并转染人神经胶质瘤细胞SHG-44。方法：采用PCR技术从pDONR201-T2得到ppGalNAc—T2全长编码序列，亚克隆至真核表达载体pcDNA-3．1，脂质体介导基因转染人神经胶质瘤细胞SHG-44细胞，采用RT—PCR法检测重组质粒的表达。结果：酶切图谱分析和基因测序证实pcDNA3．1-T2真核表达质粒构建成功。RT-PCR显示转染细胞有12的表达。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1-T2，并成功转染入SHG-44细胞，为进一步研究ppGalNAcT2的功能奠定了基础。     

乙型肝炎病毒S与GM—CSF融合基因在HepG2细胞中的表达

目的研究粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)对乙型肝炎DNA疫苗的免疫增强作用。方法采用PCR方法，扩增乙型肝炎S基因约680bp的片段和GM—CSF(包括甘氨酸接头)基因450bp的片段。通过基因定向克隆技术，构建融合基因真核表达质粒pcDNA3．1-S-GM-CSF，并在HepG2细胞中表达。结果经酶切、PCR及DNA测序鉴定，融合基因表达质粒pcDNA3．1-S-GM-CSF成功构建。将其转染HepG2细胞后，RT-PCR检测目的基因的转录，表达的融合蛋白能与抗-HBs、抗-GM-CSF单克隆抗体(mAbs)均产生特异性反应。结论融合基因表达载体pcDNA3．1-s-GM-CSF的成功构建并表达，为进一步研究乙型肝炎融合基因疫苗奠定了一定实验基础。     

真核表达质粒pcDNA3-hsp70的构建及鉴定

目的：构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3—hsp70。方法：用基因释放刑提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR扩增、获得hsp70目的基因后，与pcDNA3载体进行连接重组。结果：pcDNA3—hsp70真核表达质粒构建完成后，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定，证实其构建成功。结论：pcDNA3—hsp70真核表达质粒的成功构建，为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3—hsp70DNA疫苗奠定了基础。     

优化密码沙眼衣原体主要外膜蛋白基因的设计合成与表达

目的：设计合成优化密码沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP）基因，克隆构建优化密码MOMP(HuMOMP)基因的真核表达质粒及EGFP—HuMOMP融合基因表达质粒。方法：利用软件分析比较鼠肺炎沙眼衣原体(MoPn)与人类等哺乳动物基因组密码子使用的差异，根据所得数据对MOMP基因进行优化设计与合成。双酶切pUC—HuMOMP质粒，游离HuMOMP片段，定向克隆入pcDNA3的相应位点，构建重组真核表达质粒pcDNA3-HuMOMP；双酶切游离pcDNA3-HuMOMP中的HuMOMP片段，定向克隆入pEGFP—Cl的相应位点，构建重组真核表达质粒pEGFP—HuMOMP；pEGFP-HuMOMP质粒体外脂质体转染COS—1细胞，24h后观察荧光蛋白的表达。结果：合成的HuMOMP基因全长1125bp，经DNA测序无误。酶切鉴定pcDNA3-HuMOMP及pEGFP—HuMOMP质粒获得预期分子量DNA片段：EGFP—HuMOMP融合基因在COS—1细胞中获得明显表达，表达产物定位于胞浆。结论：设计合成的优化密码HuMOMP基因能够在哺乳动物细胞中成功表达。     

空肠弯曲菌Pen:19 cadF基因真核表达重组质粒的构建与表达

目的：构建空肠弯曲菌Pen：19cadF基因真核表达重组质粒，并证实其能在COS-7细胞中表达。方法：以含有KpnI和EcoRI酶切位点的同一对引物行PCR反应，获得空肠弯曲菌Pen：2、Pen：8、Pen：19和Pen：21cadF基因DNA片段。并选择与格林-巴利综合征最为相关的空肠弯曲菌Pen：19PCR产物为目的基因片段，插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，以构建重组质粒pcDNA3．1（＋）-cadF。重组质粒经双酶切、PCR反应鉴定和DNA双向测序确认后转染至COS-7细胞。运用RT-PCR方法检测重组质粒在细胞mRNA水平的表达。结果：双酶切反应、PCR反应和DNA双向测序证实cadF基因插入成功。采用RT-PCR方法能够从重组质粒转染的COS-7细胞中扩增出与目的基因大小一致的DNA片段。结论：空肠弯曲菌Pen：19cadF基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-cadF构建成功，并能在COS-7细胞中表达。为空肠弯曲菌DNA疫苗的研究奠定了良好的基础。     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

重组人血管抑素表达载体的构建及在人肝癌细胞系中的表达

目的：构建重组人血管抑素（hANG）的表达载体并检测其在肝癌细胞系中的稳定表达. 方法：利用RT-PCR从人胚胎肝组织中扩增出hANG cDNA片段,将其克隆到pCR-Blunt Ⅱ-TOPO载体和pcDNA3.1（＋）表达载体,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的hANG基因片段及重组载体进行验证. 将重组pcDNA3.1-hANG真核表达载体转染到人肝癌细胞SMMC-7721对其表达状况进行检测. 结果：所获得的hANG片段（1.1 kb）序列与报道的序列完全一致. 酶切鉴定的结果表明含血管抑素基因的重组pcDNA3.1-hANG表达载体构建成功. 转染重组pcDNA3.1-hANG的人肝癌细胞SMMC-7721表达了血管抑素. 另外,从生长曲线结果来看,转染pcDNA3.1-hANG真核表达载体和空载体的人肝癌细胞SSMC-7721和未转染的SSMC-7721细胞的生长速度无明显差别. 结论：成功地构建了重组人血管抑素真核表达载体并获得能稳定表达人血管抑素的SSMC-7721肝癌细胞,为开展下一步的实验奠定了基础.     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。     

插入CpG序列和IL—2基因的HBV重组真核表达载体的构建

目的：构建插入CpG序列和IL-2基因的HBV重组真核表达载体。方法：采用PCR产物直接克隆方法,构建了编码HBsAg基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1^ -HBsAg;并以此为基础通过重组DNA技术分别构建了在不同位置含不同数目的CpG序列的重组质粒pcDNA3.1^ -S/CpG1、pcDNA3.1^ -S/CpG2、pcDNA3.1^ -S/CpG1 CpG2及IL-2和HBsAg融合基因的表达载体pcDNA3.1^ -S/IL-2。通过脂质体基因转移技术导入Cos-7细胞中检测其瞬间表达。结果：通过酶切、PCR及测序证实已分别正确完整地插入IL-2基因和CpG序列,体外转染Cos-7细胞后可见基因的表达和分泌,结论：本实验成功构建了我们所设计的5种重组质粒,拟为今后探索优化基因疫苗的设计及HBV治疗性疫苗的研究奠定基础。     

梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd在Hela细胞中的表达及鉴定

目的 构建梅毒螺旋体（Tp）外膜蛋白甘油磷酸二酯磷酸二酯酶基因（Gpd）的真核表达载体peDNA3．1（＋）-Gpd，鉴定其在Hela细胞的表达，为开展TpDNA疫苗动物实验打下基础。方法 用PCR从TpNichols株基因组中扩增Gpd基因，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-Gpd，脂质体介导转染入Hela细胞，以免疫组化及跳tern-blot检测在Hela细胞中的表达。结果 双酶切及DNA测序显示重组质粒含有1059bp的目的基因片段，读码框架正确，无突变。该重组质粒在Hela细胞能有效表达分子量为41kDa的目的蛋白，重组蛋白能-9梅毒螺旋体阳性血清反应。结论 构建的质粒peD-NA3．1（＋）-Gpd成功地在体外真核细胞中表达。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步研究

目的：构建、制备Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白D重组质粒DNA疫苗,初步检测其诱导机体产生体液免疫应答的效果,为HSV-1新型疫苗奠定基础。方法：用PCR的方法从HSV－1病毒基因组中扩增糖蛋白D（glycoprotein D,gD)基因,利用基因重组技术构建重组质粒;将重组质粒体外转染真核细胞COS－7,Western blotting检测表达产物;于BALB／C小鼠后腿胫前肌注射免疫,0、2周名免疫1次,100μg/次。初次免疫后0,2,4,6周眼眶采血,ELISA间接法检测抗体。结果：重组质粒酶切出相应大小片段,经测序证实为HSV－1gD序列。Western blotting证实能够在体外真核细胞中表达。免疫小鼠后,产生特异性抗体,抗体滴度1：2000。结论：HSV-1gD重组质粒DNA有可能作为HSV－1的DNA疫苗,用于防治HSV－1感染及其相关疾病。     

人真核表达质粒载体pcDNA3.1-hOPG的构建及体外表达

目的 构建表达人骨保护素基因（hOPG）的真核表达质粒pcDNA3．1-hOPG，并检测其在体外的表达，为治疗破骨细胞功能异常引起的骨吸收提供实验基础。方法 从MGC：29565上获得hOPG基因片段并用PCR方法扩增，将其连接于真核表达质粒pcDNA3．1（-），测定序列后，用脂质体包裹转染C2C12细胞，采用免疫组化和骨吸收抑制实验检测OPG的表达及功能。结果 经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确，该质粒在体外转染C2C12细胞后可表达功能性OPG蛋白。结论成功构建的pcDNA3．1-hOPG重组质粒能在体外表达OPG蛋白。     

人核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其体内外抗瘤效应研究(英文)

目的构建人核心蛋白聚糖(human decorin,hDCN)pcDNA3.1(+)真核表达载体,并探讨其对S180细胞在体内、体外的抗肿瘤效应及其作用机制。方法用PCR法从pPIC9K-DCN扩增hDCN核心蛋白分子编码序列的全长cDNA,与pcD-NA3.1(+)载体连接。将重组pcDNA3.1(+)-DCN质粒通过脂质体转染法转入小鼠肿瘤细胞S180中,用G418筛选出阳性克隆细胞,RT-PCR、双酶切及测序鉴定。流式细胞仪对转染了重组质粒pcDNA3.1(+)-DCN、空质粒pcDNA3.1(+)的S180细胞和未转染的S180细胞进行细胞凋亡检测和细胞周期分析。分别注射等量的pcDNA3.1(+)-DCN/S180、pcDNA3.1(+)/S180的细胞和未转染质粒的S180细胞到随机分组的小鼠腋部皮下,观察三组小鼠的肿瘤生长情况;处死三组小鼠后,分别剥离肿瘤组织做病理学检查。结果转染了DCN的S180细胞凋亡指数明显增高,G0/G1期细胞百分率明显高于其他两组,G2/M期、S期细胞百分率分别明显低于其他两组(P<0.01)。与注射pcDNA3.1(+)/S180和S180的小鼠相比,注射pcDNA3.1(+)-DCN/S180的小鼠肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤体积小于其他两组(P<0.01)。结论成功构建了人核心蛋白聚糖真核表达载体。体外实验结果显示转染该表达载体的S180细胞凋亡指数明显增高,且凋亡多发生在G0/G1期;转染DCN表达载体的S180细胞在实验动物体内成瘤性降低,提示转染DCN在实验动物体内外都能表现抑瘤效应。     

人宫颈癌Ca Ski 细胞 IL-24基因的克隆鉴定与真核表达

目的:克隆人IL-24基因并构建真核表达载体,转染Ca Ski细胞进行真核表达.方法:利用RT-PCR技术扩增出Ca Ski细胞中的IL-24基因.将IL-24基因克隆人pcDN3.1( )中,构建真核表达质粒pcDN3.1( )-hIL-24的表达.结果:PCR及测字结果均证实在功克隆了人IL-24,该质粒被转染人Ca Ski细胞中能表达出hIL-24蛋白.结论:成功构建了hIL-24基因的真核表达载体.     

人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建及对NIH3T3细胞的转染

目的: 构建pcDNA3. 1( )-mtDNA真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞.方法: 提取大肠癌细胞株(SW480,Lovo,HT29)mtDNA,扩增D-loop区,产物用DNA自动测序法进行序列分析.利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3. 1( ),并用脂质体法导入NIH3T3细胞.结果: 大肠癌细胞株SW480,Lovo,HT29细胞mtDNA D-loop分别有10,9,8个突变位点.成功克隆1119 kb的mtDNA D-loop区至表达质粒pcDNA3. 1( ),并导入NIH3T3细胞中.结论: 成功构建了pcDNA3. 1( )-mtDNA真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中.