靶向GPC3的CAR-T细胞治疗肝癌研究进展

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）是治疗肿瘤的新型免疫疗法,磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)在肝癌（HCC）组织中高表达,是治疗HCC的理想靶标,靶向GPC3的CAT-T细胞治疗HCC效果显著,被认为是最具潜力的免疫疗法之一。本文对靶向GPC3 CAR-T细胞治疗HCC的最新研究进展进行综述。     

GPC3特异性HLA-A11限制的T淋巴细胞表位肽免疫活性检测

目的设计合成人类白细胞抗原（HLA）-A11限制性T细胞识别的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）多肽,并检测其免疫原性和反应性。方法利用BIMAS和SYFPEITHI评分系统评价GPC3多肽与HLA-A11分子的结合能力,预测出相应的抗原谱,合成HLA-A1101限制性GPC3多肽库;流式细胞仪检测HCC患者HLA-A11分子的表达;多肽刺激外周血淋巴细胞,酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测T细胞对GPC3多肽的反应性。结果流式细胞仪检测32例HCC患者,7例HLA-A11分子表达阳性（21.9%）;ELISPOT检测发现17例（53.1%）HCC患者的T细胞应答阳性,7例（21.9%）HLA-A11表型检测阳性的HCC患者,T细胞应答结果成强阳性。HLA-A11限制性GPC3多肽应答率符合人群中相应基因位点的自然表达率。结论 GPC3多肽设计合理,具有良好的免疫原性和反应性。     

应用组织芯片技术检测GPC3蛋白在肝细胞癌及其它肿瘤中的表达

目的 研究GPC3蛋白在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)及其他人类常见肿瘤组织中的表达。方法 应用组织芯片及免疫组化技术检测36例HCC组织、33例HCC癌旁组织以及其他人类常见肿瘤组织及其癌旁组织中GPC3蛋白的表达。结果 ①GPC3蛋白在HCC、肺鳞癌、癌旁慢性浅表性胃炎组织中表达,而在胃癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌组织中无表达;②36例HCC组织及33例HCC癌旁组织中GPC3蛋白的表达率分别为66.7% (24/36),3.0%（1/33）,二者之间差异有显著性（P＜0.001）;③HCC组织中GPC3蛋白表达与患者年龄、性别、病理分级无相关性（P＞0.05）。结论 GPC3蛋白在HCC、肺鳞癌组织中表达,而在胃癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、宫颈癌中表达沉默,GPC3是一个值得期待的多种肿瘤特异性标志物。     

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3对原发性肝细胞癌的诊断价值评价

目的：探讨血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）对原发性肝细胞癌的诊断价值。方法：应用酶联免疫法测定35例肝细胞癌（HCC）、26例肝硬化和50例健康人血清GPC3和甲胎蛋白（AFP）水平,并分析比较两者对原发性HCC的诊断价值。结果：HCC组、肝硬化组和健康对照组血清GPC3分别为（4．16±2．35）、（3．13±1．19）和（1．92±1．23）ng·ml^-1,HCC组明显高于肝硬化组和健康对照组,差异有统计学意义（分别P=0．018和P〈0．001）。对于诊断HCC,GPC3的ROC曲线下面积为0．789,AFP为0．803;GPC3的敏感性为82．8％,特异性为56．5％;AFP的敏感性为62．8％,特异性为78．9％。GPC3与AFP联合应用诊断HCC则敏感性为91．4％,特异性为45．6％。对于I期和Ⅱ期HCC,GPC3的阳性比例（11／14）高于AFP（4／14）,差异有统计学意义（P=0．021）。结论：GPC3是一个敏感且特异的HCC标志物,检测血清GPC3有助于HCC的诊断与研究。     

β-catenin、GS及GPC3在肝细胞癌组织的表达及意义

目的观察β-连环蛋白(β-catenin)、谷氨酰胺合成酶(GS)及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)在肝细胞癌(HCC)组织的表达,探讨其对肝细胞癌的诊断价值。方法应用免疫组化EnVision法检测87例HCC、40例肝内胆管细胞癌(ICC)和70例癌旁良性肝组织β-catenin、GS及GPC表达水平。结果β-catenin、GS及GPC在HCC组织阳性率分别为72.41%、87.36%和73.56%;在ICC组织阳性率分别为70.0%、40.0%和2.5%;在癌旁良性肝组织阳性率分别为15.71%、5.71%和2.86%;β-catenin、GS及GPC3在HCC组织表达显著高于癌旁良性肝组织(P均0.05);GS及GPC3在HCC组织表达显著高于ICC组织(P均0.05)。GPC3在HCC组织不同病理分化程度差异有统计学意义(P0.05)。HCC组织β-catenin与GPC3表达呈正相关(rs=0.229,P0.05),β-catenin与GS表达无相关性(rs=0.164,P0.05),GS与GPC3表达无相关性(rs=0.153,P0.05)。结论β-catenin、GS及GPC异常表达在HCC发生、发展中具有重要作用;GS联合GPC3有助于鉴别HCC、ICC及癌旁良性肝组织。     

血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌临床诊断中的应用价值

用酶链免疫吸附试验（ELISA）测定60例原发性肝细胞癌（HCC）患者,30例肝内胆管癌（ICC）患者,30例乙肝后肝硬化（LC）患者,30例转移性肝癌（MCA）患者,30例健康者血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）蛋白的含量。采用化学发光法检测血清甲胎蛋白（AFP）的含量。 HCC组患者血清GPC3蛋白、AFP含量均显著高于其他组,差异有统计学意义（ P＜0.05）,当以3.5μg/L为诊断界值时,GPC3对HCC的敏感性和特异性分别为83.3％和76.7％。 AFP联合GPC3后能将HCC的检出率由73.3％提高到88.3％。血清GPC3的浓度与患者HBV感染情况以及肿瘤大小有关,而与患者年龄、性别、肝功能、肿瘤数目以及门脉癌栓无关。血清GPC3对HCC的诊断有一定的敏感性和特异性,联合AFP检测可以提高HCC的检出率,具有临床应用价值。     

实时逆转录荧光定量聚合酶链反应检测外周血GPC3mRNA在原发性肝癌患者中的表达及意义

目的探讨实时逆转录荧光定量聚合酶链反应（RealtimeQRT-PCR）检检测外周血磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 mRNA（GPC3 mRNA）在原发性肝癌（HCC）患者中的表达意义。方法采用Realtime QRT-PCR技术分别检测37例HCC、21例转移性肝癌、22例肝硬化患者和35例体检健康志愿者外周血中GPC3 mRNA的水平。结果 HCC患者外周血GPC3mRNA的阳性率为91.8%（34/37）,表达水平为（1.5±0.9）×106copies/ml;转移性肝癌外周血GPC3 mRNA的阳性率为4.7%（1/21）,表达水平为5.2×103copies/ml;肝硬化患者GPC3 mRNA的阳性率为4.5%（1/22）,表达水平为2.6×103 copies/ml;体检健康志愿者外周血GPC3 mRNA无阳性表达。HCC患者手术前后血液中GPC3 mRNA的阳性率差异无统计学意义（P〈0.05）,但两者表达水平差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 Realtime QRT-PCR检测外周血GPC3 mRNA是诊断早期HCC血微转移可行的实验方法。     

β-catenin、GS及GPC3在肝细胞癌中的表达及意义

目的观察β-catenin、GS及GPC3在肝细胞癌中的表达,探讨它们在肝细胞癌(HCC)诊断中的价值。方法 应用免疫组化EnVision法检测87例HCC、40例肝内胆管细胞癌(ICC)和70例癌旁良性肝组织中β-catenin、GS及GPC的表达。结果 ①β-catenin、GS及GPC在HCC中的阳性率分别为72.41%、87.36%和73.56%;在ICC中的阳性率分别为70.0%、40.0%和2.5%;在癌旁良性肝组织中的阳性率分别为15.71%、5.71%和2.86%;β-catenin、GS及GPC3在HCC组织中的表达显著高于癌旁良性肝组织(P＜0.05);GS及GPC3在HCC组织中的表达显著高于ICC肝组织(P＜0.05)。②仅GPC3在HCC不同病理分化程度有统计学意义(P<0.05)。③在HCC中β-catenin及与GPC3表达呈正相关(rs=0.229,P<0.05),β-catenin及与GS的表达不具有呈不相关性(rs=0.164,P＞0.05),GS及与GPC3蛋白表达不具有相关性呈不相关(rs=0.153,P＞0.05)。结论 β-catenin、GS及GPC异常表达在HCC的发生、发展中具有重要作用;GS联合GPC3有助于鉴别HCC、ICC及癌旁良性肝组织。     

GPC3与AFP在肝硬化异型增生结节及肝细胞癌中的表达及意义

目的观察GPC3、AFP在肝硬化高度异型增生结节及肝细胞癌中的表达,探讨其在肝细胞癌诊断及鉴别诊断中的作用及意义.方法应用免疫组织化学Envision法检测GPC3、AFP在肝硬化高度异型增生结节、肝细胞癌及正常肝组织中的表达.结果 GPC3在进展期HCC中的表达阳性率为86.36%（38/44）,在高分化HCC中的表达阳性率为68.18%（15/22）,在肝硬化伴高度异型增生结节中的表达阳性率为45%（9/20）,在正常肝组织中无阳性表达（0/20）.AFP在进展期HCC中的表达阳性率为47.72%（21/44）,在高分化HCC中的表达阳性率为27.27%（6/22）,在肝硬化伴高度异型增生结节中的表达阳性率为15%（3/20）,在正常肝组织中无阳性表达（0/20）.结论 GPC3是一个较敏感及特异的标记物,可以和AFP联合应用协助诊断肝细胞癌.     

GPC3、VEGF、nm23对肝细胞癌转移的诊断评价

目的评价磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）、血管内皮生长因子（VEC,F）、转移抑制因子（nm23）在肝细胞癌转移中的诊断价值。方法采用免疫组织化学技术检测3标记物在54例HCC组织（27例HCC转移、27例HCC未转移）中的表达,比较单项和多项蛋白联合检测的准确性。结果3标记物在HCC转移组和未转移组中阳性表达率差异有统计学意义（P〈0．05）。单项检测GPC3、VEGF、nm23的ROC曲线下面积（AUC）为0．646（P〈O．05）、0．838（P〈0．05）、O678（P〈0．05）。任意2指标联合检测有助于提高HCC转移组的检出率,其中以GPC3和nm23组合最能提高诊断敏感性和特异性,3指标联合应用时,检出率迭100％。结论合理选择多指标联合检测对HCC复发转移的判断有重要意义。     

DLK1和GPC3在不同肝组织的表达及其临床意义

目的探讨脂肪前体细胞因子1(delta drosophila homolog-like1或delta-like1 homologue,DLK1)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3)在原发性肝细胞性肝癌(HCC)中的表达状况及其临床意义。方法分别应用免疫组化S-P法和原位杂交的方法检测HCC150例、肝硬化50例、肝炎组织50例和正常肝组织10例中DLK1和GPC3的表达。结果 DLK1和GPC3在HCC﹑肝硬化﹑肝炎和正常肝组织中的表达差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 DLK1和GPC3的异常表达与肝癌的发展密切相关,DLK1和GPC3之间具有相关性,两者在肝癌的发生发展过程中起非常重要的作用。     

血清 GPC3、GS 和 HSP70检测在乙肝相关肝癌诊断中的应用

目的：探讨磷脂酰肌醇聚糖3（glypican3,GPC3）、热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS）在血清中的浓度及对乙肝相关肝癌（HCC）的诊断价值。方法收集100例乙肝相关HCC患者（ HCC组）、20例乙肝肝硬化者（肝硬化组）、20例慢性乙肝患者（慢性乙肝组）及20例正常健康人（正常对照组）血清,用ELISA方法检测GPC3、GS、HSP70的水平。结果 HCC组血清GPC3水平与其余3组差异有统计学意义,GPC3诊断乙肝相关肝癌ROC曲线示AUC为0．697,敏感度84．21％,特异度55．1％。 HCC组与肝硬化组及慢乙肝组间血清GS水平差异无统计学意义,GS诊断乙肝相关肝癌ROC曲线示AUC为0．603,敏感度46．67％,而特异度79．66％;HCC组与其余3组血清HSP70水平差异有统计学意义,HSP70诊断乙肝相关肝癌ROC曲线示AUC为0．725,敏感度58．06％,特异度89．55％;针对AFP＜200 ng／mL的HCC患者,仅HSP70的血清检测AUC达0．725,其他指标对于小肝癌的诊断AUC均未达0．7。结论 ELISA法检测血清GPC3、GS、HSP70水平对诊断乙肝相关肝癌无临床实际价值。     

GPC3对AFP阴性乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的诊断价值

目的 评价磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)在血清甲胎蛋白(AFP)阴性乙型肝炎病毒(HBV)相关原发性肝细胞癌(hepatocellular carlinoma,HCC)中的诊断价值.方法 应用免疫组织化学染色检测426例手术及179例肝穿刺活检的HBV相关HCC患者肝组织GPC3 (GPC3L)的表达,并检测其血清AFP及血清GPC3 (GPC3S)水平.结果 GPC3L可特异地表达于HCC细胞,而癌旁组织及肝硬化结节中无表达.手术切除的HCC组织中80.0％(341/426)为GPC3L阳性,且不同HCC分化程度之间GPC3阳性率差异无统计学意义(P＞0.05).穿刺活检的HCC组织中74.9％(134/179)为GPC3L阳性.AFP≥400 μg/L对诊断HCC的敏感度为25.4％.AFP阴性和AFP≥400μg/L的HCC患者GPC3L阳性率分别为77.4％(328/424)和81.2％(147/181).GPC3L和AFP无相关性.在AFP＜400μg/L组GPC3S为(12.63±1.63) μg/L,在AFP≥400 μg/L组为(20.20±2.11) μg/L,明显高于对照组的(1.92±0.32) μg/L,P＜0.01.以GPC3S cut-off值为3.5 μg/L,其在全部患者、AFP≥400 μg/L和AFP阴性的HCC患者中的敏感度及特异度分别为54.6％和75.0％、54.6％和80.0％、80.0％和76.0％.结论 GPC3L可作为鉴别诊断AFP阴性HCC与肝硬化良性结节标志物,血清AFP与GPC3S的联合检测可提高HCC的早期诊断率.     

沉默Glypican-3基因增强人肝癌细胞HepG2对5-FU致凋亡作用的敏感性

目的沉默人肝癌细胞HepG2的GPC3基因表达,观察其对5-氟尿嘧啶（5-FU）的药物敏感性及细胞凋亡情况的影响。方法①构建干扰GPC3的shRNA载体,将其转染至肝癌细胞,并设立对照组。（2）Western blot测定GPC3蛋白表达情况。③利用MTT法测定转染后肝癌细胞对5-Fu的药物敏感性。④采用流式细胞技术观察转染后肝癌细胞在5-Fu作用下的细胞凋亡情况。结果转染shRNA的肝癌细胞其GPC3表达阴性;其对5-Fu的药物敏感性增加（P〈0．05）;细胞凋亡较对照组增加（P〈0．05）。结论GPC3的高表达在肝癌细胞中起到抗凋亡作用,而下调GPC3可作为一个潜在的靶目标,增加肝癌细胞对5-Fu诱导细胞凋亡的敏感性。     

抗人GPC3单克隆抗体在肝脏肿瘤组织学检测中的应用

目的应用抗人GPC3单克隆抗体检测肝脏良、恶性肿瘤组织中GPC3蛋白的表达。方法采用自制鼠抗人GPC3单克隆抗体及免疫组织化学技术检测19例正常肝组织、94例肝细胞癌(HCC)组织、20例胆管细胞癌组织、42例肝脏良性肿瘤组织中GPC3蛋白的表达,并分析GPC3蛋白表达水平与HCC患者临床病理参数的关系。结果 GPC3蛋白在肝细胞癌组织中阳性率达到79.8%,而血管瘤旁正常肝组织、胆管细胞癌组织和肝脏良性肿瘤组织中均不表达,差异具有统计学意义(P<0.001)。HCC组织中GPC3蛋白的表达与血清AFP水平(P=0.020)、是否伴有门静脉癌栓(P=0.050)、有无包膜等因素相关(P=0.043)。结论抗人GPC3单克隆抗体可特异性检出肝细胞癌组织GPC3蛋白的表达,值得进一步研究以应用于临床诊治。     

应用组织芯片技术检测GPC3蛋白在肝细胞癌及其他肿瘤中的表达

目的 研究GPC3蛋白在肝细胞癌(hepatocellular careinoma,HCC)及其他人类常见肿瘤组织中的表达.方法 应用组织芯片及免疫组化技术检测36例HCC组织、33例HCC癌旁组织以及其他人类常见肿瘤组织及其癌旁组织中CPC3蛋白的表达.结果 (1)GPc3蛋白在Hcc、肺鳞癌、癌旁慢性浅表性胃炎组织中表达.而在胃癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌组织中无表达;(2)36例HCC组织及33例HCC癌旁组织中GPC3蛋白的表达率分别为66.7%(24/36),3.0%(1/33),两者之间差异有显著性(P<0.001);(3)HCC组织中GPC3蛋白表达与患者年龄、性别、病理分级无相关性(P>0.05).结论 GPC3蛋白在HCC、肺鳞癌组织中表达,而在胃癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、宫颈癌中表达沉默,GPC3是一个值得期待的多种肿瘤特异性标志物.     

肝细胞癌CT动态增强密度与肿瘤分化程度、CD34、CK19、GPC3、P53、Ki67表达的多因素相关性分析

目的探讨肝细胞癌（HCC）螺旋CT多期扫描动脉期、门脉期强化值与肿瘤分化程度、CD34、CK19、GPC3、P53、Ki67表达的相关性。方法 67例经病理证实的HCC患者进行CT多期扫描,分别计算67个癌灶的动脉期强化值和门脉期强化值。肝穿刺组织进行HE染色和免疫组化法检测,评定肿瘤分化程度、CK19、CD34、GPC3、P53、Ki67表达强度。对HCC动脉期、门脉期强化值与上述细胞因子表达关系进行多元线性回归分析,筛选、建立理想的多元线性回归方程。结果 67个癌灶呈＂快进快出＂表现,符合典型的HCC CT表现特征。HCC动脉期强化值为（38.9±13.1）HU;多元线性回归方程为：动脉期强化值=27.381-10.0161×CK19＋4.245×CD34＋3.503×GPC3。HCC门脉期强化值为（44.7±11.7）HU;多元线性回归方程为：门脉期强化值=26.869＋8.809×CK19＋4.800×CD34＋3.610×GPC3。结论多期增强扫描可反映多种细胞因子的表达、HCC的生物学特性。     

过表达CLEC5A基因抑制肝细胞癌增殖和转移并逆转上皮-间质转化

目的 研究C型凝集素结构域家族5成员A（CLEC5A）对肝细胞癌（HCC）增殖、迁移和侵袭能力以及上皮-间质转化（EMT）特性的影响,探索CLEC5A在HCC发生发展过程中的作用及机制。方法 采用免疫组化实验检测CLEC5A在50例HCC组织和癌旁组织中的表达特点,并分析其与HCC肝癌临床病理参数的相关性;通过慢病毒转染构建CLEC5A过表达HCC细胞,分别采用细胞增殖实验（CCK-8法、EdU法）、细胞迁移和侵袭实验（Transwell法）和Western blot实验检测CLEC5A对HCC细胞增殖、迁移及侵袭能力以及EMT标志物表达水平的影响。结果 CLEC5A蛋白在HCC癌组织中的表达低于癌旁组织,其表达水平与患者的肿瘤大小（P=0.008）、肿瘤数量（P=0.010）、肿瘤分化程度（P=0.016）、BCLC分期（P=0.040）和微血管侵犯（P=0.024）等相关;过表达CLEC5A能够抑制HCC细胞的增殖、迁移及侵袭能力,并逆转HCC细胞的EMT特性。结论 CLEC5A是HCC潜在的抑癌基因,有望成为该疾病新的治疗靶点。     

乙型肝炎病毒X基因变异的研究现状

原发性肝细胞癌（HCC）是世界范围内肿瘤导致死亡的最主要原因之一．我国HCC发生与慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染密切相关，HBV基因编码的HBVX蛋白（HBx）为HBV感染和复制所必需．并广泛涉及宿主细胞的增殖、转化和凋亡等过程。因此在HCC发生、发展中可能具有重要的作用。新近研究结果征实肝癌组织中存在着高频自发的HBx基因突变．     

肝细胞肝癌重要表面标志的表达和定位

目的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见恶性肿瘤。作为其主要标志分子的甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)表达具有一定局限性,临床需要联合其他标志分子以提高诊断准确性。文中旨在探讨若干候选生物标志物在中国人源HCC细胞和正常肝细胞中的表达和定位。方法采用直接或间接免疫荧光染色方法,探讨角蛋白(cytokeratin,CK)、去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor1,ASGR1)和ASGR2、细胞表面分子(GPC3、CD90、CD133和EpCAM)等7种主要HCC表面标志分子在Bel-7402、Bel-7404和SMMC-7721等人HCC及正常肝细胞HL-7702的表达与定位情况。结果 CK、ASGR1和ASGR2在所有的肝来源细胞均表达;GPC3仅在HCC细胞表达。CD90、CD133和EpCAM仅在少量肝肿瘤干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)表达。结论 CK、ASGR1和ASGR2为肝细胞标志,GPC3是HCC相关标志;CD90、CD133和EpCAM仅在极少数肝肿瘤干细胞表达。