Tet-On调控自杀基因治疗系统对乳腺癌细胞的DNA损伤效应

目的:研究重组腺相关性病毒( rAAV)介导的含有Tet-On调控元件的HSV-TK/GCV自杀基因调控治疗系统对人类乳腺癌细胞株MCF-7 DNA损伤的影响及损伤应答的分子机制.方法:彗星实验检测HSV-TK/G CV自杀基因治疗系统对MCF-7 DNA损伤的影响,并对主要的DNA损伤应答的相关活性基因和表达蛋白进行...     

氧相关HRE启动子控制下表达hVEGF165基因重组2型腺相关病毒的获得及鉴定

目的包装及鉴定低氧反应元件（HRE）启动子控制下缺氧诱导目的基因hVEGF165基因表达的2型重组腺相关病毒。方法磷酸钙三质粒共转染方法将pAAV—HRE9-VEGF165、pAAV—Rep／cap、pHelper质粒转染HEK293T细胞，制备2型重组腺病毒相关病毒（rAAV2）。分离培养S—D大鼠心肌细胞，转染rAAV，细胞固定后做免疫细胞荧光染色，检测细胞内血管内皮细胞生长因子（VEGF165）蛋白的表达。结果pAAV—HRE9-VEGF165质粒经测序鉴定，结果与NCBIGenBank公布的人VEGF165 eDNA核苷酸序列（AB021221）完全一致，含HRE启动子及目的基因hVEGF165的2型重组非复制型腺相关病毒包装成功，可感染原代培养的大鼠心肌细胞，缺氧可诱导VEGF165蛋白表达。结论成功包装并鉴定了rAAV—HRE9-hVEGF165载体，可有效转染心肌细胞，VEGF165基因的适时表达，为缺血性心肌疾病的“分子搭桥”治疗提供了更可能的安全性。     

靶向性双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞的杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的前药/血管内皮生长因子受体(KDR)启动子-双自杀基因系统对血管内皮细胞的杀伤作用。方法 应用PCR扩增出KDR启动子、CD基因、TK基因序列,构建pKDR-CDglyTK质粒;以Adeasy-1系统为载体,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带KDR启动子调控下的CD与TK的融合基因腺病毒重组质粒pAdKDR-CDglyTK,重组质粒在293细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,以不同的感染复数(MOI)体外感染脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),利用重组病毒携带的绿色荧光蛋白(GFP)基因,荧光显微镜下观察重组腺病毒的感染效率,并给予不同浓度的GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),比较GCV(ganciclovir)和/或5-FC联合对转基因HUVEC细胞的杀伤作用。结果 成功构建了AdKDR-CDglyTK重组病毒,并高效地转染了HUVEC,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高。被转染的HUVEC对GCV和5-FC高度敏感。另外,MOI一定时,细胞存活率随GCV和5-FC浓度增加递减;GCV和5-FC浓度一定时,细胞存活率随MOI升高而降低。不同前药组细胞存活率结果显示:联合应用GCV+5-FC较单用GCV或5-FC对感染细胞的杀伤作用更强(P<0.05)。结论 KDR启动子-双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞具有强烈的杀伤作用,其杀伤效率与GCV和5-FC的浓度及重组腺病毒的MOI相关,联?     

腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对乳腺癌治疗作用.方法 用重组VEGFP-CD/TK-GFP基因的腺病毒体外感染表达VEGF的乳腺癌MCF-7细胞和对照组不表达VEGF的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染效率,以RT-PCR检测受感染细胞CD/TK的表达,然后给子前药环氧鸟苷(GCV)和/或5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响;用流式细胞术观察细胞周期变化.建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,采用瘤内注射腺病毒载体联合腹腔内注射前药GCV和/或5-FC治疗后,观察肿瘤生长情况.结果 腺病毒对两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增.RT-PCR检测发现转染Ad-VEGFP-CD/TK的MCF-7细胞有目的 基凶的表达,而乳腺上皮细胞无表达.MTT法检测显示表达VEGF的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达VEGF的乳腺上皮细胞对前药不敏感,CD/TK融合基因对MCF-7的疗效优丁任一单自杀基因(P＜0.01).在感染复数为100时,用流式细胞仪分析细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞减少.在MCF-7裸鼠移植瘤模型中.该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的牛长.其疗效优于任一单自杀基因(P<0.01).结论 腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因联合GCV和5-FC能有效治疗乳腺癌,其效果优于单自杀基因系统.     

VEGF介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的靶向杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK双自杀基因体系(Ad-VEGFP-CD/TK)对乳腺癌细胞MCF-7的体内外靶向杀伤作用。方法 用重组腺病毒Ad-VEGFP-CD/TK体外感染表达VEGF的MCF-7细胞和不表达VEGF的原代培养的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染效率,然后给予前药GCV和5-FC,用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响及其旁观者效应;用流式细胞术观察细胞周期及细胞内DNA含量的变化。建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射Ad-VEGFP-CD/TK,腹腔注射前药GCV(50mg/kg•d)和5-FC(500mg/kg•d)14天,观察肿瘤生长抑制效应。结果 腺病毒对两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。MTT法检测显示表达VEGF的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达VEGF的乳腺上皮细胞对前药不敏感,且观察到该体系对MCF-7细胞明显的旁观者效应。在感染复数为100时,用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰;细胞周期分析显示治疗后细胞G0-G1期比率增多,G2-M及S期细胞减少。在MCF-7裸鼠移植瘤模型中,该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的生长。结论 VEGF启动子可调控双自杀基因体系选择性杀伤人乳腺癌细胞MCF-7并诱导细胞凋亡,并可显著抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长。     

Ad-VEGFP-CD/TK系统抑制乳腺癌细胞增殖的体内外实验研究

目的 探讨腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK双自杀基因体系(Ad-VEGFP-CD/TK)对乳腺癌细胞MCF-7的体内外靶向杀伤作用.方法 用重组腺病毒Ad-VEGFP-CD/TK体外感染表达VEGF的MCF-7细胞和不表达VEGF的原代培养的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染率,然后给予前药GCV和5-FC,用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响及其旁观者效应;用流式细胞术观察细胞周期及细胞内DNA含量的变化.建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射Ad-VEGFP-CD/TK,腹腔注射前药14 d,观察肿瘤生长抑制效应.结果 腺病毒对两种细胞的感染率相似.MTT法检测显示MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而乳腺上皮细胞对前药不敏感,且观察到该体系对MCF-7细胞明显的旁观者效应.在感染复数为100时,用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰;细胞周期分析显示治疗后细胞G0-G1期比率增多,G2-M及S期细胞减少.在MCF-7裸鼠移植瘤模型中,该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的生长.结论 VEGF启动子可调控双自杀基因体系选择性杀伤人乳腺癌细胞MCF-7并诱导细胞凋亡,并可显著抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长.     

慢病毒介导的双自杀基因对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨慢病毒介导的CDglyTK融合基因体系对人乳腺癌细胞株（MCF-7）的杀伤作用。方法 构建的重组质粒pLenti6／V5-D-CDglyTK及阳性对照质粒pLenti6／V5-D-GFP在lipofectamine2000介导下转染293FT细胞，包装、扩增后获得病毒颗粒，体外感染MCF-7细胞株，荧光显微镜下观察阳性对照质粒的感染效率并以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达，然后给予前药5-FC，GCV及5-FC＋GCW处理，观察该体系对细胞株的杀伤效应。结果 重组体对细胞株的感染率随慢病毒滴度的增高而递增。RT-PCR方法检测发现MCF-7有目的基因CDglyTK的表达。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效（P〈0．001）。结论 慢病毒为载体有较高的转染效率，MCF-7细胞对前药的具有较高的敏感性，双自杀基因疗效优于任一单自杀基因。     

双自杀基因系统诱导乳腺癌细胞凋亡的体内外实验研究

目的探讨VEGF启动子驱动的双自杀基因体系对人乳腺癌细胞MCF-7靶向治疗作用以及该体系能否诱导体内外MCF-7细胞的凋亡。方法选择表达VEGF的MCF-7细胞和不表达VEGF的原代培养的乳腺上皮细胞，用重组腺病毒Ad—VEGFP—CD／TK感染之，荧光显微镜观察其感染效率。R．T—PCR．方法检测受感染细胞目的基因的表达，给予前药GCV和5-FC后于倒置显微镜观察，采用流式细胞仪检测细胞内DNA含量的变化。建立荷人乳腺癌的裸鼠动物模型，观察各治疗组的治疗效果，应用透射电镜观察移植瘤细胞超微结构。结果携带双自杀基因和报告基因（GFP）的重组腺病毒载体，感染复数为100时，95％以上的受感染MCF-7和乳腺上皮细胞中有GFP表达。RT—PCK检测发现MCF-7细胞有目的基因的表达。而乳腺上皮细胞无表达。倒置显微镜下观察用药组细胞出现凋亡征象；用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰。在MCF-7裸鼠移植瘤模型中，治疗组裸鼠移植瘤的生长明显受到抑制，其余各组肿瘤生长情况无明显差别；在透射电镜下可见治疗组多量的凋亡细胞。结论体内外实验均表明VEGF启动子可调控双自杀基因体系靶向性诱导人乳腺癌细胞MCF-7细胞凋亡。     

慢病毒介导的双自杀基因对大肠肿瘤细胞的靶向杀伤作用

目的 研究慢病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK双自杀基因系统对大肠肿瘤细胞选择性杀伤作用.方法 构建的重组FGW-KDRP-CD/TK慢病毒载体在293T细胞包装扩增后,获得病毒颗粒,体外感染表达KDR的LOVO细胞株和不表达KDR的LS174T细胞株,以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应.结果 重组体对各细胞株的感染率相似,RT-PCR方法检测发现:除LS174T细胞外,LOVO细胞有目的基因CDglyTK的表达.LOVO与LS174T细胞株对前药敏感性有显著性差异(P＜0.001),双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(P＜0.001).结论 KDR启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR的大肠肿瘤细胞.     

VEGF165基因重组腺相关病毒构建及转染猪骨髓间充质干细胞的研究

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子（hVEGF）的重组腺相关病毒载体,在体外转染猪骨髓间充质干细胞并观察其表达。方法细胞AAV包装质粒pAAV-IRES-ZsGreen及含hVEGF的质粒经EcoRI＋BamHI双酶切、连接,构建pAAV-hVEGF165-IRES-ZsGreen载体,采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获得rAAV2-hVEGF165及对照重组腺相关病毒,real-timePCR法测定病毒效价。Westernblot检测重组rAAV2-hVEGFl65在猪骨髓间充质干细胞的表达,MTS法检测VEGF蛋白活性。结果成功构建rAAV2-hVEGF165重组腺相关病毒载体,rAAV2-hVEGFl65经双酶切和测序鉴定正确,real-timePCR法测定病毒效价为5×10 12vg／ml。转染rAAV2-hVEGF165的猪骨髓干细胞能够有效表达VEGF蛋白,并能促进血管内皮细胞的增殖。结论成功构建rAAV2-hVEGFl65重组腺相关病毒载体,并能在猪骨髓间充质干细胞中有效转染和表达,为进一步探索rAAV2-hVEGF165对治疗缺血性心肌疾病的研究提供实验基础。     

促血小板生成素基因在NIH3T3细胞中表达的定量调节

目的 应用逆转录病毒载体四环素调控系统,定量调节促血小板生成素（ＴＰＯ）基因在ＮＨ３Ｔ３细胞中的表达。方法 ｐＲｅｖＴｅｔ－Ｏｎ质粒转染逆转录病毒包装细胞ＰＴ６７细胞,应用包装成Ｔｅｔ－Ｏｎ重组逆转录病毒,并将此病毒感染ＮＨ３Ｔ３细胞,建立整合入Ｔｅｔ－Ｏｎ逆转录病毒的阳性细胞株（ＲｅｖＴｅｔ－Ｏｎ３Ｔ３）,并通过强力霉素调控荧光素酶基因的表达证明此细胞株具有调控作用。构建ｐＲｅｖＴＲＥＴＰＯ重组     

MHC-Ⅰ细胞内抗体重组腺相关病毒载体的构建

目的 构建Ⅰ型主要组织相容性复合体（MHC-Ⅰ）重组腺相关病毒载体（rAAV）。方法 合成内质网滞留型MHC-Ⅰ细胞内抗体的基因片段,测序正确后酶切获取该胞内抗体的基因片段,将该基因片段插入质粒pSSHG/CMV的EcoR I-BamH I位点构建pSSHG/MHC-Ⅰ。用磷酸钙共沉淀法将腺病毒辅助质１粒pFG140、包装质粒pAAV/Ad及已构建的pSSHG/MHC-Ⅰ三质粒在293细胞系中同源重组包装rAAV。采用地高辛标记的斑点杂交方法测定rAAV滴度。结果 成功构建了重组病毒质粒pSSHG/MHC-Ⅰ及人类MHC-Ⅰ胞内抗体重组腺相关病毒载体(rAAV-MHCI),经蔗糖梯度离心法获得rAAV组分,梯度稀释测得滴度为6.88×1010PFU/mL。结论 通过分子克隆体外重组技术成功构建了rAAV-MHCI,为下一步人体细胞实验及移植免疫的基因治疗奠定了基础。     

甲胎蛋白启动子调控表达p53基因的肝癌细胞靶向性基因治疗？…

目的 利用含有人甲胎蛋白启动子的腺相关病毒载体,构建能在人肝癌细胞株中特异表达目的的基因的质粒。方法 通过设计含有特定酶切点位点的引物,选择性地从人基因组中扩增出人甲胎蛋启动子（ＡＦＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）主列并克琶含有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ报基因的质粒,ｐＲＴ－ＵＦ５上,构建成含报告基因的重组腺相关病毒质粒ｒＡＡＶ－ＡＦＰ－ＧＦＰ转染表达ＡＦＰ的Ｈｅｐ Ｇ２细胞株和不表达ＡＦＰ的２９３因的质粒ｒＡＡ     

腺相关病毒介导的人血管内皮生长因子体外转染兔骨髓内皮祖细胞

目的:探讨腺相关病毒-2(AAV-2)介导人血管内皮生长因子-165(hVEGF165)转染兔骨髓内皮祖细胞(EPCs)及其对EPCs增殖能力的影响。方法:构建携带hVEGF165基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体pAAV-hVEGF165;制备携带hVEGF165基因的rAAV(rAAV-2-hVEGF165)和携带β-半乳糖苷酶(-βgal)基因的rAAV(rAAV-2-LacZ);体外培养和鉴定兔骨髓EPCs;分别用rAAV-2-hVEGF165和rAAV-2-LacZ体外转染EPCs(AAV/VEGF-EPC和AAV/LacZ-EPC);用RT-PCR、免疫细胞化学、流式细胞术等法检测hVEGF165和-βgal的表达,MTT法检测AAV/VEGF-EPC的增殖能力。结果:经酶切鉴定和DNA测序,得到了序列正确的重组质粒pAAV-hVEGF165;AAV/VEGF-EPC能够表达hVEGF165蛋白,AAV/LacZ-EPC能够表达-βgal;rAAV-2-hVEGF165对于EPCs的转染率为64.4%;AAV/VEGF-EPC的增殖能力明显强于AAV/LacZ-EPC和EPCs。结论:EPCs可以被rAAV-2-hVEGF165高效转染,其增殖能力明显增强。本文为进一步探讨AAV/VEGF-EPC用于缺血性血管疾病治疗的可能性奠定了基础。     

新型Tet-On反式激活因子对GDNF基因腺相关病毒载体表达调控的研究

目的　通过在胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因腺相关病毒(AAV)表达载体中插入改良的Tet On调控因子,达到有目的调节GDNF的表达,避免基因过度表达或重组可能对宿主产生的危害。方法　首先在pAAV- GDNFflag前病毒质粒的hHG部分插入寡核苷酸序列,通过含相应酶切位点的引物,聚合酶链反应(PCR)扩增反式激活因子rtTA_2s S_2和四环素反应元件 (TRE),并插入寡核苷酸序列,构建pAAV- rtTA_2s -S_2- TRE -GDNFflag。与辅助质粒共转染HEK293细胞完成重组腺相关病毒(rAAV)载体的包装,氯化铯梯度超速离心分离病毒裂解液,半透膜提纯病毒载体,实时定量PCR(RQ- PCR)检测病毒效价。rAAV感染HEK293细胞,荧光显色和Western印迹法检测rtTA_2s S_2的体外调控;rAAV感染Wistar小鼠腓肠肌,酶联免疫吸附实验 (ELISA)检测GDNF基因表达的体内调控。结果　体外实验强力霉素阳性组Western印迹可见明显GDNF条带,阴性组未见;体内实验强力霉素阳性组GDNF在 2周内表达 (32 .6pg/ml±2 .6pg/ml),高于强力霉素阴性组 ( 10 .1pg/ml±2 .4pg/ml),差异有统计学意义。结论　Tet -On反式激活因子rtTA_2s S_2、TRE和GDNF基因可构建在同一AAV载体,通过调节诱导剂强力霉素的浓度,rtTA2s -S2在体内和体外均能有效调控下游目的基因GDNF的表达。     

高滴度表达抑制转录因子的重组腺相关病毒的制备

目的 获得表达小鼠抑制转录因子ROG(repressor of GATA-3)基因；构建表达ROG的重组腺相关病毒载体，制备腺相关病毒。方法 设计、合成引物，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从CTLL-2细胞总RNA中扩增ROG基因，测序成功后，最终连接于pAAV-MCS，双酶切、PCR鉴定阳性重组质粒，并在Hela细胞中表达；制备高滴度重组腺相关病毒。结果 成功扩增了小鼠ROG基因，构建表达ROG基因的重组腺相关病毒表达载体，并成功表达于Hela细胞。结论 本实验构建的小鼠ROG重组腺相关病毒将为哮喘的基因治疗研究奠定物质基础。     

Construction of Adeno-associated Virus System for Human Bone Morphogenetic Protein 7 Gene

To construct the recombinant adeno-associated virus （rAAV） vector with human bone morphogenetic protein 7 （BMP7） and observe the BMP7 mRNA expression in vitro, BMP7 CDS sequence was cloned into expression plasmid pAAV-MCS of AAV Helper Free System. The recombinant plasmid was identified with enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid, pAAV-RC, pHelper were co-transfected into AAV-293 cells according to the calcium phosphate-based protocol. The viral stock was collected by 4 rounds of freeze/thaw. After purified and concentrated, the recombinant virus titer was determined by dot-blot assay. HEK293 cells were transfected with the recombinant virus at different MOI, and the expression of BMP7 mRNA was detected by RT-PCR. The results showed rAAV-BMP7 was constructed and packaged successfully. The physical particle titer was 2.5×10^11 vector genomes/mL. There was different expression level of BMP7 mRNA after transfecton. These data suggested that recombinant AAV mediated a stable expression of hBMP7 mRNA in 293 cells. The AAV production method may pave the way of an effective strategy for the jaw bone defection around dental implants.