CFSE标记的淋巴细胞增值实验检测方法的建立

[摘要] 目的　建立基于流式细胞术和活细胞荧光染料CFSE的淋巴细胞增殖、单向混合淋巴细胞实验的免疫学检测方法。 方法　分离单个核细胞，将反应细胞经CFSE染色后，分别加入不同的淋巴细胞增殖刺激物或与灭活异基因淋巴细胞共培养。培养后细胞经流式细胞术检测标记细胞是否增殖，应用CD4-PE抗体检测增殖细胞中CD4阳性T细胞亚群比例，ModFit软件分析增殖动力模型。计算增殖CDI或PI指数。 结果　基于CFSE建立的淋巴细胞增殖实验，经不同刺激物或异基因抗原刺激后增殖指数明显升高，使用CD4-PE抗体进行再次标记后可以对增殖实验中CD4阳性淋巴细胞亚群的增殖进行评估。 结论　成功建立了基于CFSE标记淋巴细胞的增殖实验检测方法，该方法简单，实用，灵敏度高，可以取代3H或MTT用于不同条件，不同免疫刺激情况下淋巴细胞增值的检测或评估。     

罗仙子提取物对小鼠脾淋巴细胞的体外增殖及CD4~+/CD8~+比例的影响

目的研究罗仙子提取物(housefly maggots extracts,HME)对正常小鼠脾淋巴细胞的体外增殖,以及对小鼠淋巴细胞亚群CD4+/CD8+比例的影响。方法不同浓度的罗仙子提取物对刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)体外处理的小鼠脾T淋巴细胞作用,初步确定其发挥作用的最佳浓度。采用MTT法检测罗仙子提取物在不同的时间点对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖能力,运用流式细胞仪检测细胞周期的分布以及CD4+/CD8+比例。结果罗仙子提取物浓度为40μg/mL,作用48h后,能明显促进ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖,并且能降低G0/G1期细胞的百分比以及升高S期和G2/M期细胞的百分比,并以48 h效果最明显。能使CD4+、CD4+/CD8+比例降低。结论罗仙子可能通过免疫调节作用影响动脉粥样硬化。     

局部湿热联合微波消融对小鼠乳腺癌动物模型中T淋巴细胞的比例和功能的影响

目的：研究局部湿热联合微波消融对乳腺癌荷瘤小鼠脾细胞中T淋巴细胞的比例和功能的影响,并探讨其意义。方法：建立小鼠乳腺癌实验动物模型;用FACS检测局部湿热联合微波消融处理后荷瘤小鼠脾细胞中T细胞及其CD4亚群和CD8亚群的比例变化;体外增殖实验观察脾细胞中T淋巴细胞增殖功能;FACS检测T淋巴细胞IFN-γ的表达水平。结果：局部湿热联合微波消融处理组荷瘤小鼠脾细胞中T淋巴细胞的比例明显增高（P〈0.05）,其中CD4＋T细胞比例变化最显著,并且T淋巴细胞的增殖能力和IFN-γ的表达也明显增加（P〈0.05）。结论：局部湿热联合微波消融术可以较单一热疗方法更有效的抑制肿瘤生长。     

荧光染料CFSE在实验性葡萄膜炎T细胞增殖研究中的应用

目的 探讨荧光染料CFSE在实验性葡萄膜炎(EAU)抗原特异T细胞增殖研究中的应用价值. 方法 以人类光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)的多肽片段IRBP161-180为抗原,免疫B10RⅢ小鼠使其产生EAU.用CFSE荧光染料标记细胞,结合荧光单抗和流式细胞术,检测T细胞及其亚群在特异抗原刺激下,不同时间点细胞增殖的情况.结果 IRBP161-180刺激4 d后出现T淋巴细胞增殖分裂,表现为CFSE荧光强度的系列减半.使用荧光单抗双标记发现CD4+ T和CD8+ T细胞增殖反应不同步,CD8+ T细胞较CD4+T细胞增殖分裂更活跃,亲代细胞百分率下降更明显(P<0.01).结论 CFSE荧光标记技术是分析EAU抗原特异性T细胞及亚群增殖分裂的有力工具.     

局部湿热联合微波消融对小鼠乳腺癌动物模型中树突状细胞的比例和功能的影响

目的:研究局部湿热联合微波消融对乳腺癌荷瘤小鼠脾细胞中树突状细胞的比例和功能的影响,并探讨其意义.方法:建立小鼠乳腺癌实验动物模型;用FACS检测局部湿热联合微波消融处理后荷瘤小鼠脾细胞中DC细胞比例变化及其MHC-Ⅱ类分子和协同刺激分子CD80,CD86的表达水平;MTT法检测DC细胞对T淋巴细胞增殖的刺激作用;FACS检测DC细胞对T细胞的细胞因子IFN-γ,IL-4分泌的影响.结果:局部湿热联合微波消融处理组荷瘤小鼠脾细胞中DC细胞的比例明显增高,DC细胞的MHC-II类分子和协同刺激分子CD86的表达明显上调,并且DCs刺激T淋巴细胞增殖和IFN-γ分泌的能力明显增强.结论:局部湿热联合微波消融术可以较单一热疗方法更有效的增加DC细胞的比例和增强其功能.     

IFN-γ刺激培养未成熟树突状细胞免疫耐受效应机制研究

目的通过γ-干扰素(IFN-γ)刺激培养未成熟树突状细胞,研究在体外IFN-γ诱导未成熟树突状细胞免疫耐受的效应机制。方法采用经典的GM-CSF+IL-4诱导方案,以获得细胞表面缺乏共刺激分子的大鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞,经IFN-γ刺激培养后,通过外源性抗原T细胞表位pCol(28-40)多肽培养,流式细胞仪检测表面MHCⅡ类分子及共刺激分子CD80、CD86,DC表面相对特异性标记OX62的情况,将脾脏分离淋巴细胞分为3组,即对照组、imDC组和imDCIFN-γ组,采用MTT法检测各组淋巴细胞增殖情况,Anneix-V-Flous检测各组淋巴细胞凋亡,ELISA法检测体外培养脾细胞上清液Th1/Th2型细胞因子,观察体外CD4+T细胞Th亚群的分化情况。结果 IFN-γ刺激培养的未成熟树突细胞通过外源性抗原T细胞表位pCol(28-40)多肽培养后低表达表面MHCⅡ类分子(14.01%)及共刺激分子CD80(4.78%)、CD86(19.79%),同样低表达DC表面相对特异性标记OX62(15.31%,P<0.05,n=4);MTT法检测共培养的脾淋巴细胞imDC组i、mDCIFN-γ组与对照组增殖...     

羧基荧光素乙酰乙酸在移植免疫研究中的应用

目的：介绍和探讨活体荧光示踪染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA—SE)在移植免疫研究中的应用及价值。方法：以不同浓度的CFDA—SE标记小鼠脾细胞用于体内外实验。标记Balb／c(H2^d)和C57BL／6小鼠(H2^b)脾细胞行混合淋巴细胞培养，流式细胞术观察标记细胞的增殖情况。Balb／c裸小鼠(H2^d)构建移植物抗宿主(GVHR)、宿主抗移植物(HVGR)模型；通过流式细胞术检测标记细胞在外周血及脾的增殖情况。结果：荧光显微镜观察到标记细胞。流式细胞术检测到标记细胞荧光强度出现倍减现象，表明细胞发生了增殖；无抗原刺激组荧光强度无明显变化，抗原刺激后24—72h标记细胞停留在脾，第3天后增殖细胞进入外周血液。结论：羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记技术可应用于体内、体外实验，有助于对细胞增殖及定位进行检测，在移植免疫实验研究中具有很高的应用价值。     

家蚕茧壳水解物对感染小鼠生存期的影响

目的研究家蚕茧壳水解物对感染小鼠生存期的影响。方法对正常雄性BALB/c小鼠经灌胃家蚕茧壳水解物6周后,接种单核细胞增生的李斯特氏菌并观察其生存时间;MTT法分析小鼠脾细胞增殖能力;FACS(荧光激活细胞分选术)分析脾脏细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞比率。结果灌胃家蚕茧壳水解物的小鼠明显比未接种的小鼠生存期延长,中剂量组小鼠生存期延长最显著;MTT分析结果表明家蚕茧壳水解物能显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖;摄取家蚕茧壳水解物8周后CD4+T细胞和CD8+T细胞比率增高,中止灌胃后其比率逐渐恢复。结论家蚕茧壳水解物能促进小鼠脾淋巴细胞增殖,增加CD4+T细胞和CD8+T细胞比率并延长感染小鼠的生存期。     

小鼠骨髓来源树突状细胞培养鉴定和诱导T淋巴细胞增殖

目的:建立一种体外诱导培养小鼠树突状细胞(DCs)的方法,并观察其不同生长阶段生物学形态及刺激淋巴细胞增殖的能力。方法:联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)诱导培养小鼠骨髓单个核细胞向DCs分化,并从形态学、表型及功能方面对其加以检测。结果:用GM-CSF和IL-4诱导培养小鼠骨髓来源的单核细胞,3 d后可见细胞形态改变,并呈集簇生长,培养至5 d可见典型的树突状突起,体外诱导培养8 d后获得大量成熟的DCs,扫描电镜可见典型的树突状细胞形态,高表达骨髓来源DCs特异性标记CD11c和共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ,成熟DC具有很强的刺激同基因型和同种异基因型T淋巴细胞增殖的能力。结论:小鼠骨髓来源的单个核细胞体外诱导培养可生成大量成熟的DCs,为进一步抗肿瘤疫苗的实验研究奠定了基础。     

ICOS-Ig combined with CsA induces long term survival of cardiac allografts in mouse

Objective： To study the synergistic effect of ICOS-Ig combined with cyclosporine （CsA） on mouse heart transplantation and explore its therapeutic potential. Methods： ICOS-Ig fusion protein was generated by fusing the extraeellular portion of human ICOS and Fc portion of human IgG. To investigate the effect of ICOS-Ig on T-cell proliferation in vitro, ICOS-Ig or IgG was added to the primary MLR cultures （BALB/c spleen T cells as responder cells and irradiated C57BL/6 spleen cells as stimulator cells）. The cells responsiveness rates were detected by 3H-TdR methods. Then the T cells of each group in primary MLR were cultured as responder cells for secondary MLR, and irradiated C57BL/6 （donor） or C3H （third party） spleen cells as stimulator cells. To study the effect of ICOS-Ig on T-cell proliferation in vivo, CFSE-labeled C57BL/6 spleen cells were transferred to irradiated BALB/c mice. Mice were then treated with IgG, ICOS-Ig or CsA. Seventy two hours after transfer, the spleen cells of the mice were harvested for the detection of CD4^＋CFSE^＋ and CD8^＋CFSE^＋ by FACS. C57BL/6 mouse underwent transplantation of the hearts of BALB/c mouse and were then randomly divided into five equal groups： no treatment group, control lgG treated group （250 gg i.p. d2, 4, 6）, ICOS-Ig treated group （250 μg i.p. d2, 4, 6）, CsA treated group （10 mg/kg i.p. d0-6）, ICOS-Ig combined with CsA group. The cardiac allograft survival was monitored by daily palpation. Results： In primary MLR, ICOS-Ig inhibited T-cell proliferation, （inhibition ratio 58i8.2% in 50 μg/ml）. In secondary MLR, ICOS-Ig specifically inhibited donor spleen cells, which suggested ICOS-Ig could induce donor-specific hyporesponsiveness. In the CFSE dye assay, CD4^＋CFSE^＋ and CD8^＋CFSE^＋ in ICOS-Ig and CsA group was stronger than those in control group, which showed ICOS-Ig and CsA could inhibit the proliferation of allo-reactive T cells in vivo. In mouse heart transplantation model, survival was significantly prolonged in animals treated with ICOS-Ig or CsA as compared with controls. Moreover, ICOS-Ig combined with CsA group had even longer engraftment （〉100 d） than ICOS-Ig or CsA used alone. In histological examination, it was found that there were congestions and edemas in no treatment and IgG treated recipients, together with a lot of inflammatory cells infiltrated. Allogeneic hearts from ICOS-Ig and/or CsA immunized recipients revealed milder histological changes. It was revealed in mechanical analysis that splenic T cells from recipients also exhibited depressed mixed leukocyte reactions （MLR） and cytotoxic lymphocyte reactions （CTL）. Conclusion： These data suggest that ICOS-Ig combined with CsA induces a long-term survival of mouse cardiac allografts, whereas monotherapy is less effective in this regard. Thus, ICOS-Ig combined with CsA treatment may be a novel regimen to combat allograft rejection.     

荧光探针及流式分选法追踪胰腺癌细胞增殖的研究

目的 应用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（5,6-carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE）荧光探针及流式分选的方法追踪胰腺癌细胞增殖情况。方法 应用低血清培养法（0.5%）对细胞进行细胞周期同步化;利用CFSE染色追踪胰腺癌全基因组突变文库细胞增殖;并于一定的时间点,应用流式分选法分选增殖速度减慢细胞群;通过CCK-8法检测分选前后的细胞增殖曲线。结果 CFSE探针可均匀染色胰腺癌细胞,呈现较强的绿色荧光;在CFSE荧光探针染色后的不同时间点（0、48、96及144h）,胰腺癌细胞荧光强度呈现逐级衰减趋势;应用细胞饥饿法对细胞进行同步化后,细胞呈现更好的同步化衰减趋势;在一定的荧光衰减时间点（144h）,通过流式分选从细胞突变文库中获得了胰腺癌增殖减慢细胞群;CCK-8实验显示,相对于分选前的细胞,分选出的荧光强度强的胰腺癌细胞群增殖速度明显减慢（P=0.006）。结论 CFSE荧光探针可很好追踪胰腺癌细胞增殖,结合流式分选法可获得肿瘤突变文库中的增殖减慢细胞群。     

一种自制流式细胞仪专用溶血素对红细胞和白细胞作用的研究

目的：探讨自制流式细胞仪专用溶血素对血液红细胞的溶解效果和对淋巴细胞、单核细胞和粒细胞表面标志的影响。方法：应用流式细胞术对40份K3 EDTA抗凝外周血分别用自制流式细胞仪专用溶血素与FACS溶血素处理后,检测其对血液红细胞的溶解效果及对淋巴细胞、单核细胞和粒细胞表面特异性抗原CD14+、CD45+表达率的影响。结果：自制流式细胞仪专用溶血素和FACS溶血素,均能使红细胞彻底溶解,且不破坏白细胞,在流式细胞仪获取的前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)散点图中,可见清晰的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞群,其CD14+表达率分别为(1.01±0.24)%和(1.00±0.23)%、(92.80±1.98)%和(92.81±1.94)%、(91.16±3.68)%和(91.22±3.76)%;CD45+表达率分别为(98.94±0.71)%和(98.90±0.72)%、(95.15±2.73)%和(95.11±2.76)%、(99.39±0.48)%和(99.41±0.47)%,使用两种溶血素检测得到的白细胞表面标志具有很好的一致性,其差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：自制流式细胞仪专用溶血素具有很好的红细胞溶解效果,但不破坏白细胞,且对淋巴细胞、单核细胞和粒细胞群表面抗原的表达无明显影响作用。     

流式细胞术检测CIK的免疫表型和体外杀伤活性

目的：探讨细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer,CIK）的免疫表型和体外杀伤活性。 方法:从健康人外周血分离淋巴细胞,经过IFNγ、CD3McAb、IL-2诱导并培养,获得大量的CIK。采用流式细胞术检测CIK的表型;以CFSE标记靶细胞来区分效应细胞,再以ＰＩ染色,用FACS检测靶细胞的死亡率。 结果:CIK于第22天达到增殖高峰,并高度表达CD3、CD11a、CD54和HLA-DR;中度表达CD3/CD56、CD25、CD28、CD69和FasL;CD16表达不增加。CIK对肿瘤细胞K562、 HL-60、Hela、SMMC7721和A375均表现出杀伤活性,其中对K562、HL-60、Hela 3种细胞的杀伤作用较强;而对SMMC7721、A375的作用不明显。 结论:细胞因子IFNγ、CD3McAb和IL-2体外诱导的单个核细胞具有强大的增殖力和杀伤活性。     

氧化低密度脂蛋白干预记忆性CD8+T细胞亚群的分化

目的 探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对CD8+记忆性T细胞亚群分化的影响及其机制.方法 将雌性10周龄未发生糖尿病NOD小鼠随机分为2组(n=5):ox-LDL组及对照组.断颈处死各组小鼠磁珠分离脾脏CD8+T细胞体外培养(IL-2),ox-LDL组加入ox-LDL 30μg/mL体外刺激24 h,ox-LDL未处理组作为对照组.24 h后分离细胞.体外实验利用流式细胞仪检测各组以下指标:胞内CD8+IFN-γ+确定胰岛β细胞特异性杀伤性CD8+T细胞的比例;细胞表面分子CD8、CD44、CD62L确定CD8+记忆性T细胞的不同亚群分化;T细胞相关转录因子TCF-1及STAT-3的活化确定关键性转录因子的作用.体内实验中,将各组CD8+记忆性T细胞通过尾静脉注射的方法移植给未发病NOD小鼠,同时设立未移植的模型对照组,每5 d检测血糖1次,监测小鼠的血糖改变及生存率.结果 相比对照组,ox-LDL(30μg/mL)作用24 h后,胰岛β细胞特异性杀伤性CD8+T细胞活化减少[(0.7±0.03)%vs(2.7±0.14)%,P<0.01],记忆性T细胞中的效应记忆性T细胞形成数目减少[(10.3±0.71)%vs(30.3±1.36)%,P<0.01],干细胞样记忆性T细胞增加[(72.3±3.8)%vs(55.1±2.61)%,P<0.05].T细胞转录因子TCF-1及p-STAT-3活化的也受到抑制[TCF-1:(14.5±0.82)%vs(34.2±1.23)%,磷酸化STAT-3:(3.3±0.12)%vs(22.1±1.1)%,P<0.01].T细胞移植给未发病NOD小鼠后,ox-LDL处理组小鼠血糖升高明显低于对照组(P<0.05),且生存率提高(P<0.05).结论 ox-LDL干扰记忆性CD8+T细胞核转录因子TCF-1活化及STAT-3的磷酸化,抑制长效杀伤作用的效应性和记忆性CD8+T细胞形成,诱导干细胞样记忆性CD8+T细胞形成,从而阻止胰岛β细胞自身免疫损伤及□型糖尿病的发生.     

大承气颗粒药物血清对小鼠肠上皮内淋巴细胞增殖的作用*

[目的]探讨大承气颗粒药物血清对小鼠肠上皮内淋巴细胞(IELs)的增殖作用及其作用途径.[方法]分离、鉴定、培养Balb/c小鼠IELs;制备不同浓度的大承气颗粒单次灌胃大鼠的药物血清和临床等效剂量的大承气颗粒多次灌胃大鼠的药物血清,并与大黄素、大黄酚等比较,观测其对IELs增殖及IELs[Ca2+]i的作用.[结果]IELs是CD3阳性细胞为(82.76±2.61),CD8阳性细胞为(72.48±3.57),CD4阳性细胞为(9.91±2.52)的淋巴细胞.单次灌胃的药物血清和多次灌胃的药物血清均能显著刺激IELs增殖.单次灌胃的药物血清对IELs的作用与大承气颗粒的浓度、采血时间、药物血清的作用时间等有关.稀释的药物血清比其原液及正常血清原液作用强.等摩尔浓度的大黄酚、大黄素、厚朴酚的作用以大黄酚较强.大鼠正常血清、药物血清和植物血凝素均能增加IELs[Ca2+]i.[结论]大承气颗粒药物血清能显著刺激IELs增殖,其作用途径之一是增加IELs[Ca2+]i,对维护肠免疫屏障有重要意义.     

体外培养扩增CD4+CD25+调节性T细胞的实验观察

目的 观察细胞因子体外培养扩增CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的作用,以便从体外获取大量Treg细胞.方法 将从C57BL/6幼稚小鼠脾脏和淋巴结中提取的Treg与从DBA/2小鼠骨髓中提取的成熟树突细胞(mDC)混合培养,并分别加入白细胞介素-2(IL-2)、IL-4或IL-15,检测Treg增殖和凋亡的情况,与不加入任何细胞因子为对照.分别将培养获得的Treg与C57BL/6幼稚小鼠的效应性T细胞(Teff)混合培养,测定扩增后的Treg对Teff的抑制活性.检测扩增后Treg的Foxp3表达,从而证明培养获得的Treg仍保持其表型.结果 在保持其对Teff抑制活性的同时,IL-2组、IL-4组、IL-15组Treg的增殖细胞前体频率分别为31.3%、28.9%、34.5%,明显高于对照组(14.5%),均P＜0.05;增殖指数分别为1.9、1.7、1.8,明显高于对照组(1.5),均P＜0.05.IL-2组、IL-4组、IL-15组Treg的凋亡细胞比例分别为12.8%、11.4%、12.7%,均明显低于对照组(28.9%),均P＜0.05.扩增后的Treg仍高表达Foxp3(91.75%).结论 IL-4、IL-15和IL-2一样,具有促进Treg增殖、减少其凋亡的作用,并同时保持对Teff的抑制功能.扩增后的Treg仍保持其表型,高表达Foxp3.     

抗PD-1抗体的抗肿瘤效应及机制

目的 探讨抗PD-1抗体阻断PD-L1/PD-1途径抗肿瘤效应以及抗肿瘤免疫力的影响.方法建立TC-1肿瘤细胞C57BL/6小鼠模型,分为3组(n=3):阴性对照组(予PBS处理)、阳性对照组(予顺铂处理)、抗PD-1抗体组(予抗PD-1抗体处理),绘制肿瘤生长曲线,观察抗PD-1抗体的抗肿瘤效应;小鼠自然死亡或小鼠肿瘤直径达2 cm时,处死小鼠,取出鼠脾和肿瘤组织,流式细胞仪检测鼠脾单核淋巴细胞中CD4+CD25+T调节细胞(Treg细胞)数量;免疫组化方法检测肿瘤组织中CD8+T细胞的表达.结果(1)与阴性对照组比较,抗PD-1抗体组有显著肿瘤抑制作用(P<0.05),与阳性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);(2)小鼠脾脏内单核淋巴细胞中Treg细胞数量比例分别为:阴性对照组(87.00±6.06)%、阳性对照组(71.50±4.04)%、抗PD-1抗体组(69.75±3.77)%,与阴性对照组相比,抗PD-1抗体组Treg细胞数量减少,差异有统计学意义(P<0.05),与阳性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);(3)小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞数量分别为:阴性对照组(2.25×1011±3.34×1010),阳性对照组(1.99×1011±3.12×1010),抗PD-1抗体组(3.27×1011±3.67×1010),其中阳性对照组CD8+T细胞数量最低;与阴性对照组和阳性对照组相比,抗PD-1抗体组CD8+T细胞数量显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05).结论抗PD-1抗体可有效抑制小鼠肿瘤的生长,其机制可能是通过阻断PD-L1/PD-1途径减少免疫抑制细胞,增加CD8+效应细胞数量而发挥作用.     

复发性流产患者血清维生素D水平与自身免疫抗体、淋巴细胞亚群的关系研究

目的探讨复发性流产（RSA）患者血清维生素D 水平与自身免疫抗体、淋巴细胞亚群的关系。方法回顾性分析RSA患者125 例,根据血清25 羟维生素D[25（OH）D]水平,分为25（OH）D 正常水平组50 例、25（OH）D低水平组75 例,分析两组自身免疫抗体阳性率及淋巴细胞亚群水平。结果25（OH）D低水平组抗心磷脂抗体（ACA）、抗核抗体（ANA）的阳性率及甲状腺过氧化物酶（TPO）抗体阳性率均高于25（OH）D正常水平组,差异有统计学意义（P <0.05）;25（OH）D低水平组外周血CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD19+及CD56+百分率均高于25（OH）D正常水平组,差异有统计学意义（P <0.05）。结论RSA 患者中维生素D 缺乏的比例较高,维生素D 缺乏的RSA 患者ACA、ANA 及TPO 抗体阳性率较高,RSA 维生素D 水平与CD4+T 细胞、B 细胞及NK细胞免疫平衡有关。