DNMT1、DNMT3b在胃癌中的表达及其临床意义

目的探讨DNA甲基转移酶1（DNMT1）和DNA甲基转移酶3b（DNMT3b）在胃癌中的表达及其临床病理意义。方法应用免疫组化和RT-PCR方法检测93份胃癌组织、93份胃癌癌旁组织及90份正常胃组织中DNMT1和DNMT3b蛋白和mRNA的表达情况,分析两者与临床病理特征之间的关系。结果DNMT1蛋白在胃癌及癌旁组织阳性表达分别为88．17％和68．89％,明显高于正常胃组织内的阳性表达13．33％;DNMT3b在胃癌中阳性表达为18．28％和45．16％,明显低于正常胃组织内的阳性表达96．67％,差异均有统计学意义（均P〈0．05）。且DNMT1和DNMT3b与胃癌的病理分化类型、肿瘤大小及胃液的幽门螺杆菌阳性有关（均P〈0．05）。结论DNMT1和DNMT3b的异常表达与胃癌的发生发展有紧密的关系,为基因治疗开辟新的途径。     

胃肠道间质瘤中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达及其DNA甲基化

目的 检测胃肠道间质瘤(GIST)组织及瘤旁组织中DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)和DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)的表达,并研究整体DNA甲基化。方法 选取包头医学院第二附属医院2017年1月至2020年1月内镜下切除的GIST组织30例及瘤旁组织30例,应用免疫组化和qRT-PCR方法检测GIST组织和瘤旁组织中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白和mRNA的表达情况;应用亚硫酸氢盐限制性酶切分析技术(COBRA)分析重复序列LINE-1的甲基化水平。结果 GIST中DNMT1 mRNA的表达与瘤旁组织比较,差异无统计学意义(P0.05);GIST中的DNMT3a mRNA表达高于瘤旁组织,差异有统计学意义(P0.001);GIST中的DNMT3b mRNA表达高于瘤旁组织,差异有统计学意义(P0.001)。DNMT1蛋白在GIST及瘤旁组织中的阳性率比较,差异无统计学意义(P=1.000);DNMT3a蛋白在GIST中的阳性率高于瘤旁组织,差异有统计学意义(P=0.045);DNMT3b蛋白在GIST中的阳性率高于瘤旁组织,差异有统计学意义(P=0.017)。GIST中LINE-1序列的甲基化水平低于瘤旁组织,差异有统计学意义(P0.001);GIST中LINE-1序列的非甲基化水平高于瘤旁组织,差异有统计学意义(P=0.001)。结论 DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的异常表达与GIST的发生发展有密切关系,具体机制可能与降低整体甲基化水平有关。     

甲基化转移酶DNMT1,DNMT3a及DNMT3b在子宫内膜异位症中的表达

目的:检测DNA甲基化转移酶DNMT1,DNMT3a, DNMT3b在子宫内膜异位症(dendometriosis, EMs)异位内膜、在位内膜及正常对照子宫内膜的表达。方法:收集子宫内膜异位症巧克力囊肿20例为实验组,行输卵管吻合术者、宫颈病变行手术者20例为对照组,抽提总RNA,反转录制备cDNA。采用real-time RT-PCR 检测DNMT1,DNMT3a及DNMT3b基因的表达,并通过免疫荧光验证DNMTI在EMs异位内膜和在位内膜以及正常对照组子宫内膜中的表达。结果:Real-time RT-PCR检测表明DNMT1, DNMT3a和DNMT3b 在EMs异位内膜和在位内膜的表达较正常内膜低(P<0.05)。DNMT1, DNMT3a和DNMT3b在异位内膜的表达较对照组正常内膜的表达的倍数变化分别是0.44,0.12和0.27;三者在在位内膜的表达较对照组正常内膜的表达的倍数变化分别是0.27,0.13和0.15;三者在异位内膜与在位内膜的表达差异无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光检测结果表明DNMT1蛋白在EMs患者异位内膜及在位内膜中表达显著降低。结论:DNMT1,DNMT3a 及DNMT3b在EMs中的异常低表达可能导致患者表观遗传学异常,参与EMs的发病。     

siRNA沉默膀胱癌T24细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达的研究

目的 研究siRNA对膀胱癌细胞T24 DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达的沉默作用.方法 将筛选出的siRNA转染入膀胱癌T24细胞分为空白组、脂质体组、阴性对照组和siRNA组,分别运用RT-PCR、Western blot检测转染后不同时段DNMT1 mRNA水平、蛋白水平变化.结果 筛选出的siRNA转染膀胱癌T24细胞DNMT1 24 h开始出现mRNA减少,24 h、48 h、72 h分别降至(66.05±4.87)％、(39.36±4.53)％和(40.86±4.81)％(P＜0.05).转染后24 h、48 h、72 h蛋白水平分别降至(90.21±3.68)％、(71.45±3.44)％和(67.74±3.38)％(P＜0.05).结论 siRNA能有效地沉默膀胱癌细胞T24 DNMT1的表达.     

DNA甲基转移酶3b基因在肝外胆管癌组织中的表达

目的：研究DNA甲基转移酶3b( DNMT3b)在人肝外胆管癌组织中的表达情况，并分析DNMT3b的表达与胆管癌临床病理因素之间的关系，探讨其在胆管癌发生发展过程中的作用。方法：用免疫组织化学法检测DNMT3b在24例人肝外胆管癌组织和20例慢性胆管炎组织中的阳性细胞表达率，将二者进行对比并分析其与胆管癌临床病理之间的...     

DNMT3a和HDAC2在胃癌组织中的表达及临床相关性分析

目的:检测DNA甲基转移酶3a(DNA methltransferase 3a,DNMT3a)和组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)在人胃癌组织中的表达,分析其与临床特征的相关性?方法:应用Western blot方法检测30例配对人胃腺癌和癌旁组织中DNMT3a和HDAC2表达的差异;免疫组织化学方法检测90例胃腺癌患者手术切除癌组织中DNMT3a和HDAC2的表达水平,并分析其表达与临床病理学指标的关系?结果:Western blot检测结果显示癌组织中DNMT3a和HDAC2蛋白表达量明显高于癌旁组织(P < 0.01);90例胃癌标本中,免疫组化结果显示DNMT3a阳性表达率为79%(71/90),HDAC2蛋白表达阳性率为86%(77/90),癌组织中DNMT3a表达强度与肿瘤分化程度和淋巴结转移相关(P < 0.05),HDAC2表达强度与肿瘤浸润深度?病理学大体分型?TNM分期和淋巴结转移相关(P < 0.05)?DNMT3a与HDAC2在胃癌组织中的表达呈正相关(P < 0.05)?结论:DNMT3a与HDAC2是胃腺癌发生发展中的危险因素之一,一定程度上能反映胃腺癌的恶性程度,对预后的判断有一定价值,是一项有潜在价值的肿瘤相关标志物?     

shRNA沉默基因DNMT1的表达对膀胱癌T24细胞增殖与凋亡的影响

目的 体外研究shRNA(short hairpin RNA)沉默基因DNMTl的表达对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响,初步探讨DNMT1在膀胱肿瘤形成过程中的作用机制.方法 实验分为空白对照组(给予脂质体)、HK组(含无效干扰序列的质粒)及pshRNA-DNMT1组;常规培养膀胱癌T24细胞株,用脂质体Lipofeetamine 2000将构建成功的重组质粒pshRNA-DNMT1转染进入T24细胞,然后进行RT-PCR、Western blot检测各组DNMT1 mRNA及蛋白质水平变化;进行MTT,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测各组T24细胞增殖和凋亡情况.结果 重组质粒pshR-NA-DNMT1成功转染进入膀胱癌T24细胞;经RT-PCR检测pshRNA-DNMT1组DNMT1 mRNA表达减少,24、48、72h的抑制率分别是28.44%、52.48%、70.91%;转染pshRNA-DNMT1后,T24细胞中DNMT1蛋白24、48和72 h的抑制率分别为24.27%、57.79%、69.74%;在MTT检测中,pshRNA-DNMT1组的细胞增殖抑制率在24、48、72 h分别为(4.34±0.76)%,(9.87±1.54)%和(13.78±1.93)%,与空白对照组比较各时间点差异均有极显著性意义(均P<0.01);转染24、48和72 h后,pshRNA-DNMT1组细胞凋亡率分别为(3.87±0.81)%、(8.69±1.23)%和(11.46±1.24)%,与空白对照组比较差异均有极显著性意义(均P<0.01).结论 重组质粒pshRNA-DNMT1能有效降低膀胱癌细胞中DNMT1基因mRNA及蛋白的表达,并在一定程度上抑制T24细胞的增殖和促进凋亡.     

DNMT3b基因多态性及其在胃癌组织中的表达水平与胃癌的关联性分析

目的:探讨中国北方汉族人群DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)基因单核苷酸多态性(SNPs)和胃癌发病风险之间的关联性,阐明DNMT3b基因是否为胃癌的易感基因。方法:选择447例胃癌患者作为病例组,961名健康对照者作为对照组,采用TaqMan技术检测2组研究对象DNMT3b基因的rs1569686、rs6119954、rs4911107、rs4911259和rs8118663位点的基因型分布。免疫组织化学技术检测病例组(104例)胃癌患者胃癌组织和85例患者的癌旁对照组织中DNMT3b蛋白的表达水平。结果:在病例组和对照组研究对象中5个SNPs位点基因型分布频率相近,未发现5个SNPs位点的多态性与胃癌的发生有关联(P>0.05)。与癌旁组织比较,胃癌组织中DNMT3b蛋白的表达水平升高(P<0.05)。5个SNPs的不同基因型与胃癌组织中DNMT3b蛋白的表达水平均无关联(P>0.05)。结论:中国北方汉族人群中DNMT3b基因多态性与胃癌的发生无关联,DNMT3b基因可能不是胃癌的易感基因。     

DNA甲基转移酶3b对肝癌细胞系中细胞周期素D1基因的表达和启动子甲基化的影响

目的 探讨DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)在人肝癌细胞系(SMMC7721)中对细胞周期素D1(cylin D1)表达及其启动子甲基化水平的影响,并进一步探讨DNMT3b的作用.方法 用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制DNMT3b在SMMC7721细胞系中的表达(实验组),另设转染对照siRNA的对照组,及未加任何处理因素的正常组.用蛋白质印迹检测转染前后DNMT3b及cylin D1蛋白的表达.用噻唑盐(MTT)法检测其生长增殖的变化,并应用甲基化特异性PCR(MSP)技术分别检测实验、对照两组细胞中cylin D1基因启动子区的甲基化状况.结果 DNMT3b siRNA 转染组SMMC7721的生存率(53.7%)与对照组、正常组相比明显降低(P=0.01).蛋白质印迹结果 显示DNMT3b表达水平明显低于对照组和正常组,cylin D1蛋白的表达也低于对照组和正常组.两组中cylin D1启动子区甲基化状态无差异,均未发生甲基化.结论 DNMT3b可以调节cyclinD1的表达,而不改变基因的甲基化状态,可能发挥了转录调控因子的作用.     

宫颈癌组织中DNA甲基转移酶1、3A和3B mRNA的表达

目的探讨DNA甲基转移酶1、3A和3B在宫颈癌发生发展中的作用。方法应用real-time PCR技术检测10例宫颈癌、10例宫颈上皮内瘤变和10例正常宫颈组织DNMT1、3A和3BmRNA的表达。结果宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT 1mRNA对GAPDH mRNA的相对丰度值分别是0.30±0.1、0.26±0.12和0.10±0.04,宫颈癌组织组织中与正常宫颈中DNMT 1表达有显著差异（P〈0.05）;宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT3A mRNA对GAPDH mRNA的相对丰度值分别是0.94±0.27、0.51±0.24和0.13±0.04,三组相比较有显著性差异（P〈0.05）;宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT 3B mRNA对GAPDH mR-NA的相对丰度值分别是0.30±0.09、0.28±0.11和0.11±0.04,宫颈癌组织组织中与正常宫颈中DNMT 3B表达有显著差异（P〈0.05）。结论 DNMT1、3A和3B参与了宫颈癌的发生,并在宫颈上皮内瘤变时就已经起了一定作用。     

DNMT1、DNMT3b siRNA重组质粒的构建及鉴定

目的:构建DNA甲基转移酶(DNMT1)、DNMT3b微干扰RNA(siRNA)重组质粒,并鉴定其正确性。方法:构建DNMT1siRNA重组质粒和DNMT3b siRNA重组质粒各4种,分别用BamHⅠ和PstⅠ酶切、测序、鉴定。结果:用BamHⅠ和PstⅠ进行双酶切后所有质粒均为阳性重组载体,每一种载体选择两个克隆进行测序鉴定,测序结果与插入的寡核苷酸的序列完全相符。结论:DNMT1 siRNA重组质粒和DNMT3b siRNA重组质粒正确,可用于后续实验。     

linc00152通过调控DNMT3A和DNMT3B促进人宫颈癌细胞生长与侵袭

探讨linc00152在宫颈癌中的生物学功能及其调控机制。运用qRT-PCR检测人宫颈癌细胞与正常宫颈上皮细胞中linc00152的表达;转染sh-linc00152、si-DNMT3A和si-DNMT3B于HeLa细胞以敲低细胞中linc00152、DNMT3A和DNMT3B的表达水平,采用qRT-PCR与Western blot法检测转染效率;采用Western blot法检测sh-linc00152对甲基化转移酶(DNMT)3A和3B蛋白表达水平的影响;采用MTT、Transwell侵袭实验检测sh-linc00152、si-DNMT3A以及si-DNMT3B对人宫颈癌HeLa细胞增殖与侵袭的影响。结果显示,linc00152在宫颈癌细胞中的表达水平明显高于正常宫颈上皮细胞(P<0.01);在HeLa细胞中,sh-linc00152组DNMT3A和DNMT3B蛋白表达水平明显低于sh-control组;sh-linc00152组、si-DNMT3A以及si-DNMT3B组HeLa细胞的存活率及穿过基质胶的HeLa细胞数量均明显低于各自对照组。linc00152可能通过调控DNMT3A和DNMT3B信号通路促进人宫颈癌细胞生长与侵袭。     

携带DNMT1-shRNA真核表达载体的构建及其对DNMT1表达的影响

目的构建携带针对DNA甲基转移酶1（DNMT1）mRNA的shRNA真核表达载体，检测重组质粒对DNMT1的沉默效应。方法以DNMT1mRNA序列为靶基因设计shRNA和阴性对照序列（HK），应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体7P-Gensil-1中，构建真核表达载体P-DNMT1-shRNA、P-HK。将重组质粒转染到大肠杆菌DH5口中，经筛选后对提取质粒测序鉴定。用构建的重组质粒转染T24细胞，进行RT-PCR和western blot检测，观察DNMT1mRNA和蛋白的变化。结果重组质粒经Sac Ⅰ酶切得到大小两个基因片段，与设计相同，经测序显示插入完全正确；DNMT1mRNA在24h、48h和72h的抑制率为28．44％、52．48％、70．91％；其蛋白在24h、48h和72h的抑制率为24．27％、57．79％、69．74％。结论成功构建了P-DNMT1-shRNA真核表达载体并能有效沉默T24细胞中DNMT1H水NA和蛋白的表达。     

子宫颈鳞状细胞癌组织中DNMT1mRNA表达和E-cad甲基化检测

目的:探讨宫颈鳞状细胞癌组织中DNA甲基化转移酶(DNMT1)mRNA的表达和上皮钙粘附素(E-cad-herin)的甲基化状况,分析其与宫颈鳞状细胞癌发生发展的关系.方法:应用原位杂交技术检测20例正常宫颈、60例CIN(CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CINⅢ各20例)和40例宫颈鳞状细胞癌组织中DNMT1 mRNA的表达情况;利用甲基化特异性PCR(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)方法检测E-cad基因启动子区甲基化状况,分析官颈鳞状细胞癌中DNMT1 mRNA的表达与E-cad启动子区甲基化状况及2者之间的相关性.结果:DNMT1 mRNA在正常官颈、CIN和宫颈鳞状细胞癌组织中表达逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05);DNMT1 mRNA在CIN Ⅰ、CINIⅡ、CINⅢ组织中表达的差异有统计学意义(P<0.05).E-cad启动子甲基化率在正常宫颈、CIN、宫颈鳞状细胞癌组织中依次升高,差异有统计学意义(P<0.05).E-cad启动子甲基化与DNMT1 mRNA的表达呈正相关(r=0.401,P<0.05).结论:DNMT1 mRNA过表达和E-cad启动子异常甲基化与子宫颈鳞状细胞癌的发生发展关系密切;E-cad启动子甲基化过程可能是在DNMT1的催化作用下完成的.     

Effects on Biological Behavior of Bladder Carcinoma T24 Cells via Silencing DNMT1 and/or DNMT3b with shRNA In Vitro

In this study,RNA interference technique was employed to silence the expression of DNMT1 and/or DNMT3b in human bladder cancer T24 cells.The expression levels of their mRNA and protein were greatly decreased by up to 75% and 65% respectively after T24 cells were transfected with lipofectamine2000 for 72 h,indicating RNA interference is an effective tool in gene knockdown.Proliferation and apoptosis of T24 cells were detected by MTT,and annexin-V-FITC and propidium iodide staining flow cytometry,respectively.It was found that loss of the DNMT1 or DNMT3b expression could inhibit the cell growth and promote the cell apoptosis to some extent.However,combined treatment with shRNA targeting both DNMT1 and DNMT3b mRNA could ob-viously enhance the above effects.It was concluded that simultaneously silencing both genes could result in strong suppressing effect on tumor proliferation and promoting ceil apoptosis than separate use,suggesting combined use of DNMT1 and DNMT3b can achieve a synergistic effect in the CpG island methylation in human bladder tumorigenesis.     

DNA甲基化转移酶3B基因和多巴胺D1受体基因交互作用与精神分裂症的关系

目的 探讨DNA甲基化转移酶3B(DNMT3B)基因与多巴胺D1受体(DRD1)基因交互作用对精神分裂症患病风险的影响.方法 选取DNMT3B基因2个标签SNP(rs2424908和rs6119954)以及DRD1基因5个标签SNP(rs4532、rs5326、rs2168631、rs6882300和rs267418),采用TaqMan探针SNP基因分型技术对365例精神分裂症患者和365名健康对照者进行检测,使用多因子降维法软件(MDR)分析基因-基因交互作用.结果 DNMT3B基因rs6119954位点基因型分布在患者组与对照组之间差异有统计学意义(χ2=8.06,P=0.018);MDR分析结果显示DNMT3B与DRD1基因相互作用存在于两位点模型(rs6119954-rs267418)(OR=1.79,95%CI:1.29～2.47;χ2=12.51,P=0.0004),三位点模型(rs6119954-rs5326-rs267418)(OR=2.36,95%CI:1.73～3.22;χ2=29.33,P＜0.0001)以及四位点模型(rs2424908-rs6119954-rs5326-rs267418)(OR=3.08,95% CI:2.24～4.24;χ2=48.88,P＜0.0001).结论 DNMT3B与DRD1基因存在交互作用,并可能增加精神分裂症的发病风险.     

DNA甲基化转移酶3B在脑胶质母细胞瘤中的差异表达

目的 脑胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)中存在广泛的基因组低甲基化,本研究检查了DNA甲基化转移酶3B (DNA methyltransferase 3B,DMNT3B)是否在这种肿瘤中的表达和突变情况,以期寻找肿瘤基因组低甲基化发生的原因。方法用RNA抽提试剂盒从 25例人脑胶质母细胞瘤组织中提取总RNA,用反转录聚合酶链反应方法扩增 DNMT3B 的cDNA,然后测序,所得序列经DNASTAR软件与NCBI发表的正常序列进行比对。结果 从25例脑胶质母细胞瘤样本中的成功扩增了全长 DNMT3B cDNA,测序分析结果显示 DNMT3B 基因在该肿瘤样本中差异性存在多种剪接变异体,以 DNMT3B-V1、DNMT3B-V3、DNMT3B-V7 为主。没有发现改变氨基酸序列的点突变。结论 DNMT3B 基因在脑胶质母细胞瘤中没有点突变,但存在多种剪接变异体(以 DNMT3B-V3、DNMT3B-V7 为主),其是否为脑胶质母细胞瘤的广泛基因组低甲基化的原因尚有待进一步研究。