小鼠骨髓间充质干细胞自噬与衰老的关系

目的 探讨小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）自噬与衰老的关系。方法 通过体外分离培 养年轻组小鼠（8 周龄）和老年组小鼠（18 个月龄）BM-MSCs,流式细胞术检测细胞表型,TUNEL 染色检 测细胞凋亡,ELISA 试剂盒检测BM-MSCs 分泌蛋白VEGF、bFGF、IGF-1、HGF 的表达,Western blot 检 测自噬相关蛋白LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5、p62 及信号通路蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、 mTOR 的表达。结果 与年轻组比较,老年组BM-MSCs 凋亡增加（P <0.05）,分泌功能下降（P <0.05）,自 噬相关蛋白LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5 表达水平下降（P <0.05）,相反p62 蛋白表达水平升高 （P <0.05）,自噬信号通路相关蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR 表达升高。结论 老年小鼠BM-MSCs 凋亡增加,自噬活性及旁分泌功能下降。     

miR-424通过调控ATG14的表达抑制肝癌细胞的自噬和增殖

目的 研究miR-424通过调控ATG14表达影响自噬和肝癌细胞增殖。方法 收集肝癌患者因手术切除的肝癌组织及其癌旁组织,采用 qRT-PCR 法检测肝癌组织中 miR-424-5p,ATG14 的表达。培养人肝癌细胞系 HepG2、SMMC-7721、Huh-7、MHCC97H、HCCLM3和人正常肝细胞LO2,qRT-PCR法检测上述各细胞系的miR-424-5p表达,选取表达量较高的Huh-7和表达量较低的HCCLM3肝癌细胞为研究对象,Huh-7细胞实验分组（n=3）：干扰miR-424-5p表达阴性对照组（in-NC组）,干扰miR-424-5p表达组（in-miR-424-5p组）;HCCLM3细胞实验分组（n=3）：过表达miR-424-5p组（mi-miR-424-5p组）,另设过表达miR-424-5p阴性对照组（mi-NC组）;过表达miR-424-5p阴性对照+过表达ATG14阴性对照组（mi-NC+NC组）;过表达miR-424-5p阴性对照+过表达ATG14组（mi-NC+ ATG14组）;过表达miR-424-5p +过表达ATG14阴性对照组（mi-miR-424-5p+NC组）;过表达miR-424-5p +过表达ATG14组（mi-miR-424-5p +ATG14组）。qRT-PCR法及Western blot法验证各组miR-424-5p和ATG14的转染情况。采用MTT法检测各组细胞的细胞增殖,流式细胞术检测各组细胞的细胞凋亡水平,Western blot检测各组细胞的ATG14和自噬相关蛋白LC3、Beclin1和P62的表达水平,双荧光素酶报告基因实验检测miR-424-5p和ATG14之间的相互作用。结果 在肝癌组织和细胞中ATG14高表达,miR-424-5p低表达。与相应对照组相比,过表达miR-424-5p抑制肝癌细胞增殖和促进凋亡（P<0.05）;干扰miR-424-5p表达及过表达ATG14促进肝癌细胞增殖和抑制凋亡（P<0.05）;miR-424可能通过靶向ATG14发挥抑癌的作用。干扰miR-424-5p表达及过表达ATG14均能提高肝癌细胞自噬体标志蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1的表达水平（P<0.05）,降低自噬受体蛋白P62的表达水平（P<0.05）;过表达miR-424-5p则降低肝癌细胞自噬体标志蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1的表达水平（P<0.05）,提高自噬受体蛋白P62的表达水平（P<0.05）。结论 miR-424调控ATG14表达影响自噬,从而抑制肝癌细胞增殖。     

自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5在前列腺腺癌组织中的表达及意义

目的探讨自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5在前列腺腺癌（PCa）中的表达情况及其临床意义。方法收集60例PCa标本（观察组）和15例良性前列腺增生（BPH）标本15例（对照组）。应用免疫组化法检测PCa组织和BPH组织中Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5的表达情况,比较两组间的差异;分析PCa组织中Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5蛋白的表达情况与PCa的Gleason评分、血清PSA水平、淋巴结转移、骨转移等临床参数之间的关系。结果PCa组织中Beclin1、LC3-Ⅱ阳性表达率（38.3%、33.3%）明显低于BPH组织（60.0%、53.3%）,而PCa组织中Atg5阳性表达率（83.3%）显著高于BPH组织（6.7%）,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。Beclin1与LC3-Ⅱ的表达呈正相关,两者与Gleason评分、血清PSA水平、淋巴结转移、骨转移有关（均P＜0.05）,而与年龄无关（P＞0.05）。Atg5的表达与年龄、Gleason评分、血清PSA水平、淋巴结转移、骨转移均无关（均P＞0.05）。结论自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5在PCa中的异常表达,提示自噬活动增强和自噬体形成增多在PCa发展过程中起着重要作用。     

自噬与2型糖尿病牙周炎的组织学和细胞学研究

目的通过分析正常牙龈黏膜组织、慢性牙周炎和2型糖尿病牙周炎稳定期黏膜组织和细胞中自噬相关蛋白的表达,探讨自噬对2型糖尿病牙周组织的影响。方法以慢性牙周炎患者和2型糖尿病牙周炎稳定期患者的口腔翻瓣黏膜组织为研究标本,以正常牙龈黏膜组织为对照。采用免疫组化SP法检测各种组织中自噬相关蛋白ATG1、ATG12、Beclin1、P62的表达;取黏膜组织原代细胞,采用免疫荧光法检测各种细胞中ATG1、ATG12、Beclin1、P62的表达;采用Westernblot法检测ATG1、ATG12、Beclin1、P62、LC3-II、LC3-I的表达。结果ATG1、ATG12在正常牙龈黏膜组织中呈强阳性表达,在2型糖尿病牙周炎黏膜组织和慢性牙周炎黏膜组织中表达降低;Beclin1在正常牙龈黏膜组织中呈强阳性表达,在慢性牙周炎黏膜组织中呈弱阳性表达,在2型糖尿病牙周炎黏膜组织中呈阳性表达（稍强于慢性牙周炎黏膜组织）;P62在正常牙龈黏膜组织中表达较弱,在2型糖尿病牙周炎黏膜组织和慢性牙周炎黏膜组织中呈阳性表达。细胞学的免疫荧光表达结果与组织学表达结果相似。Westernblot结果显示慢性牙周炎成纤维细胞与正常牙龈成纤维细胞相比LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低,2型糖尿病牙周炎成纤维细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值最低（均P＜0.05）。ATG1、ATG12、Beclin1、P62在正常牙龈黏膜成纤维细胞、慢性牙周炎成纤维细胞与正常牙龈成纤维细胞中的表达水平有统计学差异（均P＜0.05）。结论自噬与2型糖尿病牙周炎的发生有关,2型糖尿病牙周炎稳定期自噬下降。     

慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织自噬相关蛋白的变化

目的研究在慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)大鼠肺组织中自噬相关蛋白的变化。方法单纯烟熏法构建慢阻肺大鼠动物模型,采用Real time PCR,Western blot技术检测检测大鼠肺组织中PI3K、AKT、p-AKT、m TOR、p-m TOR及自噬相关基因LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5、Beclin1、P62、Atg7、Atg12的mRNA及蛋白表达,探讨在慢阻肺大鼠肺组织中自噬水平及自噬相关蛋白的变化。用LC3B免疫组化比较COPD组与正常大鼠间自噬水平的变化。结果 Real time PCR分析结果显示,与正常组相比,慢阻肺组大鼠肺组织中自噬相关基因Beclin1、Atg5、Atg12的mRNA表达显著增高(P0.05,其中Beclin1、Atg5两组比较P0.01)。Atg7的mRNA表达在慢阻肺组与正常组之间差异无统计学意义(P0.05)。Western blot分析结果显示,慢阻肺组大鼠肺组织中PI3K蛋白、p-AKT/AKT及p-m TOR/m TOR蛋白表达显著降低(P0.05)。自噬相关基因LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5、Beclin1蛋白表达增高(P0.05,其中LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5两组比较P0.01)。P62蛋白表达显著下降(P0.01)。LC3B免疫组化显示,慢阻肺组LC3B表达高于正常组。结论烟熏12周的慢阻肺大鼠与正常组相比,自噬通路上游蛋白PI3K、p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR的表达降低,自噬蛋白表达增加,自噬水平增加。     

慢性铅暴露大鼠海马脑区自噬相关蛋白表达的研究

目的:观察慢性铅暴露后子代大鼠海马脑区铅含量变化,采用自噬/溶酶体途径关联蛋白标记物探讨慢性铅暴露对海马脑区自噬/溶酶体途径关联信号蛋白表达的影响。方法:以慢性铅暴露子代大鼠为研究对象,随机编号分组为对照组、低剂量铅暴露组(0.5 g/L)和高剂量铅暴露组(2.0 g/L)。断乳期仔鼠分笼饲养,仔鼠饮用低、高含量的醋酸铅饮用水直至60天成熟期。分别取血样与海马脑组织样本使用石墨炉原子吸收分光光度法进行铅含量测定,免疫印迹及免疫荧光组化方法分别检测慢性铅暴露后海马脑区自噬相关蛋白Beclin 1、LC3、LAMP2及cathepsin B的表达变化情况。结果:与对照组比较,模型组大鼠血铅含量显著升高(P<0.01)。同时,低剂量与高剂量铅暴露模型组大鼠海马脑铅含量显著升高,分别为(1.26±0.31)μg/g(低剂量组)与(1.83±0.18)μg/g(高剂量组)vs对照组(0.52±0.13)μg/g。此外,免疫印迹结果显示,高剂量铅暴露组大鼠海马脑区的早期自噬标志物Beclin 1及LC3-Ⅱ/LC3-I比值较对照组显著增加(P<0.05或P<0.001)。激光共聚焦显微镜结果显示,慢性铅暴露高剂量组较正常对照组的自噬相关蛋白cathepsin B在海马锥体神经元的阳性表达明显增加。结论:慢性铅暴露诱导大鼠海马脑区发生自噬/溶酶体途径关联信号蛋白表达变化,可能与海马脑区铅含量的增加存在内在关联性。     

三七总皂苷对顺铂诱导肾损伤大鼠模型自噬蛋白LC3和Beclin1的影响

目的研究三七总皂苷（PNS）对顺铂诱导肾损伤大鼠肾组织中自噬相关蛋白LC3、Beclin1表达的影响。方法将36只雄性SD大鼠随机分为空白对照组,顺铂模型组,顺铂 PNS组,在给药24 h后处理动物,检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)和β-N-乙酰胺基葡萄糖苷酶(NAG)水平,利用透射电镜观察大鼠肾小管上皮细胞粒体形态及自噬体,通过Western blot检测自噬蛋白LC3和Beclin1蛋白的表达。结果大鼠暴露于顺铂24 h后,与空白对照组比较,顺铂模型组血清Cr、BUN显著升高（P<0.05）,尿NAG水平没有明显变化,电镜观察到自噬体出现,肾组织LC3和Beclin1蛋白表达显著升高（P<0.01）。与顺铂模型组比较,顺铂 PNS组血清Cr明显降低（P<0.05）,LC3和Beclin1蛋白表达显著升高（P<0.01）。结论PNS可能通过提高Beclin1的表达,增强肾组织的自噬而降低顺铂诱导的大鼠肾损害。      

子痫前期大鼠胎盘细胞自噬水平变化及黄芩苷的干预作用

目的：研究胎盘细胞自噬在大鼠子痫前期发生发展中的作用及黄芩苷的干预作用。方法：48只Wistar孕鼠随机分成4组,每组12只。正常妊娠组大鼠自妊娠13 d起连续皮下注射0.9%氯化钠溶液1.5 mL/d至妊娠21 d;子痫前期组大鼠自妊娠13 d起连续皮下注射亚硝基左旋精氨酸甲酯100 mg/（kg·d）至妊娠21 d;黄芩苷组和自噬抑制组大鼠除了子痫前期组处理外,同时从妊娠16 d起,每天分别给予腹腔注射黄芩苷50 mg/（kg·d）和3-甲基腺嘌呤15 mg/（kg·d）至妊娠21 d。在妊娠21 d测量大鼠尾动脉血压及24 h尿蛋白水平,Western blot测定胎盘细胞Beclin 1、LC3-II和P62蛋白表达水平。结果：子痫前期组较正常妊娠组大鼠胎盘细胞Beclin 1和LC3-II蛋白表达水平显著增高（P ＜0.05）,尾动脉收缩压和舒张压及24 h尿蛋白水平显著升高（P ＜0.05）,而P62蛋白表达水平显著减少（P ＜0.05）;黄芩苷组和自噬抑制组较子痫前期组大鼠胎盘细胞Beclin 1和LC3-II蛋白表达水平显著减少（P ＜0.05）,尾动脉收缩压和舒张压及24 h尿蛋白水平显著减少（P ＜0.05）,而P62蛋白表达水平显著升高（P ＜0.05）。结论：胎盘细胞自噬可能参与大鼠子痫前期的发生发展过程,而黄芩苷腹腔注射可显著抑制子痫前期大鼠胎盘细胞自噬,从而发挥对子痫前期的治疗作用。     

沉默NUPR1基因对人多发性骨髓瘤U266细胞自噬的影响及机制研究

目的：探讨沉默核蛋白1（nuclear protein 1,NUPR1）对人多发性骨髓瘤U266细胞自噬的影响及可能机制。方法：以正常人骨髓单个核细胞为对照,采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测人多发性骨髓瘤U266细胞NUPR1和自噬相关基因（ATG5和Beclin1）mRNA水平。构建含有靶向抑制NUPR1基因表达的小发夹RNA（small hairpin RNA,shRNA）序列的NUPR1-shRNA慢病毒载体,并将其转染人多发性骨髓瘤U266细胞。实验分为未转染组、阴性对照转染组和转染组,qRT-PCR、Western Blot检测NUPR1干扰效果、3组细胞自噬相关指标（ATG5、Beclin1、P62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ） 及相关通路蛋白（p-AKT/T-AKT、p-mTOR/T- mTOR）的表达;单丹磺酰戊二酸（monodansylcadaverine,MDC）染色后,荧光显微镜下观察自噬囊泡的聚集。结果：人多发性骨髓瘤U266细胞较正常人骨髓单个核细胞及转染组细胞NUPR1（F=7.747,P=0.004）、Beclin1（F=5.548,P=0.013）和ATG5（F=4.031,P=0.034） mRNA水平明显增高。转染组NUPR1（F=9.798,P=0.013）、ATG5（F=7.017,P=0.027）、Beclin1（F=7.213,P=0.025）和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ（F=7.040,P=0.027）蛋白表达较未转染组和阴性对照转染组明显降低,而P62（F=52.622,P=0.000）、p-AKT/T-AKT（F=6.584,P=0.031）和p-mTOR/T- mTOR（F=7.950,P=0.021）蛋白表达明显增高;转染组细胞胞质内自噬囊泡聚集明显减少（F=12.172,P=0.008）。结论：人多发性骨髓瘤U266细胞NUPR1高表达,自噬水平较正常人骨髓单个核细胞高。沉默NUPR1可下调U266细胞自噬水平。NUPR1基因可能通过AKT/mTOR通路调节U266细胞自噬。     

自噬基因微管相关蛋白1轻链3、Beclin 1在饥饿大鼠心肌中的表达及意义

目的观察饥饿模型大鼠心肌细胞中微管相关蛋白1轻链3(LC3)及自噬基因Beclin 1的表达变化,探讨自噬机制在饥饿大鼠心肌中的作用。方法将42只健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组(n=6)和饥饿模型组(n=36)。正常对照组正常饮食,饥饿模型组禁食但自由摄水,根据饥饿天数又分为1、2、3、5、7、9 d等6个亚组(n=6)。各亚组在相应时间进行心脏标本提取并留存,采用免疫组化法和蛋白质印迹法检测心肌自噬蛋白Beclin 1和LC3水平变化。结果与正常对照组相比,饥饿模型组各时间点SD大鼠心肌的自噬蛋白LC3和Beclin 1阳性细胞数及蛋白表达都有不同程度的增加,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05),饥饿模型各亚组之间自噬蛋白LC3和Beclin 1阳性细胞数及蛋白表达差异亦均有统计学意义(P<0.01或P<0.05),且在饥饿2 d和7 d出现2个峰值。结论饥饿状态可通过激活心肌自噬机制参与心肌的病理改变过程。     

通络清脑注射粉针对脑缺血-再灌注损伤大鼠的脑保护作用及神经元自噬相关蛋白表达的影响研究

背景　细胞自噬所致神经元凋亡是脑缺血后神经损伤的重要环节,而以通络清脑注射粉针为代表的清热解毒通络疗法在只辨病、不辨证的情况下治疗大鼠脑缺血亦能取得良好疗效,因此推测通络清脑注射粉针发挥脑保护作用的机制很可能与抑制细胞自噬有关。目的　探讨通络清脑注射粉针对脑缺血-再灌注损伤大鼠的脑保护作用及神经元自噬相关蛋白表达的影响。方法　本实验于2019年1月-2020年3月实施,共选取SPF级成年雄性SD大鼠36只,编号后采用随机数字表法分为假手术组、模型组、通络清脑组,每组12只。采用线栓法制备大鼠脑缺血-再灌注损伤模型（假手术组大鼠只进行血管分离、不进行其他操作）,通络清脑组大鼠经尾静脉缓慢推注浓度为18.75 mg/ml的通络清脑溶液3.2 ml/kg,假手术组、模型组大鼠经尾静脉注射等体积0.9%氯化钠溶液。比较三组大鼠建模24 h后神经功能学评分、脑梗死体积占比及再灌注24 h后海马区神经元损伤情况、海马区和皮质区自噬体形成情况、海马区神经元自噬相关蛋白〔包括磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）、Beclin1、自噬微管相关蛋白1轻链3（LC3）〕表达情况。结果　模型组、通络清脑组大鼠建模24 h后神经功能学评分、脑梗死体积占比高于假手术组,而通络清脑组大鼠建模24 h后神经功能学评分、脑梗死体积占比低于模型组（P<0.05）。再灌注24 h后假手术组大鼠海马区神经元未见明显坏死、海马区和皮质区均偶见自噬体,模型组大鼠海马区缺血区神经元结构破坏严重、大量神经元丢失且海马区和皮质区均可见双层膜结构自噬体,通络清脑组大鼠海马区缺血区神经元坏死范围较模型组缩小、神经元损伤明显缓解且海马区和皮质区自噬体数量均减少。再灌注24 h后模型组、通络清脑组大鼠海马区p-NF-κB、LC3相对表达量及模型组Beclin1相对表达量高于假手术组,而通络清脑组大鼠海马区p-NF-κB、Beclin1、LC3相对表达量低于模型组（P<0.01）。结论　通络清脑注射粉针可有效改善脑缺血-再灌注损伤大鼠神经功能,减轻脑梗死程度、神经元损伤,减少自噬体形成及神经元凋亡,抑制神经元自噬相关蛋白p-NF-κB、Beclin1、LC3的表达,其发挥脑保护作用的机制可能与抑制神经元过度自噬有关。     

抑制miR-30a/HMGA2介导的骨肉瘤细胞自噬对化学药物治疗诱导的细胞凋亡的作用

目的：探讨微小RNA(microRNA,miR)-30a/高迁移率族蛋白A2(high mobility group protein A2,HMGA2)介导的骨肉瘤细胞自噬对化学药物治疗(以下简称化疗)药物诱导的细胞凋亡的影响。方法：随机选取30例经化疗药物治疗后表现为化疗敏感和化疗抵抗的骨肉瘤患者组织,分为化疗敏感组(n=15)和化疗抵抗组(n=15),采用real-time PCR检测两组中miR-30a和HMGA2的mRNA表达水平,以及骨肉瘤细胞U2-OS经不同浓度的化疗药物(顺铂、阿霉素、氨甲蝶呤)处理后miR-30a的mRNA表达水平;采用蛋白质印迹法检测细胞内自噬相关因子Beclin 1,自噬微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)、自噬抑制因子P62的表达情况。在骨肉瘤细胞U2-OS中转染miR-30a模拟物和抑制剂,构建miR-30a高表达组、低表达组和对照组,采用蛋白质印迹法检测经过顺铂和阿霉素处理后上述3组细胞内Beclin 1,LC3B和P62的表达情况;采用单丹磺酰尸胺(monodansylcada,MDC)染色法检测细胞内自噬水平,ROS荧光探针-二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)检测细胞内ROS水平,细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡程度,线粒体膜电位荧光探针JC-1检测细胞线粒体氧化损伤程度;采用双荧光素酶法检测miR-30a与HMGA2的相互作用,同时通过转染HMGA2模拟物和HMGA2-shRNA干扰质粒载体,构建HMGA2高表达组、低表达组和对照组,采用蛋白质印迹法检测经过顺铂和阿霉素处理后上述3组细胞内Beclin 1,LC3B和P62的表达情况。结果：化疗抵抗组中miR-30a的mRNA水平显著低于化疗敏感组(P<0.05),HMGA2的表达与miR-30a相反(均P<0.05)。在相对低浓度(5 μml/L)的化疗药物刺激下,骨肉瘤细胞U2-OS内的miR-30a mRNA表达下调,Beclin 1和LC3B均显著上调(均P<0.01),P62显著下调(P<0.01)。在miR-30a高表达组中,与对照组相比,Beclin 1和LC3B的表达水平与miR-30a明显下降(P<0.05),P62的表达水平明显升高(P<0.05),在miR-30a低表达组中则相反;在经过化疗药物处理后的miR-30a高表达组中,细胞自噬水平更低,细胞存活率更低,ROS水平更高,线粒体氧化损伤程度更高,细胞凋亡水平更高(均P<0.05),miR-30a低表达组则相反(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测验证了miR-30a与HMGA2的靶向互补配对关系;与对照组相比,HMGA2高表达组中Beclin 1和LC3B的表达水平与HMGA2明显升高(P<0.05),P62的表达水平明显下降(P<0.05),在HMGA2低表达组中则相反。结论：积极发挥miR-30a/HMGA2抑制骨肉瘤细胞自噬的功能,能够破坏细胞应对ROS介导的自噬与凋亡的平衡,增强化疗药物对细胞的杀伤作用。     

Beclin1基因在SW620细胞自噬和凋亡中作用

目的 探讨Beclinl基因在SW620细胞自噬和凋亡中作用.方法 采用RNA干扰技术抑制Beclinl表达,Beclinl被抑制后细胞的存活能力通过MTT实验评估;结直肠癌细胞SW620在血清剥夺状态下自噬活性通过LC3蛋白水平评估;分别经血清剥夺、星孢菌素及依托泊苷处理的SW620凋亡率通过流式细胞仪检测;Beclinl表达情况经Western blot评估.结果 pSUPER-Becl组细胞血清剥夺后存活能力显著降低(P＜0.05),在血清剥夺24 h后,空白对照组和pSUPER-non组抗凋亡能力比pSUPER-Becl组更强(P＜0.05),星孢菌素处理后,pSUPER-Becl组细胞凋亡最为显著(P＜0.05),用依托泊苷处理后得到相似的结果(P＜0.05);pSUPER-non组与空白对照组细胞中Beclinl的表达随血清剥夺时间的延长呈现上调趋势(P＜0.05),这与LC3的表达变化相一致;而pSUPER-Becl组LC3的表达显著减少(P＜0.05).结论 Beclin1是结直肠癌细胞中自噬和凋亡的关键调节因素,并且维持凋亡和自噬的平衡;Beclinl通过调节细胞自噬活性,在结直肠癌发展与演进中作为一种保护机制,使肿瘤细胞免受到低营养和化疗所致的损伤而持续生存.     

自噬在电离辐射诱导的小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用

目的 探讨自噬在电离辐射诱导小鼠精母细胞GC-2凋亡过程中的作用.方法 将小鼠精母细胞GC-2分为空白对照组和不同剂量(2、4和8 Gy)60Co辐射处理组.采用原位末端转移酶标记法(TUNEL法)和流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过蛋白质印迹实验观察自噬相关蛋白LC3(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)和Beclin1表达水平的改变,使用荧光显微镜观察C,C-2细胞内自噬小体的变化.用5mmol/L自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,观察自噬抑制剂联合电离辐射对细胞凋亡率的影响以及自噬相关蛋白表达水平的改变.结果 与空白对照组相比,GC-2细胞经60Co辐射处理后细胞凋亡率升高(P＜0.05),荧光显微镜下可见细胞自噬体明显增多,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平增加(P＜0.05).预先用5mmol/L 3-MA处理GC-2细胞2h再给予60Co辐射处理,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ以及Beclin1蛋白表达水平与未经3-MA处理组相比降低(P＜0.05),细胞凋亡率升高(P＜0.05).结论 电离辐射可以诱导精母细胞发生自噬,抑制细胞自噬后可增强电离辐射对精母细胞的杀伤作用.     

Cu-ATSM保护内皮细胞糖氧剥夺再灌注损伤的机制

目的：探讨铜-二乙酰-2（N4-甲基氨基硫脲）（Cu -ATSM）对糖氧剥夺再灌注（OGD/R）后人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡的作用及其潜在机制。方法：将体外培养的HUVECs分为Control组、OGD/R组、OGD/R+Cu-ATSM组;采用流式细胞术检测HUVECs的凋亡情况;采用Mito-tracker染色检测线粒体形态;JC-1染色分析各组线粒体膜电位的变化;采用蛋白质印迹法（Western blot）检测各组自噬相关蛋白如ATG5、Beclin1、LC3I/II的激活情况;采用免疫荧光检测各组细胞LC3II的表达情况。结果：流式细胞术结果显示,与Control组比,OGD/R损伤后HUVECs凋亡数目显著上升,而当Cu-ATSM治疗后,凋亡的HUVECs显著减少（均P ＜0.05）。Mito-tracker及JC-1染色结果显示,与Control组比,OGD/R组损伤后线粒体的形态明显受到损伤,线粒体功能受损,膜电位下降,而OGD/R+Cu-ATSM组治疗后能够改善损伤的线粒体功能,维持线粒体形态和线粒体膜电位（均P ＜0.05）。Western blot结果显示,与Control组比,OGD/R组损伤后自噬相关信号通路如ATG5、Beclin1、LC3II蛋白的表达量增多,而OGD/R+Cu-ATSM组治疗后的自噬相关蛋白表达量较OGD/R组下降（均P ＜0.05）。免疫荧光结果显示,与Control组比,OGD/R组损伤后LC3II的表达显著增多,而OGD/R+Cu-ATSM治疗后的LC3II显著减少。结论：Cu-ATSM能够改善HUVECs OGD/R损伤后的线粒体功能,减少HUVECs凋亡,其机制可能是通过抑制自噬实现的。     

电针对脑缺血再灌注大鼠自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表达的影响

目的  观察电针对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能的改善程度及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表达的影响。方法  根据随机数字表法,将72只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组和电针组,每组24只。采用Longa线栓法建立改良的急性局灶性脑缺血再灌注大鼠模型,并在缺血1 h后进行再灌注。参照改良的Zea Longa 8级神经功能缺损评分法对3组大鼠脑神经功能损伤程度进行评估。电针组于造模成功后5 min和16 h进行电针干预。于再灌注后24 h取材。TTC染色法观察各组大鼠脑梗死体积;HE染色法观察大鼠脑组织病理学变化;Western blot检测大鼠右侧纹状体脑组织中LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达,qPCR检测Beclin1 mRNA表达。结果  对照组无行为学改变,模型组神经功能缺损评分显著高于对照组(P < 0.05);与模型组比较,电针组神经功能缺损评分明显低于模型组(P < 0.05)。电针组脑梗死体积较模型组明显减少(P < 0.05)。与模型组比较,电针组LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达明显增加(P < 0.05),Beclin1 mRNA的表达亦明显增加(P < 0.05)。结论  电针治疗可能通过促进自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表达,调控自噬的发生,减小大鼠脑梗死体积,改善神经功能缺损,实现对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护效应。      

一氧化氮合酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带区细胞自噬的影响

目的 探究一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（Nω-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME）对大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型大鼠再灌注后24 h脑内一氧化氮（nitric oxide,NO）和自噬相关蛋白Beclin1、LC3B表达的影响,探讨L-NAME保护脑缺血再灌注损伤的机制。方法 18只健康雄性SD大鼠采用随机数字表法分为假手术（Sham）组、MCAO组,和MCAO+L-NAME组,每组6只。使用改良线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉缺血90 min再灌注模型。术中监测大鼠肛温,使其维持在正常范围。于再灌注后24 h处死大鼠,迅速取脑,用免疫荧光染色检测小鼠脑组织冰冻切片缺血半暗带区Beclin1和LC3B的表达水平,用免疫荧光双标分别将Beclin1和LC3B与NO介导的蛋白质损伤标志物3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine,3-NT）进行共定位。结果 Sham组大鼠没有3-NT染色阳性细胞,偶见Beclin1和LC3B染色阳性细胞,MCAO组小鼠脑组织缺血半暗带区3-NT、Beclin1、LC3B均大量表达（P<0.05）。与MCAO组相比,给予L-NAME治疗后,缺血再灌注大鼠脑组织半暗带区3-NT、Beclin1、LC3B表达均明显减少（P<0.05）。缺血再灌注小鼠脑组织半暗带区,Beclin1和LC3B分别与3-NT免疫荧光染色共定位。结论 L-NAME通过抑制NOS活性,减少NO的产生,直接避免神经元的氧化应激损伤;同时,氧化应激损伤的减弱也避免了自噬的进一步激活,起到了间接的神经保护作用。