采用改进的差示PCR技术分离胃癌差异表达基因及其临床意义(英文)

目的：建立优化的差示PCR条件；运用建立的条件分离胃癌GC7901与胃粘膜GES－1细胞株之间的差异表达基因；根据获取的序列，设计引物并运用于检测胃癌组织、血、活检胃粘膜标本，拟筛选出检出率与符合率高的数对引物，建立胃癌基因诊断方法．方法：LJGC7901与GES－1细胞株为研究对象，探索mRNA差示PCR的最佳反应条件，运用优化的条件分离细胞株之间的差异表达基因；以回收的片段作探针，打点杂交证实为真正的差异片段后，对产物进行直接测序及同源性检索；设计引物，采用RT－PCR方法检测胃癌组织、血、活检胃粘膜标本．结果：优化的差示PCR条件为：前5轮PCR循环采用94℃35s，40℃2min，72℃30s，后35轮PCR循环采用94℃45s，55℃2min，72℃1min，最后在72℃延伸7min；分离回收差异条带154条，从中选出17个片段作探针，打点杂交证实在两细胞株之间呈差异表达；对17个片段进行了测序，其中17个新序列被GenBank接受，接受号为AF054162至AF054172，AF071052至AF071058；其中5个序列引物在26例胃癌标本中检出覆盖率为100％，在9例病理确诊的胃癌患者活检胃粘膜中检出率100％，在17例病理确诊为胃癌患者血标本中检出率为53％．结论：优化了mRNA差示PCR技术条件；分离出154个差异表达的基因片段；筛选出17个新序     

胃癌及癌前病变粘膜中呈高表达6个基因片段的筛选及其临床意义

目的　筛选数个在胃癌及癌前病变粘膜中检出率高的差异表达基因片段并探讨其临床意义 .方法　以筛选出的 gcys- 1至gcys- 18的新基因片段作为研究对象 ,采用定量 RT- PCR技术检测 48例胃癌、16例其他肿瘤及 110例活检的胃粘膜标本 .结果　 1在 48例胃癌中 ,表达检出率高的 6个片段依次为 :gcys- 10为 90 .5 % ,gcys- 1为 80 .9% ,gcys- 18为 6 9.5 % ,gcys- 11为6 1.9% ,gcys- 4为 42 .8% ,gcys- 8为 35 .7% ,在癌旁组织中检出率 <10 % ,6个片段的检出率在胃癌及癌旁组织中存在显著性差异 (P<0 .0 1) ;2在 16例其他肿瘤中 ,表达率依次为 …     

采用改进的表示PCR技术分离胃癌差异表达基因及其临床意义

建立优化的差示ＰＣＲ条件：运用建立的条件分离胃癌ＧＣ７９０１与胃粘膜ＧＥＳ－１细胞株之间的差异表达基因；根据获取的序列，设计引物并运用于检测胃癌组织、血活检胃粘膜标本，拟筛选出检出率与符合率高的数对引物，建立胃癌基因诊断方法。方法：以ＧＣ７９０１与ＧＥＳ－１细胞株为研究对象，探索ｍＲＮＡ差示ＰＣＲ 最佳反应条件，运用优化的条件分离细胞株之间的差异表达基因；以回收的片段作条件分离细胞打点杂交证实为真     

正义、反义Id1真核表达载体的构建及其对胃癌细胞的转染

目的构建正义、反义Id1真核表达载体,并转染胃癌SGC7901细胞株,筛选稳定表达的细胞株。方法设计Id1基因两端的引物,RT-PCR扩增Id1全长序列。将目的基因插入pcDNA3.1＋/Hygro构建正义Id1真核表达载体,插入pcDNA3.1-/Hygro构建反义Id1真核表达载体。脂质体转染法转染胃癌SGC7901细胞系,潮霉素筛选稳定表达的细胞株。结果RT-PCR法获得长约530 bp的Id1全长序列,经酶切及测序鉴定正确后转染胃癌SGC7901细胞株。经过潮霉素筛选8周,获得抗性的细胞株。经Western-blot鉴定,转染正义Id1真核表达载体的细胞株Id1蛋白表达水平高于对照组,而转染反义Id1真核表达载体的细胞株Id1蛋白表达水平低于对照组。结论成功构建正义、反义Id1真核表达载体并转染胃癌SGC7901细胞株,为进一步研究打下基础。     

胃癌高表达基因gcys-18的部分cDNA克隆

目的：分离克隆测序胃癌高表达基因ｇｃｙｓ－１８的部分ｃＤＮＡ．方法：采用ｍＲＮＡ差异展示技术从胃癌ＧＣ７９０１与胃粘膜ＧＥＳ－１细胞株中分离出一差异表达基因片段,对其命名,并进行克隆、测序及ＧｅｎＢａｎｋ检索;以此片段作探针与细胞株总ＲＮＡ进行打点杂交．结果：从差示ＰＣＲ电泳凝胶中分离出大小为４１６ｂｐ的差异表达片段,命名为ｇｃｙｓ－１８;ＲＮＡ打点杂交证实ｇｃｙｓ－１８在ＧＣ７９０１中呈高表达,     

胃癌及其癌前病变相关基因差异表达的研究

目的 探讨与人胃癌发生密切相关的基因片段。方法 本研究应用荧光mRNA差异显示技术分析胃癌（3例）、胃癌前病变（3例）和正常胃黏膜（3例），鉴别并分离差异表达的基因片段，进行PCR再扩增。将扩增的cDNA片段克隆后进行测序，测序结果提交GenBank，经BLAST软件检索进行同源性分析。应用生物信息学技术确定基因在染色体中的定位。结果 发现1个差异表达的cDNA片段，在胃癌组织和癌前病变中高表达，初一步定位于17号染色体，在GenBank数据库中与RP11-25705克隆高度同源，但其具体功能目前尚不清楚。结论 本研究发现的1个基因片段在胃癌组织和癌前病变中高表达，可能参与了胃癌的发病过程。     

Hp、p53在胃癌和癌前病变中的表达及相关性研究

目的:探讨Hp、p53在胃癌及癌前病变中的表达及相互关系.方法:采用特殊染色方法和免疫组化方法,检测130例不同胃粘膜病变石蜡包埋标本.结果:1.慢性浅表性胃炎(CSG)、慢性萎缩性胃炎(CAG)、非典型增生(DYS)和胃癌(GC)Hp阳性率分别为40%、60%、70%和72.5%,GC与CSG比较有显著差异(P<0.05).2.p53基因蛋白在CSG、 CAG、 DYS、 GC中的表达率分别为5%、 25%、 50%、 62.5%,其中GC与CAG、CSG 相比有明显差异(P<0.01).3.在80例胃癌标本中,Hp阳性组p53阳性表达率明显高于Hp阴性组(P<0.05). 结论: 1. Hp感染在胃粘膜病变的演变过程中起着重要作用. 2.突变型p53与胃癌的发生有关.3.p53的突变与Hp感染有密切关系.     

胃癌及癌前组织中端粒酶RNA与端粒酶活性检测及其临床意义

目的：研究胃癌及癌前病变胃粘膜端粒酶RNA与端粒酶活性检测及其意义。方法：选取经病理组织学证实的有粘膜活检标本共150例，包括慢性浅表性胃炎（CSG）32例、肠上皮化生（IM）36例、不典型增生（AH）34例、胃癌（GC）48例，分别采用原位逆转录聚合酶链反应（PCR）、端粒酶重复序列扩增法（TRAP）检测上述胃粘膜端粒酶RNA与端粒酶活性。结果：原位逆转录PCR检测胃粘膜活检标本的端粒酶RNA阳性率为55．3％（83／150），显高于TRAP法检测端粒酶活性检出率（40．0％、60／150，P＜0．05）。在不同胃粘膜病变中，IM、AH及GC的端粒酶RNA阳性率分别为47．2％、52．9％、100％，而CSG胃粘膜中未检出端粒酶RNA；IM、AH组端粒酶RNA阳性率亦明显低于GC组（P＜0．05）。端粒酶RNA主要分布于胃粘膜癌细胞及癌前病变上皮细胞的胞核内。结论：端粒酶RNA与胃癌的发生密切相关。原位逆转录PCR检测胃粘膜端凿酶RNA对胃粘膜癌变的早期诊断和预测有重要价值，而且可能是较端粒酶活性更灵敏的生物学指标。     

幽门螺杆菌感染与胃癌及癌前病变中c-myc、P53基因表达的关系

目的:研究幽门螺杆菌感染在胃癌和胃癌前病变中的作用机制及其与c-myc、P53表达之间的相关性。方法:选取胃镜活检标本130例(胃癌32例,癌前病变80例,慢性浅表性胃炎18例),快速尿素酶试验和Warthin-Starry染色检测Hp,免疫组化SABC法检测c-myc、p53基因蛋白的表达。结果:胃癌和胃癌前病变组Hp感染(+)率均高于慢性浅表性胃炎组,P<0.05有显著性差异;p53和c-myc的阳性表达率在胃癌和胃癌前病变组明显高于慢性浅表性胃炎组,P<0.05有显著性差异;Hp感染(+)组p53、c-myc基因蛋白率高于Hp感染(-)组,P<0.05有显著性差异。结论:Hp感染促进了胃黏膜癌基因c-myc的异常表达和抑癌基因p53的突变,从而诱导胃粘膜癌变。     

人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因反义RNA表达质粒的构建及克隆鉴定

目的：研究反义封闭ppGalNAc-T2基因表达对胃癌细胞GC7901细胞增殖以及肿瘤细胞生物学行为的影响,构建反义表达载体并转染胃癌细胞GC7901。方法：在对几种肿瘤细胞的ppGalNAc-T2基因的表达水平分析后,以高表达ppGalNAc-T2的人胃癌细胞GC7901的总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增两段不同长度ppGalNAc-T2基因片段,构建反义表达载体并转染胃癌细胞GC7901,通过G418筛选,建立一系列旨在封闭胃癌细胞GC7901细胞pp-GaINAc-T2基因表达的亚细胞克隆。通过荧光显微镜、RT-PCR技术手段检测封闭反义ppGalNAc-T2基因RNA表达。结果：ppGalNAc-T2反义表达质粒载体pEGFP-FDT2和pEGFP-FXT2经限制性酶切及部分序列分析证明基因已正确插入载体中,荧光显微镜及RT-PCR显示转染成功。结论：成功构建了ppGalNAc-T2反义表达质粒载体,反义封闭pp-GaINAc-T2基因表达后,胃癌细胞GC7901ppGalNAc-T2的含量明显降低,为进一步研究ppGalNAc-T2奠定了基础。     

人骨肉瘤差异表达基因的筛选

目的 研究人骨肉瘤组织与正常骨组织之间的差异表达基因，探讨骨肉瘤的基因改变，为建立骨肉瘤的基因诊断方法打下基础。方法 采用mRNA差异展示技术，应用3条锚定引物和8条随机引物从人骨肉瘤组织与正常骨组织中分离出差异表达基因，对其进行,是序，用打点杂交技术证实其是否为差异表达基因，将筛选出差异表达基因在GenBank检索进行序列同源性分析。结果 筛选及克隆出6条差异条带，为ZOL03，ZOL51，1C82，1C74，2A21及2G12，RNA打点杂交证实它们在骨肉瘤中表达，在正常骨组织中不表达。6条差异片段经序列测定，在GenBank数据库中进行序列相似性分析，证实ZOL03，ZOL51同源性极低，1C82，1C74，2A21，2G12同源性较低，此6条片段为新基因序列ORF finder分析未发现具有开放读框，均属于非编码区序列，其中ZOL03和ZOL51两个序列在GenBank数据库中登录，接受号为BI894276和BI936370。结论 分离并克隆了人骨肉瘤组织与正常骨组织之间的6条差异表达基因，同源性差，均确认为新基因，可能是骨肉瘤差异表达相关基因。     

正加速度重复暴露大鼠脑差异表达基因的筛选

目的 筛选大鼠经正加速度(Gosiliveacceleration， Gz)重复暴露后脑的差异表达基因，探讨 Gz重复暴露致脑损伤的分子机制。方法 应用抑制性消减杂交技术，构建高消减效率的 Gz重复暴露大鼠脑cDNA消减文库；用差异筛选技术筛选阳性克隆；用序列分析确定阳性克隆的性质；用RT—PCR证实阳性克隆的可靠性。结果 从消减库中获得70个阳性克隆；经差异筛选后，选取其中10个阳性克隆，序列分析表明，7个克隆与已知基因高度同源，3个为新的候选基因。RT—PCR证实了差异表达基因在 Gz重复暴露大鼠脑中高表达。结论 用抑制性消减杂交技术筛选发现的3个新的cDNA可能在 Gz脑损伤的病理过程中起重要作用。     

mRNA差异显示筛选卵巢癌相关基因

目的 :利用mRNA差异显示技术研究正常卵巢上皮和卵巢上皮癌之间的基因表达差异状况 ,筛选和克隆卵巢上皮癌相关基因。方法 :通过DD PCR分析正常卵巢上皮和卵巢上皮癌总RNA将差异片段分离并显示出来 ,将其回收 ,利用基因克隆技术将其筛选和克隆出来作为探针进行斑点杂交鉴定、DNA序列测定、通过国际互联网络检索GenBank进行同源性分析。结果 :共筛选克隆鉴定 6个差异显示片段。其中 4个为未知基因片段 ,已收录入GenBank ,GenBank登录号为AF136 413～AF136 417。两个为已知基因片段 ,其中一个克隆 3AOSKN3与GenBank中染色体 17hCIT克隆 98%同源。另外一个克隆 3AON2 8与GenBank中人类NADH :辅酶Q氧化还原酶有 99%的同源性 ,研究表明该基因与肿瘤相关。结论 :上述结果证明mRNA差异显示方法和杂交分析结合已成为一种敏感、高效、快速的差异表达基因的克隆技术     

食管癌相关基因片段的筛选与鉴定

目的 :从已构建的中国人食管癌特异的消减cDNA文库中 ,初步筛选与鉴定食管癌相关基因片段。方法 :随机挑选 48个片段作反Northern印迹杂交分析 ,将杂交信号有差别的 15个片段送测序公司进行测序 ,用Gen BankBlast程序检索 ,以同源性很小的cDNA片段作为新基因的候选基因 ,观察其在食管癌组织和正常食管粘膜组织中的表达情况。结果 :所获得的 7个序列中 :3y5 9与已知基因同源性很小 ,且 3y5 9在 30例食管癌及其配对正常食管粘膜组织中 ,19例 (6 3.3 % )表达有差别 ,11例 (36 .7% )表达无差别 (P <0 .0 5 )。 3y88与已知基因geminin基因部分同源。另外 5个片段 3y2 0 ,3y14,3y90 ,3y91和 3y92分别与核糖体蛋白RpL7a,TLH2 9蛋白驱动子 ,Hsp70 /Hsp90 organizingprotein ,Keratin6 (KRT6C)和内膜蛋白等已知基因序列高度同源。结论 :3y5 9可能是与食管癌的发生、发展有关的新的候选基因。首次发现 ,geminin基因 ,核糖体蛋白RpL7a,TLH2 9蛋白驱动子 ,Hsp70 /Hsp90 organizingpro tein ,Keratin6 (KRT6C) ,内膜蛋白等已知基因可能与食管癌的发生发展有关     

肝细胞生长因子及其受体在胃癌组织中的表达

目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)及其受体(c-Met)在胃癌组织中表达的意义.方法 采用即用型免疫组化染色法检测44例胃癌、20例慢性浅表性胃炎、10例慢性萎缩性胃炎和16例胃溃疡组织中HGF/c-Met的表达.结果 慢性浅表性胃炎组织细胞内均无HGF/c-Met表达,HGF在胃癌、慢性萎缩性胃炎和胃溃疡组织中表达阳性率分别为72.7%(32/44)、20%(2/10)和37.5%(6/16),胃癌HGF阳性率显著高于慢性萎缩性胃炎组(P＜0.005)及胃溃疡组(P＜0.025);c-Met在胃癌、慢性萎缩性胃炎和胃溃疡组织中表达阳性率分别为77.3%(34/44)、40%(4/10)和37.5%(6/16),胃癌c-Met阳性率也显著高于慢性萎缩性胃炎组(P＜0.05)及胃溃疡组(P＜0.025).结论 胃癌组织中存在HGF和c-Met的共同表达,可能是促进肿瘤恶性演变的生物学行为,也为胃癌的治疗提供一条新的有效途径.     

乳腺癌相关差异表达基因的筛选及分析

目的构建乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织差异表达的cDNA消减文库,筛选乳腺癌相关基因并进行分析。方法应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术对15对乳腺癌组织及正常癌旁乳腺组织进行差异基因的消减,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,采用数字表法随机挑选克隆经PCR鉴定后,对200个阳性克隆插入片段的序列进行测定及同源性分析。结果建立了乳腺癌差异表达片段cDNA消减文库;通过测序和同源性分析,得到173个差异表达基因,其中26个与肿瘤发生发展相关;26个基因中有15个已被文献明确报道在乳腺癌组织或细胞中有差异表达。结论应用SSH技术成功建立了乳腺癌差异表达基因cDNA消减文库,为乳腺癌的发病机制研究及寻找潜在的治疗靶点提供了有力的支持。     

小鼠耳蜗组织NT3基因的克隆及其原核表达鉴定

目的：克隆小鼠耳蜗组织中重要神经营养因子NT3的基因,并对其进行原核表达鉴定,为进一步研究该基因对内耳听觉功能的影响以及对耳聋的基因治疗提供基础。方法：根据所设计的引物用RT－PCR方法扩增目的基因,克隆人pUC19载体,行酶切鉴定和测序;然后进一步克隆人原核表达载体pDH,温度诱导表达,SDS－PAGE检测表达产物。结果：RT－PCR得到长度为777bp的基因片段,克隆后酶切鉴定正确,测序结果经BLAST对比,与GenBank中小鼠NT－3序列完全一致。成功构建了原核表达载体,经温度诱导表达出NT3蛋白。结论：从耳蜗组织中能获得正确的NT3基因克隆以及稳定的原核表达,为后续实验提供了保证。     

胃癌及慢性胃炎幽门螺杆菌的蛋白质组学研究

目的:建立胃炎与胃癌相关幽门螺杆菌的双向凝胶电泳图谱,识别鉴定其差异表达的蛋白质,探讨细菌本身因素在发病过程中的作用.方法:利用固相pH梯度双向凝胶电泳分离胃炎与胃癌相关幽门螺杆菌菌株的总蛋白质,凝胶经蓝银显色后,采用PDQuest图像分析软件比较、分析、识别差异表达的蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应的肽质指纹图谱,然后搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点.结果:获得分辨率较高、重复性较好的胃炎与胃癌相关幽门螺杆菌双向凝胶电泳图谱,鉴定出14个差异蛋白质,包括抗氧化作用、分子伴侣、解毒和DNA修复相关蛋白质、三大代谢相关酶类、细胞结构相关蛋白质以及信号传导相关蛋白质.结论:建立了分辨率高且重复性较好的胃炎与胃癌相关幽门螺杆菌双向凝胶电泳图谱,并识别鉴定出了两种不同疾病来源幽门螺杆菌差异表达的蛋白质,其蛋白质表达的差异可能在胃癌的发生中起重要作用.