Fang-1,一个参与血糖调节的新基因

目的克隆血糖调节相关基因。方法按本室以往建立的方法制备大鼠血糖自动调节模型,以灌输生理盐水为对照;取其骨骼肌,采用差异显示技术(DDRT-PCR),获得差异表达基因片段,经狭缝杂交和Northern杂交分析,排除假阳性片段,确定真正的差异表达序列标签(EST),并以其为探针筛选大鼠骨骼肌cDNA文库;将新基因的全长编码区克隆到pEGFP,瞬时转染L-6TG细胞48h后,荧光显微镜观察蛋白质在细胞中定位。结果获得一个新的全长cDNA,命名为Fang-1,GenBank收录号为AF399873。Blast软件(NCBI)分析显示Fang-1是人类基因AK001644在大鼠中的同源物,其编码区核苷酸同源性为82%,表明该家族蛋白具有保守性。高浓度葡萄糖刺激大鼠后与对照大鼠相比,Fang-1的表达上调;Fang-1编码的蛋白质在细胞核和细胞质均存在。结论从大鼠骨骼肌中克隆到一个参与血糖调节的新基因,该基因编码蛋白在细胞质和细胞核均存在,并通过其表达上调控制或部分控制某些目前未知的机制而达到调节血糖水平的作用。     

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库的构建与初筛

目的构建高凝状态(prothrom botic states,PTS)大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库并进行初步筛选。方法从PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取po ly A mRNA,分别以po ly A mRNA为模板,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成400~600 bp大小的片段。以PTS大鼠cDNA作为T ester,对照大鼠cDNA为D river,进行抑制性消减杂交。将消减杂交第二次PCR产物cDNA克隆至pM D 18-T载体上,然后转化细菌,获得PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。用巢式PCR扩增法制备“正向”和“反向”消减cDNA探针;采用差异筛选方法,用这两种探针对PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库进行筛选;将获得的阳性克隆cDNA进行序列分析;并与G enB ank DNA数据库中的DNA序列进行同源性分析。结果成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库,初步筛选发现两条PTS差异表达cDNA片段。结论成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。     

缺血再灌可诱导新基因的克隆及其基本特性

目的：发现并克隆缺血再灌可诱导基因,方法：应用mRNA差异显示技术,在猪的心肌组织,分离缺血再灌可诱导基因的cDNA片段,随后筛选狸心脏cDNA文库,经克隆,测序,杂交后,分析克隆基因的基本特性,结果：发现和分离到一个缺血再灌上调基因的cDNA片段,通过筛选cDNA文库获得一个编码608个氨基酸开放式阅读框架的阳性克隆子。序列分析显示该克隆子的DNA和氨基酸序列与已知基因,蛋白质氨基酸均无同源性,Northern杂交分析显示该基因在缺血再灌猪心肌组织的表达明显增高,并且在正常猪的心,肝,肺,肾,脾,肠,脑和骨骼肌组织均可检测到其表达,Southern杂交分析显示该基因具有高度的进化保守性,结论：克隆的基因为缺血再灌可诱导新基因,它在缺血再灌的应答中可能起着重要的作用。     

SSH法获取大鼠小脑特异表达cDNA片段

目的获取大鼠小脑特异表达的cDNA序列,比较SSH方法的特点。方法以大鼠大脑和脑干mRNA逆转录cDNA作为driver(驱动)cDNA,大鼠小脑mRNA逆转录cDNA作为Tester(测试)cDNA,经抑制性消减杂交法,去除与大脑及脑干相同的cDNA,从而获得大鼠小脑特异表达基因.然后克隆制备成大鼠小脑特异表达cDNA文库.结果经消减杂交、克隆,挑选出32个阳性质粒.最后用反Northern杂交去除假阳性,筛选出8个有意义的差异表达cDNA基因片段.同时,将测序结果进行同源性比较,发现其中6个cDNA是新EST序列.结论用SSH方法筛选差异表达序列非常有效,特异表达序列分析有助于从分子水平探讨小脑功能.     

缺血再灌可诱导新基因的克隆及其基本特性

目的 :发现并克隆缺血再灌可诱导基因。方法 :应用mRNA差异显示技术 ,在猪的心肌组织 ,分离缺血再灌可诱导基因的cDNA片段 ,随后筛选猪心脏cDNA文库。经克隆、测序、杂交后 ,分析克隆基因的基本特性。结果 :发现和分离到一个缺血再灌上调基因的cDNA片段 ,通过筛选cDNA文库获得一个编码 6 0 8个氨基酸开放式阅读框架的阳性克隆子。序列分析显示该克隆子的DNA和氨基酸序列与已知基因、蛋白质氨基酸均无同源性。Northern杂交分析显示该基因在缺血再灌猪心肌组织的表达明显增高 ,并且在正常猪的心、肝、肺、肾、脾、肠、脑和骨骼肌组织均可检测到其表达。Southern杂交分析显示该基因具有高度的进化保守性。结论 :克隆的基因为缺血再灌可诱导新基因 ,它在缺血再灌的应答中可能起着重要的作用。     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的：利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因。方法：采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM—TEasyVector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性克隆。将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息。结果：扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4个,ESTs2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个。结论：成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因。     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的:利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM-T Easy Vector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息.结果:扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4 个,ESTs 2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个.结论:成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因.     

成年大鼠小脑差异表达基因的克隆

目的 分析成年大鼠小脑基因与新生大鼠小脑基因的差异表达并获取新的表达序列标签。方法 成年大鼠小脑来源的cDNA为受检者（tester）,新生大鼠小脑的cDNA为驱动者（driver）,进行差减杂交,经克隆、获得成年大鼠小脑差减杂交为。结果 共挑选出54个阳性克隆质粒,测序得到56个不同基因片段序列,其中有16个是大鼠中首次测得的表达序列标签,并被GenBank收录（BG946773～BG946788）。结论 用差减杂交法建立差异表达基因文库可快速筛选未知表达序列标签。     

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库的构建

目的构建高凝状态(prothrombotic states，PTS)大鼠肝脏差异表达基因反向清减cDNA文库．方法用高淀粉饲料喂养制备大鼠PTS模型，从PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取poly A^ mRNA，分别以1．5 μg poly A^ mRNA起始，依次合成单链和双链cDNA，经酶切成平均大小为400-600 bp的片段。以PTS大鼠cDNA作为Driver，对照大鼠cDNA为Tester。将Tester分为两组，分别连上不同的接头，与Driver进行两次消减杂交和两次抑制性PCR。将第二次PCR产物cDNA克隆至pMD18-T载体上，然后转化细菌，转化后的细菌接种于含50 μg／ml ampicillin、IPTG、和X-gal的LB琼脂平板上，将克隆计数。结果获得的克隆78％为白色克隆，成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库．结论以1．5 μg poly A^ mRNA起始，采用抑制性清减杂交，构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库。     

大剂量辐射诱导IEC-6细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的克隆和鉴定大剂量辐射前后大鼠空肠上皮细胞IEC-6差异表达基因,为探索肠上皮细胞辐射损伤修复的分子机制提供线索.方法IEC-6细胞经35Gyγ射线照射后由抑制性消减杂交(SSH)方法和T/A克隆技术进行差异表达基因消减cDNA文库的构建,用反向Northerm杂交法对库中的EST序列进行筛选,挑取阳性克隆测序,和GenBank比对后挑选有限克隆进行正向Northerm杂交进行验证.结果扩增消减杂交cDNA文库得到约2 000个克隆,随机选取96个白色克隆进行PCR扩增,用反向Northern杂交法对库中的EST片段进行筛选得到15个阳性克隆,代表12个基因的转录产物,部分基因功能已经明确,涉及细胞骨架、细胞应激、细胞周期、信号转导等多方面,另外还获得一新的cDNA序列.结论SSH法建立了IEC-6细胞差异表达基因消减cDNA文库,一次获得多条差异显示EsT片段,基因种类涉及细胞骨架,细胞应激、细胞周期、信号转导等多方面,这些基因可能在肠上皮细胞的辐射损伤反应中起重要作用.     

Isolation of genes related to blood glucose-control in rat skeletal muscle

ｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ (ＤＤＲＴ ＰＣＲ )ｏｆｍＲＮＡｉｓａｒｅｃｅｎｔｌｙｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｗｈｉｃｈａｌｌｏｗｓｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｏｆｇｅｎｅｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｔｔｗｏｓｔａｔｅｓｉｎａｇｉｖｅｎｔｉｓｓｕｅ 1　Ｔｈｅｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙｇｌｕｃｏｓｅｈｏｍｅｏｓｔａ…     

新生大鼠大脑特异表达基因的初步筛选

目的 获得新生大鼠大脑特异表达的cDNA序列,筛选与新生大鼠大脑发育相关的未知的表达序列标签（expressed sequence tag,EST）。方法 以新生大鼠的大脑mＲＮＡ逆转录cDNA作为实验组（tester）,成年大鼠大脑mRNA逆转录cDNA作为对照组（driver）,经抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH)方法消除同成年大鼠大脑相同的cDNA,并富集低丰度基因,克隆建立新生大鼠大脑特异表达的cDNA文库。结果 获得11个cDNA基因片段,同时将测序结果与Genebank进行同源性比较,发现5个首次在大鼠大脑中检测到的基因序列。结论 SSH是目前寻找差异表达基因的最为简便有效的方法,为寻找大鼠大脑发育差异表达基因提供了一些线索。     

大鼠小脑颗粒神经元凋亡相关的差异表达基因ARNT2的克隆

[目的]研究凋亡与非凋亡大鼠小脑颗粒神经元(cerebellar granule neuron,CGN)细胞中基因表达的差异,克隆出与大鼠CGN凋亡相关的基因.[方法]用荧光差异显示聚合酶链反应(florescent differential display polymerase chain reaction,FDD PCR)从低钾诱导的大鼠CGN凋亡模型中筛选出差异表达序列标签(expressed sequence tag,EST),反向Northern blot杂交进一步验证后,用cDNA 5′末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA 5′Ends,5′RACE)克隆差异表达EST的目标基因,用RT-PCR及Western blot进一步验证目标基因mRNA 及蛋白质水平的表达差异.[结果]用FDD PCR筛选出5号差异表达EST,经反向Northern blot验证后,用5′RACE法成功地克隆到5号EST完整开放阅码框,序列同源性分析证实为大鼠基因ARNT2,RT-PCR及Western blot证实低钾诱导后ARNT2mRNA与蛋白质水平的表达均显著地上调,统计学分析显示差异有显著性(P<0.001).[结论]ARNT2在低钾诱导的大鼠凋亡CGN中表达上调,提示ARNT2与CGN凋亡相关并在该过程中发挥重要作用.     

肝癌内高表达新基因的部分cDNA克隆

目的寻找人肝癌相关的基因。方法应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术，对表达序列标记（ＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅ－ｑｕｅｎｃｅｔａｇｓ，ＥＳＴ）基因克隆进行筛选，以得到的基因片段为探针，筛选人胎肝ｃＤＮＡ文库。结果得到一个在肝癌内高表达的ＥＳＴ基因片段。进一步筛选人胎肝ｃＤＮＡ文库，得到一命名为ＦＬ６的ｃＤ－ＮＡ克隆，核苷酸序列测定表明，ＦＬ６长度为１４６４个碱基，检索最新版本ＧｅｎｅＤａｔａｂａｓｅｓ（ＥＭＢＬ９６．６），未发现同源基因。实验结果还显示该基因在胎儿各组织内有不同的表达特性。结论该基因可能与细胞的增殖、癌变过程相关。     

大鼠外周血淋巴细胞钟相关基因的筛选和鉴定

目的 探讨外周血淋巴细胞的钟相关基因。方法 采用mRNA差异显示技术比较不同时点基因的差异显示，筛选出大鼠外周血淋巴细胞的钟相关基因，并进一步用RNA干涉技术确定其为钟下游基因。结果 获得10条差异表达的eDNA片段，其中3种与已知基因过氧化氢酶、髓鞘蛋白脂蛋白和组蛋白乙酰化酶同源，4种与已知EST同源，另有3种为未知EST，它们均属Clock基因的下游基因。结论 外周血淋巴细胞中至少存在3种以上钟相关基因，其表达水平接受作为昼夜节律振荡器重要组分的Clock基因的调控。     

人B淋巴细胞活化相关新基因的克隆

目的：分离新的与B细胞活化相关基因。方法：采用差异显示反转录PCR（DDRT－PCR）技术对人扁桃体活化和静止B细胞mRNA的差异表达进行分析。差异显示的片段经过Northern杂交验证后,作为探针进行人活化B细胞cDNA文库的筛选。结果：差异显示分析共获得明显的差异表达的标签序列(expressed sequence tag,EST)62条,其中主要在静止B细胞表达的有32条,在活化B细胞表达的有30条,经Northern 杂交验证,共获得阳性的片段25条,以在活化B细胞中高表达的EST30为探针,经3轮筛选人活化B细胞文库后获得1个新的全长为2048bp的cDNA克隆,该克隆含有1个630bp的开放读码框,其推断的氨基酸序列N端与酵母的动力蛋白KAR3部分同源,结论：克隆了1条可能与B细胞活化相关的新基因。     

果蝇吸入麻醉药麻醉作用相关基因的克隆

目的探索吸入麻醉药麻醉作用相关基因或信号传导途径.方法以野生型黑腹果蝇品系及对吸入麻醉药七氟醚敏感和耐药的黑腹果蝇品系为研究模型,通过反转录差异显示PCR方法筛选差异表达的基因片段,经Northem印迹杂交确定阳性基因片段,用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆阳性基因的全长cDNA并进行序列分析.结果在七氟醚诱导和未诱导的3个品系的果蝇中获得31条差异表达的基因片段;NortherTn印迹杂交确证3条为差异表达的阳性片段;RACE法克隆了2条全长cDNA,一条为1 000 bp的果蝇钙调蛋白基因(No.38),另一条为4 100 bp的功能未知基因(No.45),分别位于Chr.2 R49A-49B和Chr.3 L76B9.结论No.38和No.45基因可能参与吸入麻醉药麻醉作用中信号传导和细胞功能的调节,为开展吸入麻醉药作用的机理研究提供新的途径.     

Over-expressed genes detected by suppression subtractive hybridization in carcinoma derived from transformed 16HBE cells induced by BPDE

To screen the over differentially expressed genes in carcinoma induced by BPDE-transformed 16HBE cells （16HBE-C cells）. Methods The suppression subtractive hybridization （SSH） method was performed to profile differentially expressed genes between 16HBE-C cells and 16HBE cells. The cDNA fragments of differentially expressed genes were inserted into TA cloning vector and transformed competent E. coli strain. Positive clones were randomly picked up and identified by the colony PCR method. Dot blot was used to test the same source with the tester. The differentially expressed cDNA fragments were sequenced and compared with known genes and EST database in Genbank. Results Eight known genes were over-expressed in 16HBE-C cells including eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, HIF-1 responsive RTP801, ribosomal protein L10 （RPL10）, ribosomal protein S29 （RPS29）, mitochondrion related genes, and laminin receptor 1. Three differentially expressed cDNA fragments could not be matched to the known genes but to the EST database. Conclusion The SSH method can detect differentially expressed genes between 16HBE-C and 16HBE cells. BPDE-induced carcinogenesis may be related to alteration of at least eight known genes and three unknown genes. These expression data provide a clue to further cloning novel genes and studying functions in BPDE-induced carcinoma.