HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库的构建

目的 :为了探讨噬菌体展示技术在筛选和鉴定病毒抗原表位研究中的应用前景。 方法 :利用随机引物 PCR法以HCV核心基因为模板合成随机 DNA片段 ,再经特定引物二次扩增后获得高丰度的 HCV核心蛋白随机 DNA片段 ,将该片段插入噬菌粒载体 p CANTAB5 X的 Xba 位点 ,转化大肠杆菌 TG1,辅助噬菌体拯救 ,建立噬菌体随机肽展示文库。结果 :所构建的随机文库含 1.2 3× 10 5个不同克隆 ,库容噬菌体滴度为 2× 10 1 2 TU/ m l(转导单位 / ml) ,PCR法检测插入阳性为 2 8.1% ,核酸杂交证实 40 %的克隆为 HCV核心基因阳性克隆。 结论 :所建的随机文库有足够大的库容和较好的多样性 ,可以满足HCV C抗原表位的筛选。     

应用RT-PCR技术检测啮齿类动物冠状病毒

为了检测啮齿类动物冠状病毒，设计了特异性引物，建立RT—PCR检测方法，并用于检测。在基因文库中查找了啮齿类动物冠状病毒和SARS病毒的基因序列，从N基因片段中，利用计算机软件设计了一对特异性引物，通过确定反应混合物的浓度和反应条件，并建立了一整套从病毒。RNA抽提、反转录到PCR反应的快速检测啮齿类动物冠状病毒的方法，扩增出了148bp的目的片段。并已用于啮齿类动物中检测各组织和拭子中的冠状病毒。该方法对啮齿类动物冠状病毒的早期诊断和与SARS病毒区别有重要意义。     

染色质免疫共沉淀法对猪链球菌反应调控因子CovR靶基因的筛选

目的猪链球菌CovR是具有全局调控作用的负反应调控因子。文章采用染色质免疫共沉淀(chromatin immu-noprecipitation,ChIP)方法筛选转录调控因子CovR的靶基因,为进一步开展CovR调控机理研究提供条件。方法利用甲醛固定猪链球菌2型05ZYH33菌株活细胞,超声波破碎法将DNA随机断裂成100～500bp大小不同的片段,再利用CovR特异性单抗免疫沉淀该蛋白质-DNA片段解交联并分离纯化DNA。针对8个潜在的靶标基因启动子区设计引物,分别用设计的引物对免疫共沉淀的DNA样品进行PCR扩增,验证CovR与DNA的结合。结果最佳ChIP实验条件为1%甲醛交联DNA与蛋白质的复合物;功率80 W、工作10 s、间隔30 s、超声40次破碎该复合物,可得到100～500 bp大小不同的片段用于后续实验。PCR结果显示SSU1668基因和SSU1732基因启动子区扩增出阳性条带,另外6种基因的启动子区未扩增出阳性条带。结论 CovR抗体免疫沉淀得到的DNA片段中含有SSU1668基因和SSU1732基因启动子区,表明SSU1668基因和SSU1732基因是CovR的靶基因。     

利用反向遗传学原理构建B、E型肉毒神经毒素基因型特异性靶片段

目的 利用反向遗传学原理构建B、E型肉毒神经毒素(BoNT)基因型特异性靶片段质粒、菌株.方法 自GenBank获取BoNT基因序列,利用DNAMAN、Lasergene、VectorNTI等多种生物信息学分析软件和BLAST等网上数据分析平台进行综合分析,以锚定BoNT/B与BoNT/E基因中的型特异性靶片段,分别设计合成5条和10条DNA短链,经重叠PCR扩增获得完整的靶片段,纯化后连接到pMD 18-T载体上,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,质粒提取后进行酶切和测序鉴定.结果 分析了全球已报道的60条BoNT基因序列(A、B、E、F型),于BoNT/B与BoNT/E基因中,分别锚定了215 bp和360bp的靶片段,并设计合成其特异的检测引物对,经酶切、测序确证,成功合成具有型特异性的BoNT/B与BoNT/E靶片段.结论 获得含有型特异性BoNT/B与BoNT/E靶片段的重组质粒pMD18-T-BoNT/B,pMD18-T-BoNT/E及其菌株.     

PCR快速检测细菌16S rRNA基因的初步研究

目的：建立检测细菌16SrRNA基因的PCR方法。方法:以细菌16S rRNA基因为靶序列。利用计算机软件primer5．0，Bioedit设计2条引物-pml.,pm2并建立相应的PCR方法。采用该PCR方法扩增实验室保留菌株的16srRNA基因,以人类外周血白细胞基因组DNA、HBV—DNA阳性血清以及白色念珠菌为对照。检测该实验方法的特异性;采用倍比稀释的方法进行该实验方法的敏感性实验。结果：用引物pml，pm2对17个不同菌株进行PCR扩增。均得到371bp左右长度的DNA片段。特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应。敏感性实验表明。用pml，pm2引物进行的PCR扩增可检测出20CFU／ml,结论：16S rRNA基因PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点。     

利用寡核苷酸膜芯片检测SARS病毒

目的：建立寡核苷酸膜芯片技术检测SARS病毒。方法：以SARS冠状病毒RNA聚合酶基因(P基因)作为目的基因．参考WHO公布的特异性引物序列，将SARSRNA进行P基因克隆。以地高辛标记的引物，扩增质粒DNA，在P基因上设计11条寡核苷酸探针，点于尼龙膜，制备膜芯片，与地高辛标记的PCR产物杂交显色。结果：以此特异性引物成功地扩增出了440bp的基因片段；以T载体成功的克隆了此基因；克隆的P基因为靶序列，与膜芯片杂交显示，能与probe1，probe2，probe4，probe6，probe8，probe96条正义链特异性探针稳定杂交，其中Drobe1，probe4，probe9杂交效果最好，作为最后选择的探针。结论：膜芯片技术能快速敏感地鉴定出标本中的SARS病毒RNA。     

应用聚合酶链反应扩增HIV—1gag基因序列

作者设计了一对DNA引物,用于扩增1型人免疫缺陷病毒(HIV—1)gag基因的一段保守序列。应用聚合酶链反应(PCR)技术,采用含有ARV-2gag基因的亚克隆质粒pAG423作模板,可以使靶基因片段数目增加1×10~7倍以上,经电泳染色后,扩增产物清晰可辨。实验结果表明,这种方法的敏感性极高,足以检测到6.5个拷贝的HIV-1基因。用特异性DNA探针打点杂交证实扩增产物为特异性gag基因片段。实验还表明,经过30～35次PCR循环可以得到最佳扩增效果,而且应用PCR和打点杂交方法还可以对HIV-1基因进行定量分析。因而PCR是一种可以取代病毒分离的常规测定HIV-1感染的简便方法。     

荧光实时定量RT-PCR观察伤寒杆菌鞭毛z66和d/j抗原基因表达方法的建立

目的：构建荧光实时定量RT-PCR测定伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d／j编码基因mRNA的方法。方法：根据伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d／i编码基因序列,设计引物扩增其读码框架内片段,克隆进pGEM-TEasy质粒。质粒经PCR鉴定后,纯化并定量,作为荧光实时定量PCR的标准品,并制作标准曲线。利用不同渗透压下的鞭毛素基因表达差异,比较三种随机引物(6、8、10核苷酸)与特异性引物的逆转录效果,以确定一种最佳的随机引物用于多基因表达观察。结果：标准曲线有较好的线性(r=0．999),cDNA和标准品的PCR产物溶解曲线峰值一致。用8核苷酸随机引物进行逆转录的敏感度高于6、10核苷酸随机引物,低于特异性引物,但用其观测z66抗原基因和d／j抗原基因在高、低渗时表达变化趋势与用特异性引物测得结果一致。结论：成功构建用8核苷酸随机引物进行逆转录同时测定伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d／j基因表达的荧光实时定量RT-PCR方法。     

用cox1基因片段的PCR鉴别亚洲带绦虫和牛带绦虫

目的：用cox1基因片段的PCR技术对亚洲带绦虫和牛带绦虫的快速鉴别。方法：用亚洲带绦虫和牛带绦虫线粒体cox1基因片段的特异性引物以及带绦虫cox1基因片段的通用引物,对贵州省都匀地区和从江地区的带绦虫虫卵和节片DNA进行常规PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测和核酸序列测定,并用NC-BI Blast对扩增产物的核酸序列与NCBI数据库中带绦虫的cox1基因进行比对。结果：5株都匀带绦虫DNA样品经亚洲带绦虫cox1基因片段的特异性引物PCR,均扩增出约260 bp的产物,PCR产物的核酸序列与NCBI数据库中亚洲带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为100%;2株从江带绦虫的DNA样品用亚洲带绦虫特异性引物和牛带绦虫特异性引物的PCR均未见扩增产物,而通用引物PCR则扩增出约1 000 bp的产物,核酸序列与NCBI数据库中牛带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为99%,在牛带绦虫特异性引物的结合位点存在一个碱基差异。结论：常规PCR扩增特异性的cox1基因片段可快速鉴定亚洲带绦虫;从江牛带绦虫株的cox1基因特异性片段部分存在变异,导致与特异性引物结合能力的差异,可采用cox1基因通用引物PCR结合测序进行鉴定。     

RAPD标记技术用于WHBE兔近交系培育中的遗传分析

目的 探讨用随机引物扩增多态性DNA技术对大耳白黑眼兔近交系培育中的遗传监测作用.方法 选用F4、F5、F6和F7代共70只WHBE兔的皮肤组织样品提取基因组DNA,用60个随机引物对基因组DNA进行PCR扩增,根据电泳结果筛选出其中25个多态性较高的引物进行RAPD-PCR分析,再利用Popgene 3.2统计软件对共检测到的584个扩增片段进行遗传分析,获得实验数据.结果 ①F4代扩增得到124条片段,F5代扩增得到150条片段,F6扩增得到152条片段,F7代扩增得到158条条带;其中F4代与F5代的共有条带数为105,F5代与F6代的共有条带数为119,F6代与F7代的共有条带数为125.②F4代与F5代的遗传相似度为0.7674,F5代与F6代的遗传相似度为0.7984,F6代与F7代的遗传相似度为0.8092.结论 随着WHBE兔近交培育代数的增加,遗传相似度呈上升趋势,说明RAPD技术可以用于WHBE兔近交系培育的遗传检测.     

基于Intel RNG的真随机数生成器研究

目的 构建基于特定Intel芯片组中random number generator(RNG)单元的真随机数生成器。方法 在Intel 815E 芯片组的个人电脑上安装Intel Security Driver(ISD)后,使用Microsoft Visual C++ 6编程,通过寄存器读取的方式获取RNG中的随机数。结果 生成的500个随机数通过的NIST FIPS 140-1和χ²拟合优度检验(α=0.05),表明本方法所生成的随机数满足独立性和分布均匀性的要求。生成7500个随机数经域值变换后与随机数表中的同等数目的随机数进行了统计学比较,结果显示前者的均值偏移、SD, SE和CV均小于后者。结论 基于Intel RNG的真随机数生成器可以生成满足独立性和分布均匀性的真随机数,生成的随机数效果与随机数表中的随机数没有显著性区别。但是基于Intel RNG的真随机数生成器能解决使用随机数表获取随机数中可能存在的问题,具有较好的普遍性和实用性。     

基于Intel RNG的真随机数生成器研究

目的 构建基于特定Intel芯片组中random number generator(RNG)单元的真随机数生成器。方法 在Intel 815E芯片组的个人电脑上安装Intel Security Driver(ISD)后，使用Microsoft Visual C 6编程，通过寄存器读取的方式获取RNG中的随机数。结果 生成的500个随机数通过的NIST FIPS 140-1和X^2拟合优度检验(a=0．05)，表明本方法所生成的随机数满足独立性和分布均匀性的要求。生成7500个随机数经域值变换后与随机数表中的同等数目的随机数进行了统计学比较，结果显示前者的均值偏移、SD，SE和Cy均小于后者。结论 基于Intel RNG的真随机数生成器可以生成满足独立性和分布均匀性的真随机数．生成的随机数效果与随机数表中的随机数没有显著性区别。但是基于Intel RNG的真随机数生成器能解决使用随机数表获取随机数中可能存在的问题，具有较好的普遍性和实用性。     

随机效应荟萃分析的解释

随机效应荟萃分析中关于处理效应的总结性估计只能反映各项研究的平均效应。某项研究如包含可能效应的预期（可信）区间估计将使研究结果更容易应用于临床实践。     

随机数学理论对Logistic模型的解释

目的：建立Logistic随机数学模型。方法：运用概率论原理，结果：设时刻t菌浇的细胞数为，ξt,M－E（ξt）,V＝D（ξt)，则有dM/dt=K1M-K2(M2 V）。结论：logistic随机数学模型更接近客观实际。     

噬菌体展示随机十五肽库的构建

为了满足药物筛选的需要,本实验以pCANTAB 5E噬菌粒为载体,构建表达于丝状噬菌体尾丝蛋白P3N末端的随机十五肽库。通过自行设计引物与模板,人工合成编码随机十五肽的寡核苷酸片段及含有酶切位点的引物。通过PCR技术进行模板扩增获得编码随机十五肽的基因。将扩增后的目的基因经过Sfi Ι,Not Ι两个限制性内切酶双酶切后,与经同样双酶切的5′去磷酸化的噬菌粒载体连接,将重组产物电转入大肠埃希菌TG1感受态细胞。集合菌落后进行库容和多样性检验。所建肽库库容可达5×10⁸。随机挑取20个克隆测序,其核苷酸序列及推断出的氨基酸序列均随机。成功构建了库容量与多样性都满足筛选要求的噬菌体展示随机十五肽库。     

马尔科夫随机场在生物医学图像分割中的应用

目的：建立一种图像分割方法,以适应精确的生物医学图像分析。方法：根据马尔科夫随机场图像模型,利用最大后验概率准则（ＭＡＰ）,提出一种迭代松驰分割算法。结果：在用于生物医学图像以及ＣＴ重建图像的分析事得到较为理想的实验结果。结论：该算法与经典的图像分割算法相比具有分割精度高、可以进行多区域图像分割的特点。