EPO对慢性缺氧心肌细胞线粒体生物合成的影响

目的 观察促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)在慢性缺氧条件下对心肌线粒体生物合成的影响及其可能的机制.方法 将H9c2心肌细胞株置入缺氧培养箱7 d(94％N2,5％ CO2,1％O2),建立H9c2心肌细胞株慢性缺氧模型;采用5、10、20 U/mL不同浓度的rhEPO(recombinant human erythropoietin;重组人促红细胞生成素)干预处理后,用荧光探针标记线粒体,观察线粒体数目的变化;RT-PCR技术检测线粒体DNA的相对拷贝数变化;Western blot技术检测Akt、eNOS及其磷酸化蛋白水平的变化.结果 rhEPO干预7d后线粒体数目及拷贝数增加(P＜0.05);Akt、eNOS蛋白磷酸化水平增强(P＜0.05),Akt、eNOS总蛋白无明显变化(P＞0.05).结论 EPO增强了慢性缺氧心肌细胞的线粒体生物合成,Akt、eNOS可能是EPO增强线粒体生物合成的重要信号通路.     

胡芦巴碱对缺氧／复氧乳鼠心肌细胞的保护作用

目的：探究胡芦巴碱（T RG ）对缺氧／复氧乳鼠心肌细胞的保护作用及其机制。方法原代培养SD乳鼠心肌细胞,随机分成3组：正常对照（Control组）、缺氧／复氧组（H／R组）和TRG加缺氧／复氧组（TRG＋ H／R组）;采用流式细胞术分别检测TRG对缺氧／复氧乳鼠心肌细胞凋亡和线粒体膜电位的影响;采用超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）试剂盒检测SOD活性和MDA水平,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测procaspase‐9、cleaved caspase‐9、procaspase‐3和cleaved caspase‐3蛋白水平。结果 TRG能够显著降低缺氧／复氧乳鼠心肌细胞凋亡率（P＜0．05）,增强SOD活性（P＜0．05）,减少MDA的生成（P＜0．05）,稳定线粒体膜电位（ P＜0．05）,促进caspase‐9和caspase‐3的活化。结论 T RG可减轻缺氧／复氧对乳鼠心肌细胞的损伤,其机制可能与抗脂质过氧化和稳定线粒体膜电位有关。     

促红细胞生成素对乳鼠缺氧心肌细胞的保护作用及机制

目的：探讨促红细胞生成素（EPO）发挥心肌细胞保护作用的可能分子机制。方法：采用流式细胞仪检测各组心肌细胞的存活率、凋亡率和坏死率。将心肌细胞分为正常对照组、缺氧组、缺氧＋EPO组。采用North-ern-blot方法检测各组心肌细胞中的Bcl-2、Bax、Caspase-3mRNA的表达,采用Western-blot方法检测各组心肌细胞中的CytC、STAT-3、Caspase-3蛋白的表达。结果：3组心肌细胞的存活率,凋亡率和坏死率差异显著（92．1％w70．9％vs89．0％,2．3％vs18．73％Fs6．0％,3．5％US8．0％傩3．5％,P〈0．01）。IU／mL EPO开始发挥对缺氧心肌细胞的保护作用,5U／mL、25U／mL和125U／mL的保护作用相似。与缺氧组相比：EPO组Bcl-2mRNA和STAT-3蛋白表达增加（P〈0．01）,Bax、Caspase-3mRNA和Caspase-3蛋白表达减少（P〈0．01）。结论：5U／mL的EPO是其发挥心肌细胞保护作用的最佳浓度。缺氧心肌细胞中,EPO可能通过JAK-STAT途径发挥抗凋亡的作用。     

促红细胞生成素预处理在心肌缺氧复氧损伤中的抗炎作用

目的观察促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）预处理在大鼠心肌缺氧复氧损伤（hypoxia／reoxygenation,H／R）中的抗炎作用并探讨其可能机制。方法Wistar成年雄性大鼠60只,分为对照组,EPO预处理组（EPO组）,每组30只,EPO组大鼠经腹腔注射5000U／kg重组人促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin,RHuEPO）,对照组注射同体积生理盐水。2组各15只大鼠于给药24h后,采取心肌,以DNA末端转移酶标记法（TUNEL法）检测心肌细胞凋亡,免疫组化检测凋亡效应酶胱天蛋白酶-3（caspase-3）、炎性细胞因子TNF-α蛋白表达水平,凝胶电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）检测核因子-κB（nuclear factor—κB,NF-κB）DNA结合活性,其余15只大鼠置于常压缺氧环境中（O2 7％）12h后,移至常压常氧环境中2h,予H／R损伤,采取心肌,检测以上各指标。结果H／R损伤前2组心肌细胞凋亡率,caspase-3、TNF-α蛋白表达差异无统计学意义（P〉0．05）,EPO组心肌NF-κB DNA结合活性显著高于对照组（P〈0．05,P〈0．01）。H／R损伤后2组心肌细胞凋亡率,caspase-3、TNF-α蛋白表达水平,NF-κB DNA结合活性显著高于损伤前（P〈0．01）,EPO组的心肌细胞凋亡率,caspase-3、TNF-α蛋白表达水平,NF—κB DNA结合活性显著低于对照组（P〈0．05,P〈0．01）。结论EPO预处理在心肌H／R损伤中具有抑制NF-κB活化及炎性细胞因子TNF-α表达的抗炎作用;这一作用可能与NF-κB激活的负反馈机制有关。     

探讨重组人促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子联合应用对缺氧心肌细胞保护的分子机制

目的通过研究促红细胞生成素（EPO）联合应用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对缺氧心肌细胞的影响,探讨其对缺氧心肌细胞发挥保护作用可能的分子机制。方法采用95%N2＋5%CO2气体充分置换的1%胎牛血清DMEM培养液培养24 h,建立缺氧心肌细胞模型。将心肌细胞分为5组,对照组、缺氧组、缺氧＋EPO组、缺氧＋G-CSF组和缺氧＋EPO＋G-CSF联合给药组。建立缺氧模型24 h后收集5组心肌细胞标本。采用Northern-blot方法检测各组心肌细胞中的Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的表达,采用Western-blot方法检测各组心肌细胞中的Bcl-2、Bax、细胞色素c（Cyt C）、磷酸化信号转导与转录活化因子3（p-STAT-3）、Caspase-3蛋白的表达。结果成功建立了心肌细胞缺氧模型。与缺氧组相比：EPO、G-CSF和联合给药组明显提高缺氧心肌细胞的存活率,减少凋亡率和总死亡率（P〈0.01）。与缺氧组相比：EPO组和G-CSF组Bcl-2表达增加（P〈0.01）,Bax、Caspase-3表达减少（P〈0.01）,联合治疗组作用最明显,强于单独药物治疗组（P〈0.01）,EPO和G-CSF组之间无明显差异（P〉0.05）;Cyt C表达在EPO组、G-CSF组和联合给药组明显降低（P〈0.01）;三组之间无明显差异（P〉0.05）;P-STAT-3蛋白表达在联合给药组明显增高（P〈0.01）。结论 EPO联合G-CSF治疗,可能通过激活线粒体途径和Janus激酶/信号转导和转录激活子（JAK/STAT）途径联合发挥更强的抗凋亡作用。     

人21．5kDaMBP基因沉默对神经胶质瘤细胞增殖与凋亡的作用研究

目的：研究人21．5kDa人脑髓鞘碱性蛋白（MBP）基因沉默对神经胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的影响。方法将21．5kDaMBP序列特异性短发夹RNA（shRNA）重组质粒pGenesil‐1‐MBP‐3转染神经胶质瘤细胞株（U251）作为MBP基因沉默组,以空质粒转染为阴性对照组,脂质体转染为脂质体空转组;用实时定量PCR（RT‐PCR）和Westernblot方法检测各组21．5kDaMBPmRNA和蛋白的表达水平,CCK‐8法测定细胞增殖曲线,流式细胞法分析细胞凋亡率。结果与阴性对照组相比,MBP基因沉默组细胞中21．5kDaMBP在mRNA和蛋白水平的表达均显著下降（P＜0．05）、细胞增殖活性明显降低（P＜0．05）、细胞凋亡率显著增高（P＜0．05）。结论人21．5kDaMBP基因沉默对神经胶质瘤细胞U251具有显著的抑制增殖和促进凋亡的双重调节作用。     

紫绀型先天性心脏病心肌线粒体DNA拷贝数的变化

目的比较紫绀型和非紫绀型先天性心脏病心肌线粒体DNA（mtDNA）拷贝数,探讨慢性缺氧状态下心肌线粒体的适应性改变。方法选取紫绀型和非紫绀型先天性心脏病各10例,取手术中切除的右室流出道心肌组织,运用实时荧光PCR技术检测心肌组织中mtDNA相对拷贝数,运用实时荧光RT-PCR技术检测心肌组织中线粒体转录因子A（Tfam）的mRNA表达水平。结果紫绀型先心病患者右室流出道心肌组织中mtDNA相对拷贝数明显高于非紫绀组（P〈0.01）,Tfam的mRNA表达水平明显高于非紫绀组（P〈0.01）。结论紫绀型先天性心脏病患者右室流出道心肌mtDNA复制增多,可能为心肌在慢性缺氧状态下的代偿性改变。     

硫化氢调节 miRNA-455表达抑制内质网应激介导的心肌细胞凋亡

目的：有研究表明硫化氢（hydrogen sulfide, H2S）能减少缺血再灌注损伤心肌细胞的凋亡,但确切机制不清。文中旨在研究心肌细胞缺氧／复氧（ hypoxia／reoxygenation , HR）损伤中,H2 S能否通过调节miR-455的表达和减少内质网应激（ endoplasmic reticulum stress , ERS）介导细胞凋亡发挥心肌保护作用。方法原代培养新生SD大鼠心肌细胞,建立心肌细胞HR模型。实验分组：对照组（心肌细胞正常培养27 h）;HR 组（将心肌细胞更换不含血清的DMEM液后进行HR处理）;H 2S 保护组[心肌细胞缺氧前30 min 给予40μmol／L的NaHS（ H2 S前体）预处理,其余处理同HR组]。采用MTT法检测细胞活力,全自动化学分析法检测培养液LDH漏出量,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率,RT-PCR法、蛋白印记法分别检测miR-455及ERS介导细胞凋亡信号通路的标志物葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78, Grp78）和caspase-12的mRNA、蛋白的表达。为检测miR-455是否参与H2 S抑制ERS介导的细胞凋亡,将心肌细胞又分为3组,阴性对照组（转染miR-455阴性对照片段24 h）;miR-455模拟剂组（转染miR-455模拟剂24 h）,miR-455拮抗剂组（转染miR-455拮抗剂24 h）,分别给予40μmol／L的NaHS预处理,再进行HR处理,检测Grp78、caspase-12的表达。结果与HR组比较,H2 S保护组可增加HR损伤的心肌细胞活力[（67．02±6．90）％vs （29．27±5．66）％, P＜0．05],减少LDH漏出量[（91．33±10．63）U／L vs （168．17±15．38）U／L, P＜0．05],同时降低细胞凋亡率[（13．98±1．90）％vs （24．31±2．79）％, P＜0．05]。与HR组比较,H2S保护组可降低HR损伤后细胞Grp78、Grp78 mRNA、caspase-12、caspase-12 mRNA的表达（ P＜0．05）。与阴性对照组比较,miR-455模拟剂组Grp78、Grp78 mRNA、caspase-12、caspase-12 mRNA表达显著升高,而miR-455拮抗剂组表达则显著下降（ P＜0．05）。结论 H2 S可通过调节miR-455的表达水平,减少HR损伤心肌细胞的ERS介导的细胞凋亡,发挥其对心肌的保护作用。     

重组人促红细胞生成素对急性脑损伤大鼠的神经保护作用研究

目的：探讨重组人促红细胞生成素（rh‐EPO）对大鼠急性脑损伤后脑细胞凋亡的保护作用及对GLT‐1／GLAST表达的影响。方法60只大鼠分为对照组（n＝18）、急性脑损伤组（n＝22）和rh‐EPO处理组（n＝20）,急性脑损伤组用改良Feeney′s自由落体打击器制作急性脑损伤模型,rh‐EPO处理组采用同样的方法制作脑外伤模型15 min后腹腔注射rh‐EPO ,所有动物在实验完成48 h后断头取脑。应用RT‐PCR、Western blot检测GLT‐1、GLAST mRNA及蛋白表达。结果急性脑损伤48 h后,大鼠缺血区GLT‐1和GLAST mRNA及蛋白表达较对照组均显著降低（均 P＜0．01）,而rh‐EPO处理组GLT‐1和GLAST 的mRNA及蛋白表达较急性脑损伤组均显著增加（均 P＜0．01）。结论 EPO可显著减轻大鼠急性脑损伤,其机制可能与GLT‐1／GLAST表达上调有关。     

内脂素在糖尿病大鼠肝组织的表达及其对肝糖代谢的作用

目的：检测糖尿病大鼠肝组织内脂素（visfatin）的表达,探讨内脂素在肝糖代谢的作用。方法雄性 SD 大鼠,分为5组：正常对照组（NC 组）、肥胖组（DIO 组）、糖尿病组（DM 组）、胰岛素治疗组（INS 组）、二甲双胍治疗组（MET 组）。检测大鼠空腹血糖（FPG）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、游离脂肪酸（FFA ）、空腹胰岛素（Fins）水平;RT‐PCR 测定大鼠肝组织 visfatin 、葡萄糖6磷酸酶（G‐6‐Pase）mRNA 的水平,Western blot 检测 visfatin 、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶‐α（p‐AMPKα）和腺苷酸活化蛋白激酶‐α（AMPKα）蛋白表达量。结果 DM 组 FBG 较 NC 组、DIO 组均显著升高（P＜0．01）;INS 组、MET 组 FBG 较 DM 组显著下降（P＜0．01）。 DIO 组、DM 组 HOMA‐IR 均较 NC 组显著升高（P＜0．01）;DM 组 HOMA‐IR 较 DIO 组显著升高（P ＜0．01）。DIO 组、DM 组 ISI 均较 NC 显著降低（P＜0．01）,DM 组 ISI 较 DIO 组显著降低（P＜0．01）。 DIO 组 TG 较 NC 组显著升高（P＜0．01）;INS 组、MET 组 TG 较 DM 组显著降低（P＜0．05）,DM 组、INS 组、MET 组 TG 、TC 均较 NC 组升高（P＜0．05）。 DM 组、MET 组、INS 组 FFA 均较 NC 组明显升高（P＜0．05）;DM 组 FFA 较 DIO 组明显升高（P＜0．05）。 DM 组 visfatin mRNA 表达较NC 组、DIO 组显著升高（P＜0．05）;INS 组、MET 组 visfatin mRNA 较 DM 组显著降低（P ＜0．01）。 DM 组、MET 、INS 组 G‐6‐Pase mRNA 较 DIO 组显著升高（P＜0．05）,MET 组 G‐6‐Pase mRNA 较 DM 组显著降低（P ＜0．05）。 DM 组、INS 组、MET 组visfatin 蛋白表达较 NC 组显著升高（P＜0．05）;DM 组、MET 组、INS 组 AMPKα蛋白表达较 NC 组显著降低（P＜0．05）,DM 组AMPKα蛋白表达较 DIO 组显著降低（P ＜0．05）;DIO 组、DM 组、INS 组、MET 组 p‐AMPKα蛋白表达较 NC 组显著降低（P＜0．01）。结论大鼠肝组织 visfatin 表达可能与肝糖脂代谢有关联,visfatin 可能未参与到二甲双胍激活 AMPK 降低血糖的机制中。     

睾酮对低氧小鼠红细胞比容和血清促红细胞生成素的影响

为了观察性激素对红细胞生成的作用,应用低压舱(0.42atm,22h/d)分别给小鼠注射人重组促红细胞生成素(rhEPO)、睾酮、皮质醇,检测红细胞比容(Hct)和血清促红细胞生成素(sEPO)的变化。结果表明:低氧6d后,各组sEPO均显著升高(P<0.05);注射rhEPO或睾酮组的Hct显著增加(P<0.05);注射rhEPO或睾酮组的Hct显著增加(P<0.05),而注射皮质醇组Hct改变不显著(P>0.05)。     

慢性缺氧大鼠肺动脉蛋白激酶C表达变化的免疫组织化学研究

为了观察慢性缺氧对大鼠肺动脉蛋白激酶C（PKC）表达的影响，将24只大白鼠分为4组，每组6只：正常对照组，缺氧1周组，缺氧2周组，缺氧4周组；应用免疫组织化学技术及计算机图像分析。结果发现：缺氧组肺动脉PKC阳性杂色较对照组增强，积分吸光度值增加（P＜0．05）。提示缺氧时大鼠肺动脉PKC表达上调可能参与慢性缺氧性肺动脉高压的发病过程。     

重组人促红细胞生成素对骨髓间充质干细胞增殖及分泌功能的影响

目的观察重组人促红细胞生成素（rhEPO）对人骨髓间充质干细胞（hMSCs）增殖及分泌功能的影响。方法体外扩增培养hMSCs，将rhEPO对hMscs进行处理，MTT比色法检测细胞活性，ELISA法测定细胞VEGF的分泌，流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。结果hMscs增殖变化的A。值在不同浓度rhEPO作用后明显高于对照组（P〈0．01），hMscs分泌的VEGF水平在高浓度（10U／mL）rhEPO作用后明显高于对照组及低浓度组（0．2U／mL）（P〈0．01），而低浓度组VEGF水平亦高于对照组（P〈0．05），细胞表面抗原CD34、CD105、CD106在rhEPO作用后与对照组相比无明显差异。结论rhEPO对hMscs有明显的促进增殖作用，rhEPO有促进hMscs分泌VEGF的作用，且与rhEP0浓度存在正相关趋势；rhEPO对hMscs的分化影响不明显。     

基于凝血酶合并缺氧诱导PC12细胞损伤的模型研究

目的：探索凝血酶合并缺氧对PC12细胞损伤的最佳反应时间点,为进一步研究凝血酶在缺血性脑损伤中的意义提供实验方法。方法建立体外缺氧合并凝血酶诱导的PC12细胞损伤模型。按照常规细胞培养方法,采用三气培养箱（1％ O2,5％ CO2,94％ N2）和无糖DM EM培养液造成细胞缺氧模拟缺血,并同时加入不同浓度的凝血酶（0、50、100、150和200 U／mL ）,再将每组都作用于1、6、12、24 h后,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）分析细胞的存活率、TUNEL法检测细胞的凋亡程度。结果随着缺氧时间的延长和凝血酶浓度的增加,细胞存活率逐渐下降,TUNEL细胞阳性率和凋亡率逐渐升高。低浓度凝血酶（50 U／mL）在缺氧1 h后,与对照组（0 U／mL）相比细胞存活率有所升高,提示低凝血酶可能有保护作用。尤以缺氧12 h后开始细胞损伤更为明显,150 U／m L凝血酶组作用12 h后与对照组相比细胞存活率显著下降（ P＜0．01）,凋亡率显著增加（ P＜0．05）;且200 U／mL凝血酶作用12 h和150、200 U／mL 凝血酶组作用24 h后细胞存活率与对照组比较差异均有统计学意义（ P＜0．05）。结论150 U／mL凝血酶在缺氧作用12 h后为研究凝血酶合并缺氧对PC12细胞损伤的最佳模型条件。     

不同剂量促红细胞生成素治疗新生儿缺氧缺血性脑病的疗效比较

目的:观察不同剂量促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)治疗新生儿缺氧缺血性脑病的早期疗效及安全性。方法:将76例患儿随机分为三组,小剂量EPO组29例,rhEPO 300 U/kg.次,大剂量EPO组23例,rhEPO 500 U/kg/次,首次皮下注射,以后静脉注射,每周3次,连续2周;其余治疗措施同对照组24例。三组患儿在治疗前、后监测血压、肝、肾功能、电解质、Hb、Ret及P lat的变化,同时在生后3 d、5 d、7 d进行神经学评分,生后7 d、14 d、28 d进行新生儿神经行为评分。结果:①新生儿神经行为评分三组之间差异有统计学意义(P<0.01),大、小剂量组均显著高于对照组(P<0.01),而大、小剂量组之间无差异(P>0.05);②神经学评分随时间改变,组别之间差异有统计学意义;在第7天,大、小剂量组分别与对照组之间差异有显著性(P<0.05);而大、小剂量组之间无统计学差异(P>0.05)。③EPO治疗两周后除Hb、Ret显著高于对照组外,其它监测指标如肝、肾功能、电解质、血压、血糖及p lat均无统计学差异(P>0.05)。结论:300或500 U/kg.次EPO都能促进缺氧缺血性脑病的早期恢复,且疗效一致,两种剂量的促红细胞增生作用无差异,对其它系统均无不良影响。     

外源性重组人促红细胞生成素对胎鼠缺血缺氧性脑损伤后神经细胞凋亡的影响

目的 探讨重组人促红细胞生成素(rhEPO)对胎鼠缺血缺氧性脑损伤后神经细胞凋亡的影响及可能机制。 方法 将20只孕19 d的SD大鼠分为rhEPO治疗组(rhEPO组)、生理盐水缺血对照组(I/R组)和假手术对照组(Sham组)。不同剂量rhEPO治疗组和生理盐水缺血对照组采用钳夹双侧子宫卵巢动脉20 min制备宫内缺血缺氧模型,并于宫内缺血前30 min分别经尾静脉给予2500、5000、7500 U/kg rhEPO或1 mL生理盐水,假手术对照组术前30 min经尾静脉注射1 mL生理盐水后只进行开关腹手术。术后24 h取胎鼠观察宫内活胎数,取脑组织,采用免疫组化方法检测活化的Caspase-3蛋白的表达,并通过末端脱氧核苷酸转移酶缺口标记(TUNEL)法观察脑神经元凋亡情况。 结果 与I/R组比较,Treat组胎鼠死亡率下降(P<0.05)。I/R组海马区可见大量Caspase-3表达阳性细胞。rhEPO组与I/R组比较,Caspase-3蛋白表达明显减弱。rhEPO组中,Caspase-3蛋白的表达随rhEPO剂量的增加呈现减弱趋势,各组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。不同剂量rhEPO组细胞凋亡数均较I/R组减少 (P<0.01)。各剂量组间比较,2500 U/kg组凋亡细胞数高于5000 U/kg和7500 U/kg组(P<0.01),而5000 U/kg与7500 U/kg两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 rhEPO预处理,可抑制胎鼠宫内缺血缺氧后的神经细胞凋亡,对缺血缺氧性脑损伤具有一定的保护作用。     

EPO对低氧状态下牙髓细胞增殖和保护的实验研究

目的 通过观察低氧条件下促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）对牙髓细胞增殖和分化能力的影响,探讨低氧状态下牙髓细胞的增殖和保护方法,以期为临床中牙髓细胞低氧情况下保护提供实验参考。 方法 通过改良组织块酶消化法从18岁以下因正畸或阻生需拔除的健康完整牙中分离出牙髓细胞并传代培养。低氧条件下分为两组,实验组使用含有浓度为20 U/mL EPO的10%FBS培养基培养牙髓细胞,对照组使用含10%FBS的培养基培养牙髓细胞,将培养箱的氧气浓度设定为1%,培养24 h、48 h、72 h后CCK-8检测EPO对牙髓细胞增殖的影响;碱性磷酸酶活性（alkaline phosphatase activity,ALP）观察EPO对牙髓细胞矿化的影响。 结果 低氧条件下培养牙髓细胞,CCK-8结果显示：在24 h、48 h、72 h时实验组CCK-8值均高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。ALP检测牙髓细胞分化能力结果显示,在24 h、48 h、72 h吸光度值实验组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论 EPO能保护低氧状态下的牙髓细胞,具有促进其增殖、抗炎的作用,可以作为临床中牙髓细胞低氧时的保护药物。