体内直接导入转基因IL-2包装细胞的抗癌作用

利用构建分泌人IL－2的逆转录病毒的包装细胞，直接体内注射，观察了对B16小鼠黑色素瘤生长影响及转基因效果。狭缝印迹分析结果显示，B16细胞在体内获得IL－2mRNA表达。同时，肿瘤生长受到抑制，表现在小鼠成瘤与存活时间延长，免疫功能也获得增强，IFN-γ下水平升高。本结果与本室以往报道的体外基因转移的动物实验结果相符，提示直接体内注射病毒包装细胞可转移外源基因及显示抑瘤作用。     

IL—2基因转染细胞激活非特异性免疫杀伤细胞的抗肿瘤作用

以ＮＩＨ３Ｔ３细胞作为载体细胞，用基因转染的方法建立了持续分泌白细胞介素２（ＩＬ－２）的细胞株，在体外此细胞上清可以增强小鼠脾细胞和腹腔巨噬细胞对黑色素瘤Ｂ１６细胞的杀伤作用（与对照组比较，均为Ｐ〈０．０１），体内注射基因转染细胞则可以抑制黑色素瘤细胞在体内的生长（与对照组比较，均为Ｐ〈０．０１）。结果表明，分泌ＩＬ－２的成纤维细胞可以通过激活非特异性免疫杀伤细胞而达到抗肿瘤的作用，是一种有较大潜     

人重组IL—2G与TNFα抗肿瘤的实验研究

观察ｒｈＩＬ－８和ＴＮＦα对肿瘤的作用。用ＭＴＴ法检测ｒｈＩＬ－８和ＴＮＦα体外对ＥＬ－４，Ｂ１６瘤细胞的细胞毒作用；小鼠体内抑瘤试验。结果：ｒｈＩＬ－８对ＥＬ－２，Ｂ１６瘤细胞体外无直接杀伤作用，ｔｈＩＬ－８和ＴＮＦα联合运用可有效抑制同种异体ＥＩＬ－４，Ｂ１６瘤细胞在Ｃ５７小鼠成瘤及生长。     

脂质体白细胞介素Ⅱ对小鼠b16黑色素瘤肺转移及脾细胞增殖…

小鼠尾静脉注射Ｂ１６黑色素瘤细胞，腹腔注射脂质体白细胞介素Ⅱ和未包裹白细胞介素Ⅱ（ＩＬ－２），连续ｄ，检测小鼠肺湿重、肺转移结节数和ＣｏｎＡ诱导的脾细胞ＤＮＡ掺入量。结果表明，ＩＬ－２可抑制小鼠Ｂ１６黑色素瘤肺转移，促进ＣｏｎＡ刺激的脾细胞增殖，并与剂量明显相关。脂质体包裹ＩＬ－２可使其生物活性提高约５倍。对免疫功能受抑小鼠作用更为明显。     

白细胞介素12基因转染抑制B16细胞成瘤性及转移性的研究

目的探讨白细胞介素１２（ＩＬ１２）基因转移对弱免疫原性的小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞生长与转移的影响。方法构建小鼠ＩＬ１２两个亚单位ｐ４０、ｐ３５ｃＤＮＡ表达载体;经脂质体ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮ介导,将两真核表达载体同时导入Ｂ１６细胞;应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）检测ｐ４０、ｐ３５ｍＲＮＡ表达;用生物学活性检测法（致分裂激活的活化的小鼠脾细胞增殖）检测ＩＬ１２分泌;经皮下或静脉接种肿瘤细胞,检测其体内成瘤性及转移性。结果ＩＬ１２基因转染的Ｂ１６细胞（Ｂ１６ＴＩＬ１２）能够表达ｐ４０及ｐ３５ｍＲＮＡ,分泌有生物活性的ＩＬ１２;Ｂ１６ＴＩＬ１２细胞体内成瘤性降低,成瘤延迟,肿瘤生长慢,荷瘤小鼠存活期延长（Ｐ＜００１）;肺转移率降低,肺内转移灶明显减少（Ｐ＜００１）。结论ＩＬ１２基因转染可明显抑制肿瘤生长与转移     

共刺激信号B7—1表达对小鼠肿瘤细胞生长和转移的影响

为Ｂ７１分子基因在肿瘤免疫基因治疗中的应用提供实验依据。方法通过逆转录病毒介导的基因转移技术，将Ｂ７１ｃＤＮＡ导入具有不同免疫原性的小鼠肿瘤细胞获得表达，并观察转基因细胞在纯系小鼠体内生长和转移的改变。结果由于Ｂ７－１基因的转导表达，使具有免疫原性的ＥＬ４Ｔ淋巴瘤细胞致瘤性丧失；使非免疫原性的Ｂ１６黑色素瘤、Ｐ８１５肥大细胞瘤和ＭＡ８９１乳腺癌细胞的致瘤性减弱；使Ｂ１６细胞的实验性转移和ＭＡ８９１细胞的自发肺转移能力降低。通过转导Ｂ７－１基因的Ｂ１６细胞的免疫接种，可使再次接种的亲本Ｂ１６细胞的致瘤性减弱：但对已生长的亲本Ｂ１６细胞影响不明显。结论Ｂ７１基因导入不同的肿瘤细胞后，可引起机体产生不同程度抗肿瘤免疫反应，使肿瘤细胞在体内的生长和转移能力丧失或减弱，这种反应的强弱与肿瘤细胞本身的特性有关。     

瘤内注射脂质体包裹的IL－2基因激活免疫效应细胞及诱导细胞因子

目的：为了探讨脂质体介导的ＩＬ－２基因体内基因转移的可行性及对荷瘤小鼠全身免疫功能的激活作用及诱导细胞因子产生的效果。方法：将脂质体分别包裹ＩＬ－２基因、空白质粒及ＰＢＳ后，直接注射至黑瘤体内，１０ｄ后无菌取出小鼠脾细胞，诱导并检测肿瘤特异性杀伤细胞（ＣＴＬ）活性、ＬＡＫ活性及细胞因子的含量，用抗ＭＨＣＩａ单抗检测腹腔巨噬细胞的ＭＨＣＩ类分子的表达。结果：瘤体内注射脂质体包裹的ＩＬ－２基因后，小鼠脾ＣＴＬ细胞活性明显高于瘤体内注射脂质体包裹空白质粒及ＰＢＳ的对照组，其脾淋巴细胞ＬＡＫ活性、诱导ＩＦＮ－γ等细胞因子的含量及表达ＭＨＣＩａ分子的水平均有相应的提高。结论：瘤体内注射脂质体包裹的ＩＬ－２基因后，通过在原位转染肿瘤细胞，增强了肿瘤细胞的免疫原性，诱导机体产生肿瘤特异性的ＣＴＬ以及提高机体非特异性的抗肿瘤免疫反应，发挥抗肿瘤作用。本研究为肿瘤的基因治疗的研究和应用提供了较实用的方法。     

人白细胞介素2基因转移表达及抗乙型肝炎病毒和诱导LAK细胞活性的研究

为了探讨白细胞介素（ＩＬ）－２转基因表达抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用，应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＳｖ（Ｘ）－包装细胞系ＰＡ３１７基因转移系统，研究了人ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移和表达，以及抗ＨＢＶ和诱导淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）的作用。所构建的人ＩＬ－２重组表达载体ｐＺＩＰｈｕＩＬ－２，以ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀技术转染ＰＡ３１７细胞，筛选到Ｇ４１８抗性克隆，分泌假病毒颗粒达１０６ＣＦＵ／ｍｌ。以假病毒颗粒感染２．２．１５细胞系及正常人外周血单个核细胞，分泌ＩＬ－２水平可达６ＩＵ／ｍｌ，明显抑制２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ的分泌表达，与１００ＩＵ／ｍｌ重组的ＩＬ－２一样可诱导出相似的ＬＡＫ细胞活性。而不含ＩＬ－２ｃＤＮＡ的ｐＺＩＰＳＶ（Ｘ）的假病毒颗粒则无此作用。提示逆转录病毒载体。包装细胞系可以成功地实现人ＩＬ－２ｃＤＮＡ的转移和低水平的分泌和表达，并可明显抑制２．２．１５细胞分泌ＨＢｓＡｇ及诱导ＬＡＫ细胞活性。     

IL—2和IL—3基因共转染白血病细胞的体内外生物学特性

目的：研究细胞介素２（ＩＬ－２）、白细胞介素３（ＩＬ－３）基因共转染瘤苗的体现人外生物学特性。方法：用ＩＬ－２重组腺病毒（Ａｄ－ＩＬ－２）、ＩＬ－３重组腺病毒（Ａｄ－ＩＬ－３）转染ＦＢＬ－３红白血病细胞株，观察其体外增殖能力及体内致瘤性的变化。结果：ＩＬ－１、ＩＬ－３共转染的ＦＢＬ－３细胞１周内能较稳定地分泌ＩＬ－２和ＩＬ－３，体外增殖能力无明显变化，但体内致瘤性明显下降，ＩＬ－２、ＩＬ－３共转染     

逆转录病毒介导癌基因疗法体外安全实验

从逆转录病毒ｐＬＸＳＮ与人ＩＬ－２ｃＤＮＡ基因进行重组，包括ＰＡ３１７细胞，建立逆转录病毒包装体系细胞ＰＡ３１７／ｐＬＩＬ－２ＳＮ。用病毒上清液转导人淋巴细胞（ＴＩＬ，ＰＢＬ）和３株人腺癌细胞株（ＳＰＣ－Ａ１，ＭＫＮ－ＨｅｐＧ２）对转ＩＬ－２基因的淋巴细胞（ＴＩＬ／ＩＬ－２，ＰＢＬ／ＩＬ－２）和转ＩＬ－２基因的人癌细胞（ＳＰＣ－Ａ２／ＩＬ－２，ＭＫＮ－４５／ＩＬ－２，ＨｅｐＧ２／ＩＬ２）进行体外安     

Anti-tumor effects of pNEgr-mIL-12 recombinant plasmid induced by X-irradiation and its mechanisms

Objective To study the effect of gene radiotherapy combining injection of recombinant plasmid pNEgr-mIL-12 with local X-irradiation on cancer growth and to elucidate the mechanisms of tumor inhibition. Methods Alkaline lysis was used to extract the plasmid and polyethylene glycol 8000 (PEG 8000) was applied for further purification of plasmids. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the expression of IL-12 protein. C57BL/6J mice were subcutaneously inoculated with B16 melanoma cells and the plasmid was injected directly into the tumor. Gene-radiotherapy combining pNEgr-mIL-12 recombinant plasmid with X-irradiation was given three times to C57BL/6J mice bearing B16 melanoma. Changes in immunologic parameters of tumor-bearing mice were detected with relevant immunologic assays. Results Results showed a significant decrease in tumor growth rate (P<0.05-0.001) after 3 times of gene-radiotherapy with IL-12 and X-irradiation. Immunologic studies showed a significant increase in CTL and NK cytolytic activity (P<0.05-0.001) and an up-regulated secretion of IFN-γ and TNF-α (P<0.01-0.001). Moreover, the expression of mIL-12 in B16 melanoma cells of the treated tumor-bearing mice was found to be higher than that of control. Conclusion pNEgr-mIL-12 plasmid combined with X-irradiation can increase tumor control and the mechanism of increased tumor inhibition is related to the enhancement of anticancer immunity in tumor-bearing mice.     

重组鼠白细胞介素12与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因联合治疗小鼠B16黑色素瘤

目的：研究重组鼠白细胞介素12（AdCMVIL-12）与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（AdCMVGM-CSF）的腺病毒载体联合应用对B16黑色素瘤的抗肿瘤作用。方法：将B16黑色素瘤细胞接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,待瘤体直径达5mm时将荷瘤小鼠随机分为4组,分别为AdCMVIL-12组、AdCMVGM-CSF组、AdCMVIL-12加AdCMVGM-CSF组（联合治疗组）和AdC MVLacZ组（对照组）,每组12只,并于肿瘤组织局部分别多点注射相对应剂量的腺病毒载体,观察各组小鼠肿瘤的生长情况及其诱导的细胞免疫反应,检测各组小鼠血清IL-12和GM-CSF表达水平的变化。结果：病理学观察,联合治疗组肿瘤组织内可见大片凝固性坏死,有大量的淋巴细胞、巨噬细胞浸润。治疗30 d后,联合治疗组肿瘤平均体积为（60.73±11.36 ）mm³,与对照组、AdCMVIL-12组和AdCMVGM-CSF组［分别为（675.18±80.59）、（1 86.91±19.15）和（223.45±23.11）mm³］ 比较差异均有显著性（P>0.01）。同时,AdCMVIL-12与AdCMVGM-CSF联合基因治疗可有效延长IL-12和GM-CSF的表达时间,并且对B16黑色素瘤细胞具有很强的特异性杀伤作用,杀伤率为（69.53 ± 9.20）%。 结论：IL-12与GM-CSF联合基因治疗可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,并能有效降低单独应用AdCMVIL-12的毒副作用。     

白细胞介素-24基因对B16细胞小鼠移植瘤的抑制作用

[目的]探讨重组质粒pEGFP-N1-白细胞介素(IL)-24基因对黑色素瘤B16细胞小鼠移植瘤的抑制作用及其机制.[方法]构建黑色素瘤B16细胞小鼠模型,随机分为3个组,分别向各组小鼠瘤体内注射给予脂质体包裹的基因重组质粒pEGFP-N1-IL-24(实验组),pEGFP-N1(阳性对照组)和PBS缓冲液(阴性对照组).应用HE染色对肿瘤组织形态进行观察,RT-PCR法测定移植瘤中Bax,Bcl-2,VEGF的表达,Western Blot方法研究肿瘤细胞凋亡情况.[结果]HE染色观察结果显示,实验组肿瘤组织细胞变大、胞质疏松、核深染,可见核固缩、核溶解、核碎裂.RT-PCR实验扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果示,实验组Bax基因及Bax蛋白的表达均较其他两组明显升高(P<0.05),而实验组Bcl-2和VEGF基因及Bcl-2和VEGF蛋白的表达均较其他两组明显降低(P<0.05).[结论]IL-24对小鼠体内的黑色素瘤B16细胞的生长有抑制作用.     

阳离子脂质体包裹的IL-12基因对小鼠黑色素瘤的治疗作用

目的:观察体内注射阳离子脂质体包裹的小鼠白细胞介素12(mIL-12)基因对小鼠黑色素细胞瘤的治疗作用.方法:C57BL/6小鼠在接种B16黑色素细胞后3、5、7、9 d分别给予lipofectin包裹的pCmIL-12质粒治疗,观察小鼠的肿瘤生长速度、生存期以及NK细胞活性的变化.结果:阳离子脂质体明显增强pCmIL-12质粒在体内的抗肿瘤生长活性,并延长荷瘤小鼠的存活期.此外,pCmIL-12/阳离子脂质体还能显著增强荷瘤小鼠的NK细胞活性.结论:阳离子脂质体介导的IL-12基因对小鼠黑色素瘤有明显的治疗效果.     

新城疫病毒HN基因真核表达质粒的构建及其抗肿瘤作用的初步研究

构建新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因真核表达质粒,并初步探索其在抗肿瘤治疗中的机制及应用价值。方法：用ＲＴ－ＰＣＲ从ＮＤＶ中克隆ＨＮ ｃＤＮＡ,并构建ＨＮ的真核表达载体,转染ＣＯＳ－７细胞表达,注射至小鼠Ｂ１６黑素瘤模型,检测其抗肿瘤作用。结果成功地克隆了ＮＤＶ ＨＮ ｃＤＮＡ,所构建的ｐｃＤＮＡ３－ＨＮ有良好的表达,动物实验显示,ｐｃＤＮＡ３－ＨＮ有增强荷瘤小鼠ＣＴＬ,ＮＫ杀伤活性的作用。结论ＮＤ     

含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体对荷B16黑色素瘤小鼠免疫功能的影响

目的：研究含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体（AdCMVGM-CSF）直接注射荷B16黑色素瘤小鼠瘤体内对小鼠免疫功能的影响。 方法：将B16黑色素瘤细胞（5×10⁶/只）接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,将荷瘤小 鼠随机分为2组,每组12只,待瘤体直径达5 mm时分别注射AdCMVGM-CSF、AdCMVLacZ （5×10⁸ PFU/只）,检测每组小鼠的免疫功能及其对B16黑色素瘤的抑制作用。 结果：AdCMVGM-CSF实验组小鼠注射后第10天,荷瘤鼠血清中GM-CSF水平［(1 563.72±136.58)ng·L^-1］高于对照组（P<0.01）,肿瘤组织周围的CD8＋ T细胞表达明显增强。 结论：AdCMVGM-CSF可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,具有抑制肿瘤生长的作用。     

Activation of systemic immune effectors and induction of cytokine production by direct intratumoral injection of IL-2 DNA liposome

ourpreviousstudiesreportedaprotocolwhichreliedonthedirecttransmissionoflL-2geneintoB16F1Otumorsinvivotogeneticallymodifythetumorsastheygrewinsitu.WhenIL-2DNAliposomewasdirectlyinjectedintothetumormassintratumorallyinthemurinemodels,adra-maticinhibitionoftumorgrowthwasobserved-Thesurvivaltimeofthetumor-bearingmicewereprolongedsignificantly.Byanalyzingthefunctionofthetumorcellsand'tumorinfiltratinglympho-cytes(TIL),G418-resistanttumorcellscouldbeseparatedfromthetumormassandhighlevelofIL-2c…     

婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC自杀基因系统对黑色素瘤的抑瘤实验

目的 观察婴儿双歧杆菌介导的胞嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶(CD／5-FC)自杀基因系统对黑色素瘤的体内、外抑瘤效果。方法 含重组CD基因的婴儿双歧杆菌中加入5-FC．厌氧条件下培养24h后取其上清液．加到黑色素瘤B16-F10细胞上．观察其对细胞形态及细胞生长抑制率的影响;建立小鼠黑色素瘤动物模型,尾静脉注入含重组CD基因的婴儿双歧杆菌,腹腔注入5-FC,观察携带重组CD基因的婴儿双歧杆菌联合5-FC对黑色素瘤肿瘤体积及肿瘤体积倍增时间的影响。结果 ①体外实验：实验组肿瘤细胞形态显示出显著的损伤性改变,细胞生长受到明显抑制．而对照组肿瘤细胞影响不大。②小鼠黑色素瘤动物模型实验结果显示,经重组婴儿双歧杆菌联合5-FC治疗21d．实验组肿瘤倍增时间明显长于对照组．其肿瘤体积明显小于对照组．且随着观察时间的延长,这种差异越显著。结论 婴儿双歧杆菌介导的CD／5-FC自杀基因系统对黑色素瘤具有明显的抑瘤效果。     

过表达IL-12的恶性黑色素瘤细胞在肿瘤免疫微环境重建过程中抑制T细胞表面PD-1的表达

目的 探讨过表达IL-12的恶性黑色素瘤细胞B16对肿瘤免疫微环境重建过程中T细胞表面PD-1表达水平的影响。方法 利用慢病毒感染小鼠黑色素瘤细胞B16以构建稳定过表达IL-12的B16细胞株;利用qRT-PCR、ELISA检测IL-12的表达情况;通过平板细胞克隆形成实验验证转染病毒对B16细胞增殖能力的影响;利用ELISA检测B16/IL-12细胞在体内表达IL-12的能力;将健康的C57BL/6小鼠随机分为2组,分别接种B16细胞及B16/IL-12细胞,14 d后用流式细胞术检测肿瘤引流区淋巴结中高表达PD-1的T细胞比例;利用650cGy剂量的放射线照射C57BL/6小鼠以构建免疫重建模型,并将造模后的小鼠随机分为2组,分别接种B16细胞及B16/IL-12细胞,将未接受放疗处理的小鼠作为对照组接种B16细胞,记录各组小鼠肿瘤生长情况,接种细胞14 d后用流式细胞术分别检测肿瘤引流区淋巴结以及肿瘤组织中PD-1+T细胞比例。结果 B16/IL-12细胞相比于B16细胞显著增加IL-12的表达（P<0.001）;转染IL-12过表达慢病毒并未对B16细胞增殖能力造成显著影响（P>0.05）;接种B16/IL-12细胞的何瘤小鼠在其肿瘤组织中含有更高水平的IL-12（P<0.01）;常规荷瘤小鼠模型中,B16/IL-12组小鼠较B16组小鼠具有更低比例的CD4+PD-1+T细胞（P<0.01）,而CD8+T细胞群中,PD-1表达水平差异不显著（P>0.05）;免疫重建小鼠模型中,接种B16细胞的小鼠肿瘤引流区淋巴结和肿瘤组织中的CD4+PD-1+T细胞（P<0.05）及CD8+ PD-1+T细胞比例（P<0.01）均高于正常B16组小鼠,接种B16/IL-12细胞的免疫重建小鼠肿瘤引流区淋巴结及肿瘤组织中的CD4+PD-1+T细胞比例（P<0.01）和CD8+ PD-1+T细胞比例（P<0.001）相比于接种B16细胞的免疫重建小鼠均有显著降低;在小鼠肿瘤生长过程中,接种B16/IL-12细胞的免疫重建小鼠的肿瘤生长受到明显抑制（P<0.001）。结论 肿瘤区域过表达IL-12后可减少免疫重建过程中肿瘤区域T细胞表面PD-1 的表达,达到良好的肿瘤控制效果。