在动态旋转系统中构建小口径组织工程化血管的实验研究

目的探索在动态旋转系统中构建小口径组织工程化血管的可行性。方法将新型可降解材料聚羟基丁酸酯（PHB）做成多孔状PHB＋胶原包埋管形支架。采用酶消化法和组织块法分别培养人脐静脉血管内皮细胞、人脐动脉血管平滑肌细胞和人成纤维细胞的混合细胞悬液接种于胶原包埋的PHB内腔面,采用动态旋转系统下培养3周,行大体观察和扫描电镜观察。结果在动态旋转系统中构建的小口径组织工程化血管,在细胞结构上形成均匀血管组织。结论在动态旋转系统下构建组织工程化血管是可行的,为下一步行混合种植后行组织工程化血管移植试验打下基础。     

生物反应器构建组织工程化血管的初步研究

目的探讨生物反应器内构建具有一定力学强度的组织工程化血管的可行性.方法从6月龄毕格犬的颈总动脉、颈外静脉分别获取平滑肌细胞和内皮细胞,体外培养扩增后,将平滑肌细胞接种于聚羟基乙酸(PGA)上形成细胞-材料复合物,置于生物反应器内(搏动频率75次/min;扩张量＜5%)培养3周,接种内皮细胞继续培养1周后取新生血管,进行大体观察、组织学和免疫组化检测.结果生物反应器内培养的组织工程化血管大体观察具有良好的弹性,管腔圆;平滑肌纤维成分排列规则且有层次感;免疫组化染色显示,平滑肌细胞呈棕黄色层状排列,内皮细胞于血管内侧呈单层排列.结论应用生物反应器可构建具有良好弹性的组织工程化血管.     

血小板衍生生长因子-BB对血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞胶原蛋白合成的影响

目的:观察血小板衍生生长因子-BB对培养的人血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞胶原蛋白合成的影响.方法:采用培养的人血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞,应用3H-脯氨酸掺入方法,观察血小板衍生生长因子-BB对3种细胞胶原蛋白合成的影响.结果:血小板衍生生长因子-BB可促进处于静止状态的成纤维细胞和平滑肌细胞胶原蛋白合成,并呈现出明显的浓度依赖关系,成纤维细胞和平滑肌细胞胶原蛋白合成分别在30 ng/ml和40 ng/ml时达到高峰,血小板衍生生长因子-BB对血管内皮细胞胶原蛋白合成总量无明显促进作用.在30 ng/ml的血小板衍生生长因子-BB作用下,成纤维细胞和平滑肌细胞分别在36 h和48 h时胶原蛋白合成达到高峰.结论:血小板衍生生长因子-BB可明显促进培养的人血管平滑肌细胞和成纤维细胞的胶原蛋白的合成,对血管内皮细胞胶原蛋白合成总量无明显促进作用.     

人脐动脉平滑肌细胞体外培养

目的 建立人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法.方法 运用植块贴壁法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外原代和传代培养.倒置相差显微镜和免疫荧光染色方法对培养细胞进行鉴定.结果 原代和传代培养的细胞生长良好,光镜下细胞呈长梭形"峰-谷"样生长,具有典型的平滑肌细胞特征.经传代培养至第5代,细胞生长特性未见异常改变;经考马斯亮兰R250及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色检测,证实为平滑肌细胞.结论 植块贴壁法可成功进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养,传代后细胞生物学特征稳定,为慢性肾病并发心血管疾病的机制研究奠定了实验基础.     

人脐动脉平滑肌细胞培养方法的探讨

目的研究人脐动脉血管平滑肌细胞的培养方法.方法运用贴块法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的培养,并用倒置显微镜进行形态学观察和用免疫组化对培养细胞进行鉴定.结果运用贴块法成功培养了人脐动脉血管平滑肌细胞,培养的细胞呈典型"峰谷"样生长,免疫组化S-P法检测α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(α-SMActin)表达,确认为人血管平滑肌细胞.经传代培养至3～5代,细胞生长特性未见异常改变.结论贴块法培养的人脐动脉血管平滑肌细胞生长稳定性好,且培养与纯化能同步进行.     

生物反应器构建组织工程化血管的初步研究

目的探讨生物反应器内构建具有一定力学强度的组织工程化血管的可行性。方法从6月龄毕格犬的颈总动脉、颈外静脉分别获取平滑肌细胞和内皮细胞，体外培养扩增后，将平滑肌细胞接种于聚羟基乙酸（PGA）上形成细胞-材料复合物，置于生物反应器内（搏动频率75次／min；扩张量〈5％）培养3周，接种内皮细胞继续培养1周后取新生血管，进行大体观察、组织学和免疫组化检测。结果生物反应器内培养的组织工程化血管大体观察具有良好的弹性，管腔圆；平滑肌纤维成分排列规则且有层次感；免疫组化染色显示，平滑肌细胞呈棕黄色层状排列，内皮细胞于血管内侧呈单层排列。结论应用生物反应器可构建具有良好弹性的组织工程化血管。     

人脐静脉内皮细胞的体外培养及微重力对其增殖的影响

目的探讨微重力环境对人脐静脉血管内皮细胞增殖的作用。方法取健康产妇剖宫产术后脐带，用胶原酶Ⅰ消化血管内皮细胞，进行原代培养，在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作用下细胞长期传代；将内皮细胞置于回转器内模拟太空微重力培养，同时设地面静止培养对照，测定72h内血管内皮细胞增殖水平。结果模拟微重力下细胞增殖高于对照组。结论培养的脐静脉血管内皮细胞对微重力环境敏感。     

人脐动脉平滑肌细胞体外培养

目的建立人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法。方法运用植块贴壁法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外原代和传代培养。倒置相差显微镜和免疫荧光染色方法对培养细胞进行鉴定。结果原代和传代培养的细胞生长良好,光镜下细胞呈长梭形"峰-谷"样生长,具有典型的平滑肌细胞特征。经传代培养至第5代,细胞生长特性未见异常改变;经考马斯亮兰R250及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色检测,证实为平滑肌细胞。结论植块贴壁法可成功进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养,传代后细胞生物学特征稳定,为慢性肾病并发心血管疾病的机制研究奠定了实验基础。     

聚乙交酯-聚丙交酯降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建组织工程血管

目的：探讨改良聚乙交酯-聚丙交酯（PLGA）降解支架复合胎儿脐动脉细胞方法构建组织工程血管（TEBV）的可行性。方法：将胎儿脐动脉的平滑肌细胞,内皮细胞种植于国产PLGA血管上并进行培育,观察两种细胞生长情况、检测内皮细胞、平滑肌细胞并测定其功能。结果：培育2mo后,平滑肌细胞,内皮细胞在PLGA血管片上黏附良好,材料组织相容性好。结论：应用PLGA降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建组织工程血管的体外培养方法是可行的,PLGA支架有利于细胞生长、分化及功能发挥,动态培养方法培养出的TEBV色泽光亮,厚度均匀,具有良好的弹性。     

血管内皮细胞体外三维培养方法的比较

目的 比较不同方法进行脐静脉内皮细胞体外三维培养形成三维血管状结构的差异. 方法 采用表面培养法与混合培养法行脐静脉内皮细胞体外三维培养,观察形成的三维管网状结构. 结果 表面培养法:细胞生长快,管状结构形成多,细胞分支连接形成复杂的三维网状结构;混合培养法:细胞生长缓慢,管状结构形成少,出现细胞连接形成的细胞索与三维网状结构数量较少.两种培养方法形成的血管样结构的数量与长度明显不同. 结论 表面培养法体外血管三维培养,具有操作简便、细胞生长快、三维血管结构形成数量多、血管网络结构复杂等特点,适用于血管生成影响因素的实验研究.     

血管内皮和平滑肌细胞联合培养构建组织工程化血管的方法

目的：探讨组织工程血管种子细胞原代培养、传代扩增、鉴定的方法，为组织工程血管的构建提供理想的种子细胞。方法：无菌条件下取正常产妇分娩的脐带动静脉，ROSS法（即组织贴块法）原代培养混合血管细胞。倒置相差显微镜、免疫组化法对细胞进行鉴定。结果：倒置显微镜显示原代细胞及经传代培养后的细胞，呈现内皮样细胞、平滑肌样细胞混合生长的特征。免疫组化法检测示内皮细胞Ⅷ因子、平滑肌细胞α-肌动蛋白呈阳性反应。细胞经3次～5次传代，数量可增殖达到8×10^6—10×10^6。结论：使用组织贴块法原代培养可获得内皮细胞、平滑肌细胞混合体，细胞经体外联合培养、传代可以达到组织工程血管种子细胞所需的数量。     

胚胎干细胞构建小口径组织工程血管的研究

目的通过小鼠胚胎干细胞定向分化出的内皮细胞和平滑肌细胞构建组织工程小口径血管。方法将小鼠胚胎干细胞诱导分化出的内皮细胞和平滑肌细胞分别种植于管状聚乳酸-羟基乙酸（polylactic glycolic acid，PLGA）管腔内面，构建出小口径组织工程血管，再将其移植入裸鼠皮下，每隔1周取1次包埋的小口径组织工程血管，共取3次；再行HE染色，免疫组化行内皮细胞、平滑肌细胞鉴定，并且在倒置相差显微镜下观察其形态。结果倒置相差显微镜下观察结果显示小鼠胚胎干细胞诱导分化出的平滑肌细胞呈长梭形，而内皮细胞呈“鹅卵石”样；HE染色显示平滑肌、内皮细胞在PLGA表面上延伸生长；动物体内移植实验结果显示，管状PLGA皮下小口径组织工程血管移植后逐渐降解、直至变薄中断，免疫组织化学和HE染色显示管腔内的血管平滑肌样细胞和内皮样细胞在PLGA上呈片状融合生长，并见大量的细胞外基质。结论胚胎干细胞诱导的平滑肌和内皮细胞与PLGA有良好亲和性，可以用胚胎干细胞与PLGA制作小口径组织工程血管。     

血管平滑肌细胞和内皮细胞联合种植生物可降解材料的组织工程血管研究

目的探讨应用组织工程学方法构建人工血管片。方法应用聚(乙交酯/丙交酯)二元共聚物(PLGA)无纺网织片作为细胞支架,体外逐层顺序种植血管平滑肌细胞、内皮细胞制作组织血管片。免疫组织化学方法鉴定平滑肌细胞、内皮细胞;扫描电镜观察组织血管片生长情况;放射免疫方法检测内皮细胞分泌内皮素、前列腺素E的功能。结果免疫组织化学染色鉴定平滑肌细胞肌动蛋白染色阳性,内皮细胞凝血Ⅷ因子相关抗原染色阳性。组织血管片在扫描电镜下显示出细胞融合,连接成片。放射免疫方法可以检测出平滑肌细胞和内皮细胞联合培养的组织片分泌内皮素(229pg/ml±34pg/ml),分泌前列环素的代谢产物6-酮-前列腺素F1α(402pg/ml±108pg/ml)。结论应用PLGA无纺网织片作为细胞支架,体外逐层种植血管平滑肌细胞、内皮细胞制作的组织血管片,基本具备正常血管组织基本形态结构和功能。     

应用骨髓干细胞和自制胶原-壳聚糖构建组织工程心瓣膜

目的探讨应用骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导分化的内皮细胞为种子细胞,以胶原-壳聚糖复合物为支架材料,运用组织工程学的原理和方法体外构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)的可行性。方法兔主动脉壁体外分离、培养、传代平滑肌细胞、成纤维细胞,将培养的成纤维细胞、平滑肌细胞与兔骨髓基质干细胞诱导分化的内皮细胞按顺序种植在预湿处理的胶原-壳聚糖复合支架上,通过组织学及倒置显微镜、扫描电镜观察内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞在支架上生长、增殖和基质分泌情况。结果 HE染色示内皮细胞能够在胶原-壳聚糖复合支架黏附、伸展、增殖,在TEHV表面长成连续的细胞层;扫描电子显微镜示TEHV表面光滑,细胞生长良好,细胞层完整,且瓣膜表面的内皮细胞具有合成和分泌前列环素(PGI2)的功能。结论以兔主动脉壁体外分离、培养、传代的平滑肌细胞、成纤维细胞和BMSCs诱导分化的内皮细胞为种子细胞,依次种植在胶原-壳聚糖复合支架上可以构建TEHV,且内皮细胞能够分泌PGI2。     

Human vascular smooth muscle cells and endothelial cells cocultured on polyglycolic acid (70/30) scaffold in tissue engineered vascular graft

Background Current prosthetic, small diameter vascular grafts showing poor long term patency rates have led to the pursuit of other biological materials. Biomaterials that successfully integrate into surrounding tissue should match not only the mechanical properties of tissues, but also topography. Polyglycolic acid (70/30) has been used as synthetic grafts to determine whether human vascular smooth muscle cells and endothelial cells attach, survive and secrete endothelin and 6-keto-prostaglandin F1α (6-keto-PGF1α).Methods Endothelial cells and smooth muscle cells were isolated from adult human great saphenous vein. They were seeded on polyglycolic acid scaffold in vitro separately to grow vascular patch (Groups A and B respectively) and cocultured in vitro to grow into vascular patch (Group C). Smooth muscle cells and endothelial cells were identified by immunohistochemical analysis and growth of cells on polyglycolic acid was investigated using scanning electron microscopy. The levels of endothelin and 6-keto-PGF1α in the culturing solutions were examined by radioimmunology to measure endothelial function. Results Seed smooth muscle cells adhered to polyglycolic acid scaffold and over 28 days grew in the interstices to form a uniform cell distribution throughout the scaffold. Then seed endothelial cells formed a complete endothelial layer on the smooth muscle cells. The levels of endothelin and 6-keto-prostaglandin F1 alpha in the culturing solution were (234±29) pg/ml and (428±98) pg/ml respectively in Group C and (196±30) pg/ml and (346±120) pg/ml in Group B; both significantly higher than in Groups A and D (blank control group, all P<0.05 ). Conclusions Cells could be grown successfully on polyglycolic acid and retain functions of secretion. Our next step is to use human saphenous vein smooth muscle cells and endothelial cells to grow tubular vascular grafts in vitro.     

羟基磷灰石膜复合材料与人血管内皮细胞的相容性

目的利用脉冲激光沉积方法在人工心脏机械瓣膜上沉积纳米相羟基磷灰石(HA)薄膜,探讨其组织相容性。方法将人血管内皮细胞与纳米相HA薄膜复合材料体外复合培养,进行形态学和功能测定,同时分别测定在HA材料组和空白对照组中血管内皮细胞分泌一氧化氮(NO)、前列环素(PGI2)水平。结果人血管内皮细胞能在纳米相HA薄膜复合材料上良好地黏附、增殖、生长。人脐静脉血管内皮细胞分泌NO和PGI2在HA材料和空白对照组差异无显著性(P>0.05)。结论纳米相HA薄膜复合材料具有良好的细胞相容性,可作为组织工程化机械瓣膜材料。     

酶消化法分离老龄SD大鼠血管平滑肌细胞

目的采用酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞,为血管疾病的研究提供大量的原代平滑肌细胞。方法无菌取老龄SD大鼠主动脉,采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化分离血管平滑肌细胞,自然纯化及差速贴壁纯化血管平滑肌细胞,免疫组化鉴定平滑肌细胞α肌动蛋白。结果免疫组化染色显示细胞纯度在95%以上。结论酶消化法用于血管平滑肌细胞的培养有利于获得大量的高纯度细胞供实验研究。