抑制性消减杂交技术在研究热适应机制中的应用

目的 探索热适应动物体内在常温静息状态下是否存在与热适应相关的基因差异表达。评估从基因差异表达角度研究热适应机理的可行性。方法在大鼠肝组织标本上提取mRNA，反转录成双链cDNA，应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)比较热适应组与常温对照组基因的差异，构建差异表达基因消减文库。采用PCR-Select Differential Screening技术鉴定是否存在差异表达的基因。结果初期实验证实6个cDNA片段为差异表达。结论热适应大鼠在常温静息状态下肝脏组织中存在热适应相关基因的差异表达。推测可能与大鼠保持热适应能力有关。提示通过分离热适应相关的差异表达基因研究热适应机制是一种可行的思路。     

抑制性消减杂交技术在研究热适应机制中的应用

目的探索热适应动物体内在常温静息状态下是否存在与热适应相关的基因差异表达,评估从基因差异表达角度研究热适应机理的可行性。方法在大鼠肝组织标本上提取mRNA,反转录成双链cDNA,应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)比较热适应组与常温对照组基因的差异,构建差异表达基因消减文库。采用PCR-Select Differential Screening技术鉴定是否存在差异表达的基因。结果初期实验证实6个cDNA片段为差异表达。结论热适应大鼠在常温静息状态下肝脏组织中存在热适应相关基因的差异表达,推测可能与大鼠保持热适应能力有关。提示通过分离热适应相关的差异表达基因研究热适应机制是一种可行的思路。     

人肝脏高凝状态相关基因的筛选

目的 筛选人肝脏高凝状态（PTS）相关基因的全长cDNA序列。方法 采用差异筛选法对本室建立的PTS大鼠肝脏差异表达基因消减cDNA文库进行筛选；以获得的差异cDNA克隆为模板，采用PCR方法扩增目的片段；以PCR产物作探针，用噬菌斑原位杂交法筛选人肝脏cDNA文库，经初筛、二筛和三筛后，将获得的阳性克隆转入E．coli BM 25．8，使λTripIEx环化成质粒pTripIEx，经酶切鉴定后进行DNA测序。结果 从人肝脏cDNA文库中筛选获得4条全长cDNA序列，经序列测定及生物信息学分析发现，其中3条的表达产物分别为纤维蛋白原、纤维蛋白原相关蛋白、10号染色体开放阅读框架104mRNA；另1条与氨基甲酰磷酸合成酶1同源。结论 以PTS大鼠肝脏差异表达基因cDNA为探针，从人肝脏cDNA文库中筛选获得4条PTS相关cDNA全长序列。     

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库的构建与初筛

目的构建高凝状态(prothrom botic states,PTS)大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库并进行初步筛选。方法从PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取po ly A mRNA,分别以po ly A mRNA为模板,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成400~600 bp大小的片段。以PTS大鼠cDNA作为T ester,对照大鼠cDNA为D river,进行抑制性消减杂交。将消减杂交第二次PCR产物cDNA克隆至pM D 18-T载体上,然后转化细菌,获得PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。用巢式PCR扩增法制备“正向”和“反向”消减cDNA探针;采用差异筛选方法,用这两种探针对PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库进行筛选;将获得的阳性克隆cDNA进行序列分析;并与G enB ank DNA数据库中的DNA序列进行同源性分析。结果成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库,初步筛选发现两条PTS差异表达cDNA片段。结论成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。     

大鼠部分肝切除后再生肝组织中上调表达基因的克隆与分析

目的克隆肝再生中差异表达的基因,为最终阐明肝再生的调控机制奠定基础。方法采用大鼠短间隔连续肝切除(SISPH)模型,用抑制性消减杂交技术(SSH)研究4～8h之间差异表达的基因。结果用SSH分析0、4h、8h和12h模型的4～8h再生肝,筛选出33个与肝再生有关的上调表达序列标记(EST),其中17个为已在肝再生中报道的已知基因,6个为首次报道的已知基因,10个为大鼠中尚未报道的新基因,并对新基因在NCBI进行注册。结论在肝再生中SSH是一个分离肝再生差异表达基因的强有力工具,这些差异基因的分离,尤其是在肝再生中首次报道的已知基因和新基因的分离,可为进一步阐明肝再生的机制奠定基础。     

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库的构建

目的构建高凝状态(prothrombotic states，PTS)大鼠肝脏差异表达基因反向清减cDNA文库．方法用高淀粉饲料喂养制备大鼠PTS模型，从PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取poly A^ mRNA，分别以1．5 μg poly A^ mRNA起始，依次合成单链和双链cDNA，经酶切成平均大小为400-600 bp的片段。以PTS大鼠cDNA作为Driver，对照大鼠cDNA为Tester。将Tester分为两组，分别连上不同的接头，与Driver进行两次消减杂交和两次抑制性PCR。将第二次PCR产物cDNA克隆至pMD18-T载体上，然后转化细菌，转化后的细菌接种于含50 μg／ml ampicillin、IPTG、和X-gal的LB琼脂平板上，将克隆计数。结果获得的克隆78％为白色克隆，成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库．结论以1．5 μg poly A^ mRNA起始，采用抑制性清减杂交，构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库。     

两型星形胶质细胞基因表达谱差异的初步观察

目的:研究不同型别星形胶质细胞的基因表达谱,比较1型和2型星形胶质细胞基因表达谱之间的差异,以进一步研究两者的生物学特性及其功能。方法:原代培养新生SD大鼠大脑皮质混合胶质细胞,经振荡和差速消化纯化培养1型星形胶质细胞(T1A)和2型星形胶质细胞(T2A);应用基因芯片技术获取T1A和T2A的基因表达谱,并对两者的基因表达谱进行初步分析。结果:基因芯片上检测点4096个,共有差异表达基因267条,其中113条在T1A中高表达,154条在T2A中高表达。结论:本实验获得大鼠大脑T1A和T2A的基因表达谱,首次报道267条存在于T1A和T2A之间的差异表达基因。     

以基因芯片技术研究Kkay小鼠2型糖尿病相关基因

目的以基因芯片技术研究Kkay2型糖尿病小鼠的差异表达基因。方法以包含8192条小鼠的cDNA基因表达谱芯片研究Kkay2型糖尿病小鼠肝脏的基因表达谱。结果共筛选出差异表达基因154条,包括全长基因68条,表达序列标识(EST)86条;其中40条基因表达增加,114条表达降低。结论多数已知功能基因的表达异常与以往的研究结论是一致的;cDNA基因芯片技术能够高通量分析糖尿病相关基因。     

应用抑制性消减杂交技术研究机体获得热适应后肝脏细胞线粒体呼吸链相关基因的差异表达

目的：研究机体获得热适应后肝脏细胞线粒体呼吸链相关基因的差异表达。方法：常规方法建立大鼠热适应模型，分别从正常大民及热适应大鼠肝脏细胞个提取总RNA并抽提mRNA，按照SSH常规操作方法，构建cDNA消减文库，筛选阳性克隆并加以鉴定以得到带有差异表达基因的克隆。结果：成功构建具有高消减效率的热适应大民肝脏细胞cDNA消减文库，筛选鉴定启发现6个克隆含有差异表达基因。测序结果显示其个3个分别为热休克蛋白基因Hspel、线粒体细胞色素氧化酶C亚单位和NADH脱氢酶亚单位Ⅲ基因ND3。结论：三种基因的差异表达征明了线粒体呼吸铁功能的增强在细胞的代偿功能个的重要作用，线粒体在热适应时动物体对高温的代偿性反应个发挥总参与热耐力形成、提高机体抗热损伤能力的重要作用。     

肿瘤转移相关基因的表达谱研究

目的：运用基因表达谱芯片技术对肿瘤转移相关基因的表达谱进行研究。方法：对临床切除的肝癌和胰腺癌组织及相应的对照正常组织进行总ＲＮＡ抽提,纯化后的ｍＲＮＡ进行逆转录制备杂交探针,应用ＢｉｏＤｏｏｒ４０９６和ＢｉｏＤｏｏｒ１２８００的全长基因ＤＮＡ芯片筛选与肝癌和胰腺癌转移相关的基因。杂交后的信号用ＳｃａｎＡｒｒａｙ３０００扫描,结果用ＩｍａＧｅｎｅ３．０软件分析。结果：对肝癌和胰腺癌基因表达谱进行分     

cDNA微阵列技术对肺鳞癌、肺腺癌基因表达谱的研究

目的：利用cDNA微阵列技术研究肺鳞癌、肺腺癌基因表达谱，并与肺炎性假瘤基因表达谱进行比较，筛选肺鳞癌、肺腺癌的差异表达基因，及肺鳞癌、肺腺癌的共同表达基因，为研究肺癌的分子机制及肺癌的早期诊断和治疗提供线索。方法：用含4096个基因的人基因表达谱芯片研究肺鳞癌、肺腺癌及肺炎性假瘤的基因表达谱。结果：肺鳞癌差异表达基因591个，其中筛选出在肺炎性假瘤中没有差异表达的基因476个，上调的有293个，下调的有183个；肺腺癌差异表达基因524个，其中在肺炎性假瘤中没有差异表达的基因460个，上调的有214个，下调有246个；有113个基因在肺鳞癌与肺腺癌中均出现差异表达。结论：肺鳞癌、肺腺癌存在不同的基因表达谱，筛选出的特异表达基因和共同表达基因为进一步研究肺癌的发生、发展和肺鳞癌与肺腺癌的分子特征提供了重要线索。     

转染人pIgR的小鼠鼻咽上皮细胞在EBV感染前后基因表达谱差异

目的 应用cDNA阵列技术研究转染人多聚免疫球蛋白受体(hpIgR)的二亚硝基哌嗪(n，n′-dinitrosoperazine，DNP)转化的小鼠鼻咽上皮(TMNE)细胞系在：EBV感染前后基因表达谱差异，探索EBV在鼻咽癌发病过程中的作用及鼻咽癌的发病机制。方法提取转染hpIgR的TMNE细胞在EBV感染前后的总：RNA，逆转录成α-^32p-dATP标记的cDNA探针，与Atlas^TM mouse cancer array 1．2阵列膜进行杂交。利用AtlaslmageTM软件分析基因表达差异。结果 共有25个基因表达水平发生了改变．有23个基因表达上调，2个基因表达下调。结论 EBV感染可使转染细胞的多个基因表达发生改变，这些基因可能与鼻咽癌的发生、发展有关。     

家族性急性髓系白血病差异表达基因的筛选与鉴定

目的分离家族性急性髓系白血病患者骨髓中差异表达的基因,在基因水平上探讨急性白血病发生发展的分子机制。方法应用Super SMART和抑制性消减杂交（SSH）技术,构建家族性急性髓系白血病cDNA消减文库;应用差异筛选技术进行差异表达片段的筛选与鉴定;测序结果进行BLAST同源性比对分析。结果成功构建了家族性急性髓系白血病cDNA消减文库;克隆、筛选并鉴定了17条基因片段,与已知基因同源,11条为未知基因片段。结论SSH技术是筛选差异表达基因的有效方法;获得多个与细胞增殖和分化相关的已知基因;获得11条新基因EST片段,并被GenBank收录。     

用荧光差异显示法分离新的肝细胞癌相关基因

目的 :寻找新的肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)相关基因。方法 :应用荧光 差异显示 (fluorescentdifferentialdisplay)技术分析人HCC、配对非癌肝、胎肝、正常肝等组织之间的基因差异表达 ,差异表达cDNA片段 ,经测序后 ,再用RNA狭缝杂交对部分差异片段在上述 4种组织中的表达进行验证。结果 :共得到差异表达cDNA片段 110条。经狭缝杂交筛选 ,获得了 4条阳性片段 ,未知cDNA片段L2和与人醛缩酶B 99.5 %同源的cDNA片段L7在部分HCC中特异性低表达 ,未知cDNA片段LC2 7和与人Nip3基因 99.4%同源的cDNA片段LC2 0在部分HCC中特异性高表达。结论 :确认了 4条HCC相关基因。其中L2和人醛缩酶B基因可能为阻抑HCC发生、发展的基因 ,而人Nip3基因和LC2 7可能为促进HCC发生、发展的基因。L2和LC2 7为目前未知的新基因。     

DHPG诱导的大鼠海马脑片癫癎样放电模型基因表达谱分析

目的 研究代谢型谷氨酸受体-Ⅰ（mGluR-Ⅰ）激动剂D-对羟基苯甘氨酸（DHPG）诱导的大鼠离体海马脑片癫癎样放电模型的基因表达谱。方法 以含50 μmol DHPG的人工脑脊液持续灌流大鼠离体海马脑片,诱导建立癫癎样放电模型（DHPG组,n=3）。采用cDNA微阵列分析技术获得DHPG组的基因表达谱,与对照组（n=3）比较筛选出差异表达基因,并进行富集功能分类。结果 与对照组比较,DHPG组样本模型分别筛选出的上调基因206个,下调基因489个;其中差异表达达1.5倍的上调基因67个,下调基因86个;2.0倍以上的上调基因6个,0.5倍以下的下调基因25个。富集功能分类结果显示,差异表达基因功能涉及蛋白结合（19个）、分子功能、钙离子结合和核苷酸结合等多方面。结论 癫癎样放电及mGluR-Ⅰ激动剂的作用均涉及多种基因,是一复杂的调控过程。实验为进一步研究提供了依据。     

E2F-1过表达对胃癌细胞生物学行为影响的分子机理初步研究

目的 利用基因表达谱芯片技术筛选过表达E2F-1的胃癌MGC-803细胞与对照组间的差异表达基因,探讨E2F-1对胃癌细胞生物学行为影响的分子机理。方法 分别抽取转染E2F-1的胃癌MGC-803细胞和未转染E2F-1的胃癌MGC-803细胞的总RNA。纯化mRNA,逆转录合成cDNA标记后,与22K人类基因表达谱芯片进行杂交,扫描后筛选出表达差异的基因。随机选取3个差异表达基因,分别设计引物,用半定量RT-PCR检测验证。 结果 在21522条基因中,两组细胞间的差异表达基因有740条,其中上调基因405条,下调基因335条。差异基因中有73条功能信息不明。随机选取的3个差异表达基因的RT-PCR结果与基因芯片扫描结果相似,具有相同的方向性。结论 胃癌的发生发展是多基因相互作用、多种信号通路相互调节的结果。生物信息学分析显示, E2F-1基因可以通过TP53信号传导途径影响胃癌MGC-803细胞生物学行为的改变,还与众多基因的差异性表达密切相关。     

大鼠骨髓基质细胞传代培养中相关基因的差异表达

目的:研究大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)体外传代培养中相关基因的差异表达.方法: 取大鼠骨髓,分离、培养骨髓基质细胞并传代,抽取细胞(mRNA)并逆转录成cDNA探针,用含有1176个基因片段的cDNA芯片检测相关基因的差异表达,整理、分析实验数据.结果: 传至P3代细胞与原代细胞(P0)相比有104个基因的差异表达超过了3倍,其中有53个基因表达量明显上升,51个基因表达量明显下降,主要涉及一些细胞粘附分子及胞外基质、细胞信号与传导、细胞受体和细胞骨架等方面的相关基因.结论: 通过基因芯片技术可以显示BMSCs在体外传代培养中众多基因的差异表达,而这些基因的差异表达与细胞的增殖和分化存在一定的关系,此为今后从基因水平上评价BMSCs在传代及临床应用中的稳定性提供了理论依据.     

甘草酸对大鼠肝纤维化过程中肝组织基因表达的影响

目的 研究甘草酸抗肝纤维化作用的分子机制。方法 建立四氯化碳诱导肝纤维化和甘草酸治疗大鼠模型;选取正常组、造模组、治疗组大鼠肝脏各1只进行cDNA微阵列研究;从cDNA微阵列结果中选取一个在造模大鼠肝脏中表达明显异常、但经甘草酸治疗后表达正常的基因（smurf2),用半定量RT-PCR检测此基因在不同实验阶段(第1、2、4、8周)3组大鼠中的表达变化。结果 通过cDNA微阵列发现smurt2、PTAFR、CYP2D6、FGG等多种与炎症、代谢有关的基因在造模大鼠肝脏中表达上调,甘草酸治疗后恢复正常表达。通过半定量RT-PCR研究发现,经四氯化碳处理第1周时smurt2在3组大鼠肝脏中表达无异常变化,第2周时在造模和治疗组中表达均下调,第4周时在造模组中表达上调、治疗组中表达下调,第8周时在造模组表达下调,治疗组上调。结论 调控smurf2基因转录水平可能是甘草酸抗肝纤维化作用的分子机制之一。     

白血病原代骨髓基质细胞诱导Jurkat细胞基因差异表达研究

目的研究白血病骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)诱导Jurkat细胞相关基因表达的变化.方法采用Percoll体外分离正常人、初治急性白血病患者BMSCs;采用抑制性消减杂交技术建立白血病BMSCs诱导Jur-kat细胞差异表达基因的cDNA文库;并对差异表达的基因进行初步鉴定与分析.结果成功地建立了白血病BMSCs诱导的Jurkat细胞上调和下调差异表达基因的cDNA文库;初步筛选克隆到30个上调差异表达基因和22个下调差异表达基因cDNA片段;这些基因功能主要与细胞周期调控、细胞凋亡、细胞能量代谢有关.结论白血病BMSCs能诱导Jurkat细胞基因发生差异表达.     

大鼠坐骨神经Wallerian溃变过程中LncRNA的差异表达分析*

目的：采用分子生物学和生物信息学方法筛选大鼠坐骨神经损伤后Wallerian溃变(Wallerian degeneration, WD)过程中的关键长链非编码RNA(long none coding RNA, LncRNA),并分析该关键LncRNA分子在大鼠坐骨神经损伤过程中的作用。方法：采用Affymetrix大鼠Non Coding RNA芯片,分析大鼠坐骨神经损伤后WD过程中差异表达的LncRNA;通过实时定量聚合酶链式反应验证关键LncRNA的表达;预测关键LncRNA相关基因及功能。结果：基因芯片分析结果显示共有显著差异性LncRNA 708个和mRNA 2 649个,上调LncRNA 283个,下调LncRNA 425个。通过编码—非编码基因共表达分析和预测竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA, ceRNA)机制,显示在WD过程中发挥作用的LncRNA,其中上调19个,下调17个。WD早期差异表达的LncRNA靶基因11个,WD后期差异表达的LncRNA靶基因31个。结论：大鼠坐骨神经损伤后,LncRNA显著差异性表达,提示LncRNA在周围神经损伤修复与再生过程中可能发挥了一定作用,为进一步分析LncRNA在神经再生中的作用提供了实验基础。