一种比格犬雌二醇β受体剪切异构体的克隆和序列分析

目的 分析比格犬下丘脑-垂体-性腺轴,雌二醇β受体剪切异构体的存在情况.方法 根据NCBI数据库上的比格犬雌二醇受体的基因序列,设计两对特异性引物,以比格犬的卵巢、子宫、下丘脑和垂体的总RNA为模板进行反转录,并利用两对特异性引物扩增比格犬雌二醇受体的基因,对其中的主要条带进行克隆测序.结果 获得了比格犬雌二醇受体的全长cDNA序列,对主要条带进行克隆测序的结果表明,该序列是一种比格犬雌二醇受体的剪切异构体.结论 比格犬雌二醇β受体剪切异构体与小鼠和人的组成有较大的不同,需要进一步系统研究.     

比格犬雌激素受体β的原核表达、纯化及鉴定

目的 研究比格犬雌激素受体β(Estrogen receptor β,ERβ)及其剪接异构体在生殖调控中的功能,构建比格犬ERβ的pMAL-p5x/ERβ 480 DE3 E.coli重组菌株,并进行纯化和鉴定.方法 Trizol法提取发情期比格犬下丘脑总RNA,RT-PCR获得cDNA,以NCBI网站公布的比格犬ERβ基因CDS序列设计特异性引物,扩增ERβ保守区基因编码序列(16-496 bp),连接原核表达载体pMAL-p5x,筛选、鉴定阳性克隆并测序.将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,再转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,表达产物经经麦芽糖亲和树脂(Amylom Resin)亲和层析分离纯化,并对纯化的融合蛋白进行鉴定.结果 构建了pMAL-p5x/ER(a)480重组质粒,在DE3大肠杆菌中诱导表达出MBP-ERβ融合蛋白,SDS-PAGE显示分子量约为60 000,与预期结果一致;优化了MBP-ERβ表达体系的表达条件:分别在0.2％葡萄糖,100 μg/ml Ampcillin,0.1mmol/L IPTG 37℃培养5h或在0.2％葡萄糖,50 μg/ml Ampcillin,0.2mmol/L IPTG 37℃培养3h,融合蛋白表达效果比较好.结论 构建了pMAL-p5x/ERβ480原核表达重组质粒,获得了比格犬MBP-ERβ融合蛋白,为犬种属特异性ERβ多克隆抗体的制备及功能分析奠定了基础.     

荧光定量RCR检测比格犬雌激素β受体mRNA在间情期与发情期表达量的差异

目的对比格犬发情期与间情期ERβ基因在性腺组织器官的变化状况进行荧光定量,明确ERβ基因在发情期与间情期下丘脑-垂体-性腺轴上的表达量差异情况,为深入研究比格犬发情机制提供基础。方法作为调控生殖的关键基因,ERβ基因位于比格犬下丘脑-垂体-性腺轴上,因此分别取处于发情期和间情期的比格犬,提取下丘脑、垂体、卵巢和子宫的RNA,反转录后对ERβ基因mRNA的表达量进行荧光定量PCR检测。结果间情期比格犬卵巢、子宫、垂体、下丘脑内ERβ基因mRNA的表达量分别是发情期比格犬卵巢、子宫、垂体、下丘脑内ERβ基因mRNA表达量的0.35倍、0.17倍、0.44倍、0.43倍。结论 ERβ基因在处于发情期的比格犬下丘脑-垂体-性腺轴内表达量均上调。     

比格犬ERβ1293 基因真核载体构建及在293T细胞中的表达及定位

【摘要】目的：观察比格犬Myc 标签ERβ1293重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位。方法：以pEGFP-N1-ERβ1293重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ1293基因编码区全长。Myc标签ERβ1293重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术（Western Blotting）和间接免疫荧光技术（Indirect immunofluorescence,IF）鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T细胞中的表达和定位情况。结果：成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中。Western Blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质。结论：前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ1293编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的基因编码蛋白定位在细胞中发生变化。     

比格犬ERβ_(1293)基因真核载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达和定位

目的观察比格犬Myc标签ERβ1293重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位。方法以pEGFP-N1-ERβ1293重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ1293基因编码区全长。Myc标签ERβ1293重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术(Western blotting)和间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescence,IF)鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T细胞中的表达和定位情况。结果成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中。Western blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质。结论前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ1293编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的基因编码蛋白定位在细胞中发生变化。     

比格犬ERβ剪切异构体ERβ419沉默表达载体的构建及筛选

目的构建最有效的慢病毒介导RNAi干扰序列,未来将应用于比格犬ERβ419的未知生物学功能的探索。方法模拟比格犬ERβ419靶细胞筛选针对目的基因mRNA设计的最佳干扰序列实验,通过qRT-PCR和Western Blot技术筛选最佳沉默表达载体序列。结果qRT-PCR结果显示,ERβ419-shRNA1(P0.01)和ERβ419-shRNA3(P0.01)的差异表达极显著,Western Blot结果与qRT-PCR结果一致,ERβ419-shRNA3的干扰效果最佳。结论 ERβ419-shRNA3最有效地抑制了目的基因的表达,未来将应用于探索比格犬ERβ419未知生物学功能对比格犬生殖系统影响的研究,并进而预防和治疗比格犬繁殖机能障碍性疾病。     

基因新异构体的剪接特征及其生物学意义

目的探讨基因新异构体的剪接特征及生物学意义.方法对人肾上腺组织cDNA文库作大规模EST分析及全长cDNA克隆.结果发现7条由不同剪接方式形成的新的异构体,其中4个剪接特点不符合经典的gt-ag规律,且剪接方式多样,人类固醇5a还原酶跨越两个外显子,KIAA0971的异构体与KIAA0971比较,有两段缺失,且造成编码框架移动,均按gt-ag方式.人17.9kd蛋白与从基因组序列预测的cDNA比较增加一个新外显子,人甲状腺激素受体相互作用蛋白15的第5号外显子端具有2个-ag的接点.结论表明体内mRNA成熟过程中剪接方式呈现多样性及复杂性.     

基因新异构体的剪接特征及其生物学意义

目的 探讨基因新异构体的剪接特征及生物学意义。方法 对人肾上腺组织cDNA文库作大规模DST分析及全长cDNA克隆。结果 发现7条由不同剪接方式形成的新的异构体,其中4个剪接特点不符合经典的gt-ag规律,且剪接方式多样,人类固醇5α还原酶跨越两个外显子,KIAA0971的异构体与KIAA0971比较,有两段缺失,且造成编码框架移动,均按gt-at方式。人17．9kd蛋白与从基因组序列预测的cDNA比较增加一个新外显子,人甲状腺素受体相互作用蛋白15的第5号外显子端具有2个－ag的接点。结论 表明体内mRNA成熟过程中剪接方式呈现多样性及复杂性。     

比格犬ERβ1293 基因真核载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达和定位

目的 观察比格犬Myc 标签ERβ₁₂₉₃重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位。方法 以pEGFP-N1-ERβ₁₂₉₃重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ₁₂₉₃基因编码区全长。Myc标签ERβ₁₂₉₃重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术（Western blotting）和间接免疫荧光技术（indirect immunofluorescence, IF）鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ₁₂₉₃在HEK293T细胞中的表达和定位情况。结果 成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ₁₂₉₃重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中。Western blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质。结论 前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ₁₂₉₃编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的基因编码蛋白定位在细胞中发生变化。     

人结肠癌组织环加氧酶-2 mRNA剪接异构体片段分离与克隆

目的 探讨人结肠癌组织中是否存在环加氧酶-2(COX-2)选择性剪接异构体的表达及其可能意义。方法 针对人COX—2 DNA第7、8外显子序列，设计一对全新引物，并采用RT—PCR技术，从结肠癌组织中分离COX—2 mRNA，然后对电泳条带进行克隆、测序和分析。结果 正常结肠组织和结肠癌组织均发现COX—2目的条带(252bp)，但结肠癌组织则出现了一条新的电泳带(534bp)，经克隆和测序证实，该条带除目的条带的COX—2 DNA的第7、8外显子序列外，还包含第7、8外显子间的内含子序列，即保留的内含子(282bp)。根据阅读框推测，在保留的内含子第48～50碱基出现终止密码。结论 首次发现结肠癌组织中存在COX—2基因的选择性剪接异构体(Genbank accession number：BU493602，AY1512980)，其所编码蛋白可能较已报道的COX—2酶蛋白小，且蛋白质的C末端缺少阿斯匹林作用位点。     

人EIF2B4基因一个新的可变剪接产物及其鉴定

目的对人EIF2B4基因新的可变剪接产物进行鉴定。方法应用长链RT-PCR技术扩增人外周血EIF2B4基因编码区全长序列并进行T克隆及序列测定,用常规RT-PCR对新型可变剪接产物进行验证。结果在EIF2B4基因转录产物中检测出正常变异体2和3(两者只相差3个碱基),同时发现一个外显子7缺失26bp的转录产物。结论利用长链RT-PCR结合T克隆-测序的方法,发现人EIF2B4基因的一个新型可变剪接产物。     

黔西南汉族人群表皮生长因子前体蛋白编码序列第14和16外显子中单核苷酸多态性研究

背景与目的 单核苷酸多态性(SNPs)在蛋白编码序列中多以富集成簇的方式分布,并提示其可能有民族区域和人种之间的差异性,然而SNPs在黔西南汉族人群表皮生长因子前体蛋白(preproEGF)编码序列第14和16外显子中的分布状况迄今尚未见报道,本研究拟对35例黔西南汉族受试者进行研究,旨在分析SNPs在preproEGF编码序列第14和16外显子中的分布特征。方法 设计合成4条引物,分别对35例汉族受试者preproEGF编码序列第14和16外显子区段进行PCR扩增和产物的DNA测序;检索单核苷酸多态性资料库（dbSNP）获取资料并与测序结果进行对比分析。结果 35例黔西南汉族受试者中13例（37.1%）在preproEGF编码序列的2 525 bp位点出现SNPs,基因型为AG和GG,频率分别为69.2%和30.8%,其等位基因频率分别为A 34.6%和G 65.4%;27例（77.1%）在2 576 bp位点有SNPs,基因型为AA和AG,频率分别为66.7%和33.3%,等位基因频率分别为A 83.3%和G 16.7%。相比之下,北京汉族受试者较黔西南汉族受试者在preproEGF编码序列第14外显子内多了1个单核苷酸多态位点,即2 619 bp位点;欧美等其他民族不仅在preproEGF编码序列第14外显子内分布有rs199935855等7个SNPs,而且在其第16外显子内也分布有rs149396988等6个SNPs;黔西南汉族和北京汉族受试者在preproEGF编码序列的第16外显子内均未见有SNPs分布。结论 在黔西南汉族、北京汉族和欧美等民族的preproEGF编码序列第14和16外显子中,SNPs分别具有各民族、各种族的特征性分布,据此可区分不同地域的种族和人群,甚至进行个体识别。也可将这些呈特征性分布的SNPs视为遗传标记进而深入研究SNPs与疾病发生的关系。     

蛋白激酶A催化亚基差异性地调节tau外显子10的可变剪接

tau外显子10的可变剪接使得tau变异体含有3个或4个微管结合片段,分别称为3R-tau和4R-tau。正常人脑表达等量的3R-tau和4R-tau,它们的表达失衡可引起神经纤维退行性疾病。本文利用迷你tau基因,通过过表达和RNA沉默技术,研究了PKA的催化亚基（PKA-Cα）和（PKA-Cβ）对tau外显子10可变剪接的调节,发现PKA-Cα促进tau外显子10的编码,PKA-Cβ抑制外显子10的编码。这2种催化亚基在细胞内的定位也不尽相同,在HeLa细胞中PKA-Cα的定位以细胞核为主,而PKA-Cβ则以细胞浆为主。在阿尔茨海默病（AD）患者脑中PKA的活性和表达均下降,通过引起tau外显子10的可变剪接的失调,使得3R-tau和4R-tau的表达失衡,加速神经纤维退行性病变。     

Dystrophin基因3～5号外显子缺失连接片段的克隆和测序

目的 通过对抗肌萎缩蛋白（dystrophin）因3～5号外显子缺失后连接片段的克隆和测序分析，探讨dystrophin基因缺失的发生机制。方法 先以外显子PCR反应检测证实1例杜氏肌营养不良症患者3～5号外显子缺失，然后在2、5号内含子上用PCR步移方法寻找断裂位点，最后用靠近断裂位点处设计的引物，以PCR法直接扩增dystrophin基因的缺失连接片段并测序，测序结果和正常内含子序列作对比分析。结果 获得2113bp PCR产物，本例基因缺失片段长约49000bp。5’端断裂点位于2号内含子短散在元件Alu序列内，3’端断裂点在单一序列，附近有TTTAAA序列。断裂点附近有较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点。连接片段插入了26bp序列并在断裂点周围形成3个13bp的短序列重复（GGCTTATATTTAA）连接断裂点两端。结论 推测重复序列、断裂点附近较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点关联易引起基因的断裂重组，加上非同源末端连接修复机制等综合因素可能是导致基因缺失的重要原因。     

比格犬卵巢子宫内雌激素受体ERα、ERβ的免疫组织化学定位研究

目的 研究雌激素受体α, β在比格犬卵巢及子宫内的定位。 方法 采用免疫组化SP法DAB显色结合BCIP/NBT及AEC显色检测ERα、ERβ在比格犬子宫及卵巢内的表达。 结果 比格犬ERα主要表达于卵泡颗粒细胞、卵巢间质腺腺上皮细胞及子宫内膜腺体腺上皮细胞胞核内,胞质内仅有少量表达，而在卵泡膜内膜的间质细胞，腺体周围的基质细胞及小动脉血管内皮细胞和平滑肌细胞、小静脉内皮细胞的胞核内有少量表达。而ERβ则以相同的组织特异性主要表达于上述组织细胞的胞质内,在胞核内有微弱表达。ERα 表达于膜黄体细胞的胞核内，而在黄体颗粒细胞胞核与胞质内均有表达。而ERβ则仍特异表达于不同生理阶段黄体细胞的胞质内。BCIP/NBT与AEC双染未见ERα、ERβ在子宫内有明显的共表达现象。结论 比格犬ERα、ERβ 在子宫与卵巢组织内定位不同，ERα主要定位于胞核，在胞质内有微弱表达，而ERβ主要定位于胞质，在胞核内有零星表达。     

贵州省部分少数民族线粒体DNA 9bp序列缺失频率研究

目的: 研究中国贵州省部分少数民族线粒体DNA 9 bp 序列缺失情况.方法: 采用PCR法扩增线粒体基因组细胞色素氧化酶II和tRNAlys基因间非编码序列中含9bp序列缺失的片段,3%琼脂糖凝胶电泳检测缺失情况.结果: 各少数民族线粒体DNA 9 bp序列缺失频率为7.4%～23.4%,最低为银屏壮族,最高为沙井苗族.结论: 贵州省部分少数民族线粒体DNA 9bp 序列缺失频率较高,各民族DNA 9 bp序列缺失频率有一定差异.     

人类Vimentin基因第1，2，6，7内含子序列的测定

目的 人vimentin(VIM）基因位于10号染色本短臂1区3带,属于第Ⅲ型中间丝纤维蛋白基因。目前已知全部外显子序列及部分内含子序列。本测定了部分未知的VIM基因内含子序列。方法 通过已知VIM基因的外显子序列设计引物,用PCR扩增其未知的内含子片段,将PCR产物进行克隆测序。结果 共测得未知的4个内含子序列,内含子1长692bp,测得其全部序列;内含子2长2kb,测得其两端与外显子相接的序列,共1kb;内含子6长456bp,测得其全部旬;内含子7长404bp,测得其全部序列。结论 本研究PCR检测多例人VIM基因的内含子7大小为404bp,与献报道人类vimentin基因的内含子7大小为800bp相差很大,但引物两端外显子序列相同,另外,献报道的人类vimentin基因与外显子3相邻的第2内含子末端41nt的核苷酸序列与本研究所测的第2内含子末端序列完全不同。     

常染色体显性遗传帕金森病家系1例基因缺失序列分析

目的:分析常染色体显性遗传帕金森病家系的基因缺失.方法:根据Parkin基因外显子和内含子DNA序列合成14对引物,以人基因组DNA为模板,巢式PCR扩增,扩增产物纯化后直接测序.通过与正常人相应的DNA序列比较,检测1例常染色体显性遗传帕金森病家系基因缺失位点.结果:该家系检测到染色体6q25.2-q27Parkin基因外显子3中110 bp的缺失,第4和第5外显子检测到部分碱基的变异.结论:Parkin基因外显子3缺失的检出对常染色体显性遗传帕金森病的早期诊断和基因治疗具有指导意义.     

基于下丘脑-垂体-卵巢轴研究盐酸益母草碱对药物流产后子宫异常出血作用机制的实验研究

目的通过观察盐酸益母草碱（Leo）对药物流产后大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴（HPOA）内分泌功能的影响,探讨Leo抑制子宫异常出血作用的机制。方法采用早孕大鼠灌服米非司酮（8.3 mg/kg）和米索前列醇（100μg/kg）造成不完全流产大鼠模型,用放射免疫分析法（RIA）观察其血清黄体生成激素（LH）、卵泡刺激素（FSH）水平的变化;免疫组化法检测下丘脑中促性腺激素释放激素（GnRH）的表达;RT-PCR检测子宫组织中孕酮受体（PR）、雌二醇受体（ERα、ERβ）mRNA的表达。结果 Leo明显提高大鼠血清中LH、FSH的水平和下丘脑中GnRH蛋白的表达,明显上调药流后大鼠子宫组织中ERα、ERβmRNA的表达（P〈0.05或〈0.01）,而对PR mRNA没有明显影响（P〉0.05）。结论 Leo能明显抑制药物流产后大鼠子宫异常出血,其机制可能与其调节或改善HPOA神经内分泌功能紊乱及子宫ERα、ERβ水平的变化密切相关。     

由ALK1基因内含子突变引起的遗传性出血性毛细血管扩张症

目的 探讨遗传性出血性毛细血管扩张症发病的分子机制。方法（1）用聚合酶链式反应-单链构像多态性分析（PCR-SSCP）寻找异常突变的外显子及其相邻剪接位点。（2）通过DNA测序确定突变的类型。（3）使用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法确定剪接方式。结果 用PCRSSCP方法发现扩增ALK1基因第4外显子及相邻的部分内含子片段有突变位点。对有突该片段,用DNA测序检测,发现第4外显子的给位剪接点相邻碱基A＞T（ⅣS4＋3a＞t）的突变,并用反向测序确认。用RT-PCR方法检测ALK1基因表达mRNA情况,电泳和测序发现第4外显子的丢失。结论 ALK1基因的ⅣS4＋3a＞1突变,导致ALK1基因表达异常,形成无功能截短蛋白,引起HHT2。