显微激光薄化人胚胎透明带辅助孵出效果观察

目的:观察显微激光薄化人胚胎透明带进行辅助孵出的效果.方法:应用1.48μm二极管激光打孔仪对50个胚胎进行透明带薄化辅助孵出,另外51个胚胎作为对照,体外囊胚培养,观察囊胚形成及孵出情况.结果:薄化组囊胚形成率(50.0%)与对照组囊胚形成率(45.1%)间差异无统计学意义(P＞0.05);但薄化组囊胚发动孵出率和囊胚完全孵出率(88.0%,59.1%)均高于对照组(34.8%,12.5%)(P均＜0.05).结论:显微激光薄化人胚胎透明带辅助孵出能提高囊胚孵出率,是优于传统辅助孵出技术的一个好方法.     

单胚胎玻璃化冷冻对小鼠胚胎体外发育的影响

目的:比较单胚胎玻璃化冷冻与慢速冷冻对小鼠分裂期胚胎损伤和体外发育的影响,探讨使用玻璃化冷冻保存大量胚胎的可行性。方法:选择8-细胞胚胎随机进行改良的玻璃化和慢速冷冻,复苏后培养至囊胚孵出,计数胚胎复苏率、卵裂球死亡率、囊胚形成率、细胞团数、孵出率,并进行组间比较分析。结果:玻璃化冷冻组复苏率、卵裂球死亡率、囊胚形成率、孵出率、细胞团数分别为100%、12.7%、75.7%、66.4%、112,慢速冷冻组分别为87.1%、31.0%、35.5%、58.7%、78,除囊胚孵出率其余各指标两组间差异均具有统计学意义。结论:单胚胎玻璃化法冻存小鼠分裂期胚胎复苏后细胞成活率高,结构完整,更好的保持了胚胎的发育潜能。     

激光辅助孵化技术对囊胚期冻融胚胎移植患者妊娠结局的影响

目的:探讨激光辅助孵化技术对囊胚期冻融胚胎移植患者妊娠结局的影响。方法:选取2017年1月-2018年12月在本院行冻融囊胚解冻移植技术助孕的339例患者。按激光辅助方式不同分为A组190例和B组149例,A组行透明带削薄,B组行透明带打孔。比较两组胚胎复苏率、胚胎着床率、移植周期妊娠率以及子代出生情况。结果:两组移植胚胎数、优质囊胚率、胚胎解冻复苏率、移植周期妊娠率、胚胎着床率、流产率、活产率、出生缺陷率、早产率比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论:透明带削薄、透明带打孔两种激光辅助在囊胚期冻融胚胎移植中效果相近,临床可根据实际情况选择适宜的辅助孵化技术。     

猕猴胚胎干细胞的分离培养和鉴定

目的从体外培养成熟囊胚中分离并鉴定猕猴胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES cell).方法猕猴卵母细胞经体外成熟培养、体外受精和早期胚胎体外成熟培养后,获得猕猴囊胚.当囊胚由透明带自然孵出后,用细玻璃针剥离囊胚中的内细胞团(inner cell mass,ICM)并与饲养细胞进行共培养.由ICM分离,培养并鉴定胚胎干细胞集落.结果由4只FSH超排猕猴中共取得92个处于GV期的猕猴卵母细胞,选取其中的22个用HECM-10培养基培养后,获得6个高质量的囊胚,由此6个囊胚中分离得到3个内细胞团,并由此最终获得1株猕猴ES细胞,即RS5细胞.RS5细胞具高比例核/质比,核仁多,其细胞集落边缘平整,其内各单个细胞清晰.经约5个月的连续传代后,仍保持了正常二倍体的核型,其染色体数目为42条.碱性磷酸酶细胞组织化学染色为阳性,说明RS5细胞为未分化态的胚胎干细胞.经高密度和长时间培养后,RS5细胞可进一步分化为多种类型细胞.结论 RS5细胞株具有自我更新能力和多分化潜能,属于胚胎干细胞.     

小鼠胚胎成纤维细胞与人胚共培养对胚胎体外发育影响

[目的]评价小鼠胚胎成纤维细胞共培养是否促进d3质量差的人胚胎的囊胚发育。[方法]使用小鼠胚胎成纤维细胞与受精后第3天(d 3)质量差的胚胎共培养,对照组使用Quins囊胚培养液进行序贯培养,观察各阶段囊胚形成率,检测囊胚总细胞数。[结果]d5共培养组12.3％胚胎开始出现早期囊腔化,d 6 7.4％胚胎出现囊腔扩张,4.2％的胚胎d 7孵出。而序贯培养组d 5仅4.2％胚胎开始早期囊腔化,d 6仅1.5％胚胎出现囊腔扩张,d 7仅0.6％的胚胎孵出,表明共培养组囊胚形成率更高,囊胚发育速度快于对照组。此外,共培养组囊胚总细胞数更多,d 6扩张囊胚总细胞数为62.6±13.4,而未扩张囊胚总细胞数26.1±8.9,分别高于序贯培养组。[结论]小鼠胚胎成纤维细胞共培养与 Quins囊胚培养液序贯培养比较,前者更能促进d 3质量差的人胚胎体外发育。     

试管婴儿应用蛋白酶人工辅助孵化

试管婴儿技术发展至今 ,其妊娠率始终徘徊在 2 0 %～35 %之间 ,高龄及体外培养可导致胚胎透明带变硬 ,影响了囊胚的孵出 ,致使胚胎着床失败 [1 ] ,这是妊娠率不能提高的原因之一。近几年 ,许多科研人员尝试了各种人工辅助孵化方法 ,肯定了该法有改善妊娠率的作用。笔者 2 0 0 1年 1～ 5月对 2 5例为人工辅助孵化组在 Day3种植前用蛋白酶对待移植的胚胎进行处理 ,以期达到辅助孵化的目的 ,取得一定的效果。1　对象与方法1.1　对象　 2 0 0 1年 1～ 5月行试管婴儿助孕手术 (IVF)的患者 5 0例 ,其中施术 3次者 1人 ,2次者 3人 ,余均为第 1次…     

激光法活检对小鼠体外受精胚胎后期发育的影响

目的探讨激光法活检技术对胚胎早期发育的影响。方法对促排卵获取的小鼠卵母细胞进行体外受精和培养,然后用激光法活检收集的4细胞和8细胞胚胎,最后观察活检后胚胎的发育情况。结果共获卵母细胞360枚,受精率和卵裂率分别为92.0%和94.3%。4-细胞胚胎活检组的囊胚形成率及孵出囊胚率分别为76.6%和65.6%,8-细胞胚胎活检组的囊胚形成率及孵出囊胚率为70.4%和59.3%,分别与未活检对照组相比,差异无显著性(P>0.05);4-细胞活检组和8-细胞活检组的囊胚形成率及孵出囊胚率间相比较,差异也无显著性(P>0.05)。结论激光法对小鼠4细胞或8细胞胚胎进行单卵裂球活检,不影响胚胎的后期发育,是一项有效的胚胎卵裂球活检方法。     

不同发育阶段、不同质量囊胚冷冻复苏移植周期妊娠结局分析

目的 分析囊胚的发育阶段及其内细胞团、滋养层质量对妊娠结局的影响,从而为囊胚冷冻时机的把握及冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer,FET)周期解冻胚胎选择提供帮助.方法 本研究回顾分析了在保定市妇幼保健院生殖医学科接受单囊胚FET周期的患者资料,依据囊胚扩张/孵出状态及囊胚质量将囊胚...     

人羊膜诱导胚胎干细胞向表皮样干细胞的定向分化

[目的]探索体外定向诱导胚胎干细胞(ES细胞)分化为表皮样干细胞的条件,为研究其分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础.[方法]将小鼠胚胎干细胞单独(对照组)或与人羊膜共培养4～5 d,观察其形态分化,分别用β1整合素免疫组化和流式细胞仪检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化.[结果]与人羊膜共培养4～5 d后,ES细胞分化为表皮细胞样的单层细胞,细胞排列紧密,呈多边形,免疫组织化学染色后,多数细胞呈现β1整合素阳性,对照组大量细胞死亡,未见β1整合素阳性细胞;流式细胞仪检测结果显示实验组和对照组β1整合素阳性细胞分别为81.4%和8.4%,两者比较差异显著,Z检验P<0.01.[结论]人羊膜组织可在体外诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞.     

鼠囊胚在饲养层上的生长行为

目的 比较自然孵化法、去透明带法、免疫外科法去滋养层三种方法对胚胎贴壁率、平均贴壁时间及内细胞团(ICM)克隆形成率的影响。观察鼠囊胚在小鼠原代胎儿成纤维细胞饲养层上的生长行为。方法 超排卵获得囊胚，随机分成A、B、C3组。A组：自然孵化法；B组：去透明带法；C组：免疫外科法去滋养层，分离获得ICM。观察鼠囊胚及ICN在饲养层上的生长行为。结果 3组胚胎贴壁率、ICM克隆形成率、平均贴壁时间分别为A组：83％、83％、36～48h；B组：82％、82％、24～36h；C组：71％、71％、24～36h。滋养层细胞与ICM同时增殖，但滋养层细胞扩展范围小，不形成一层半透明膜状结构。ICM在第4天时能够充分增殖且未分化，垂直隆起生长，呈典型的卵圆柱状结构。结论 三种方法对胚胎贴壁率、ICM克隆形成率无显著差异，去透明带法、免疫外科法使胚胎平均贴壁时间短于自然孵化法。     

慢速程序冷冻对透明带显微操作后人类胚胎冻存率及发育的影响

[目的]探讨慢速程序冷冻对透明带显微操作后胚胎冻存率及继续发育的影响.[方法]将96个Ⅱ级以上人类多精受精胚胎随机分为单纯透明带打孔组(n=24),胚胎活检组(n=40)及对照组(n=32).为模拟临床种植前诊断活检后胚胎冷冻过程,将透明带显微操作后胚胎继续培养6～10 h再进行慢速程序冷冻,观察各组胚胎冷冻解冻后的冻存率及胚胎继续发育能力.[结果]活检及透明带打孔后冻融胚胎中发生裂解的卵裂球多位于透明带破口附近.活检组胚胎完整率、胚胎存活率及卵裂球存活率分别为10%,25.0%和29.0%,较对照组(43.7%,66.0%和62.4%)明显降低(P<0.01).虽然单纯透明带打孔组冷冻后胚胎完整率及胚胎存活率与活检组无明显差异,但卵裂球存活率较胚胎活检组高(分别为40.9%和29.0%)(P<0.01),以上各组存活胚胎继续发育率差异无显著性(P>0.05).[结论]以丙二醇和蔗糖为冷冻保护剂的人类分裂期胚胎慢速冷冻程序并不适用于化学法透明带打孔活检胚胎的冷冻保存,有关人类活检后胚胎的冷冻保存方法值得进一步探讨.     

小鼠胚胎干细胞克隆形成和传代的影响因素

目的:探讨昆明小鼠胚胎干细胞(ESC)分离后克隆形成和细胞传代的几种影响因素,对其特性作初步鉴定.方法:对比超排卵和自然受孕2种囊胚获取方法、囊胚培养液和高糖DMEM培养液2种培养液对其克隆形成和细胞传代的影响.对贴壁后形成的原代ESC克隆进行评分.稳定传代的一株ESC进行鉴定.结果:超排卵组、自然受孕组的内细胞团形成率(64.9% vs 68.2%)和原代ECS克隆形成率(10.1% vs 14.5%)比较,差异均无统计学意义(χ2=0.345和1.385,P=0.557和0.239).囊胚培养液组24 h囊胚孵出率明显高于DMEM培养液组(56.8% vs 17.1%)(χ2=33.026,P=0.001),原代ESC克隆形成率明显低于DMEM培养液组(35.2% vs 15.9%)(χ2=9.021,P=0.002).ICM的评分与ESC克隆传代能力相关(r=0.531,P＜0.001),直径70～100 μm、周边规则、隆起明显的ICM,ESC克隆传代持久.结论:高糖DMEM培养液对克隆的分离和传代有利.对ICM贴壁后形成的ESC克隆进行评分有助于确定挑选克隆传代的时机.     

冻融后2-细胞胚胎发育至囊胚建立人胚胎干细胞系

目的 用解冻后废弃胚胎及部分患者捐献的冷冻胚胎建立胚胎干细胞系.方法 用程序解冻法解冻2001-2007年来我生殖中心就诊的患者剩余冷冻胚胎,培养至囊胚,Pronase酶去除透明带后,全囊胚置于小鼠饲养层(MEF)中培养获得原代细胞,机械法结合Ⅳ型胶原酶消化法传代,并利用细胞形态观察、免疫荧光染色、核型分析、畸胎瘤切片胚层分析方法对所建胚胎干细胞系进行鉴定.结果 序贯培养23枚废弃胚胎,有4枚培养到囊胚阶段;去除透明带后有2枚在MEF上贴壁生长,但只有1株成功扩增稳定传代至第80代;细胞集落呈典型的鸟巢状,有稳定的46XY核型;细胞系表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81抗原,RT-PCR检测有Nanog、Oct-4、Sox2等基因表达;同时在体外能分化为内、中、外3个胚层.结论 解冻后2～3细胞Ⅲ～Ⅳ级的废弃胚胎仍具有发育形成囊胚的潜能,并利用所得囊胚采用酶去透明带全胚培养法能建立稳定增殖的hESC细胞系.     

人类胚胎干细胞研究的伦理教育刻不容缓

1背景 1999-12,美国<科学>杂志公布了世界科学进步的评定结果,胚胎干细胞的研究成果列在举世瞩目、耗资巨大的人类基因组工程之前,名列十大科技进展首位.胚胎干细胞研究何以引起如此重视?首先让我们认识一下胚胎干细胞.干细胞的基本特征是:具有自我更新和分化为一种或多种细胞类型的能力.来自胚胎的多能干细胞称为胚胎干细胞.广义的人类胚胎干细胞分为三类:来自生殖腺畸胎瘤的人干细胞;来自人类囊胚内细胞团的人干细胞;来自胚胎生殖嵴的人干细胞.狭义的人类胚胎干细胞指的是来自人类囊胚内细胞团的人干细胞.     

激光透明带打孔和激光透明带薄化辅助孵化方法在冻融胚胎移植中的应用

目的探讨激光透明带打孔和激光透明带薄化辅助孵化方法在冻融胚胎移植中的应用效果。方法选取2011年10月~2013年10月于佛山市妇幼保健院行体外受精胚胎移植周期中剩余可利用冷冻保存胚胎的病例280例作为研究对象,采用数字随机法将其分为两组,140例行激光透明带打孔辅助孵化为对照组,140例行激光透明带薄化辅助孵化为观察组。比较两组患者冻融胚胎的移植情况和妊娠情况,分析不同年龄及胚胎评分患者的临床妊娠率。结果观察组复苏率(98.6%)、完整胚胎率(97.1%)、移植胚胎的形态学评分[(5.84±0.96)分]、移植胚胎数[(2.20±0.18)个]均高于对照组[97.9%、96.4%、(5.73±0.82)分、(2.19±0.17)个],但差异无统计学意义(P>0.05)。不同年龄及胚胎评分比较时,两组临床妊娠率比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察组胚胎种植率(60.0%)、妊娠率(49.3%)、多胎率(43.5%)均明显高于对照组(44.3%、36.4%、21.6%),观察组流产率(7.2%)明显低于对照组(19.6%),差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论激光透明带打孔和激光透明带薄化辅助孵化方法均是冻融胚胎移植的有效方法 ,其中激光透明带薄化辅助孵化方法可进一步提高冻融胚胎的种植率和妊娠率,值得临床推广使用。     

两种不同激光辅助孵化方法对体外受精-胚胎移植妊娠结局的影响

目的 探讨激光透明带打孔和激光透明带削薄两种激光辅助孵化方法对体外受精-胚胎移植妊娠率的影响.方法 回顾性分析了187例行激光辅助孵化治疗的患者,分成透明带打孔穿透组和透明带削薄组,比较两组妊娠率及胚胎着床率.结果 用两种方法进行辅助孵化治疗的妊娠率分别为45.8%和40.7%,胚胎着床率分别为25.2%和24.8%,两组差异无显著性.结论 激光透明带削薄可以完全替代透明带穿透打孔,从而减少对胚胎的损伤.     

人胚胎干细胞源性表皮样干细胞分化潜能

[目的]探讨人胚胎干细胞源性表皮样干细胞的分化潜能,为研究其分化的调控机制及寻找新的人皮肤组织工程种子细胞奠定基础.[方法]将人胚胎干细胞与人羊膜共培养 4 d,定向诱导其分化为表皮样干细胞克隆,用胰酶消化后移植裸鼠皮下 20 d、 30 d及 50 d.对移植后细胞的分化情况进行了形态学和免疫组织化学观察分析.[结果]人胚胎干细胞源性表皮样干细胞在裸鼠皮下 20～ 30 d后,细胞分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状或泡状结构,它们可分别呈 CEA和 CK18阳性.种植 50 d后,除上述结构外,可见角化复层扁平上皮、毛囊样、汗腺样及皮脂腺样等结构.[结论]研究结果提示人胚胎干细胞源性表皮样干细胞具有分化为角化复层扁平上皮及毛囊样、汗腺样和皮脂腺样等结构的潜能.     

玻璃化法与程序化法冻融小鼠胚胎复苏及囊胚孵出效果的比较

目的：探讨玻璃化法与程序化法冻融小鼠胚胎复苏及囊胚孵出效果,为玻璃化法应用于人胚奠定基础.方法： 6～8周龄纯净级昆明种小鼠促排卵与雄鼠合笼妊娠后收集2-细胞胚胎,分别采用玻璃化法与程序化法进行冻融及培养,并比较2种方法小鼠胚胎的复苏率、囊胚孵出率.结果： 玻璃化法与程序化法的复苏率分别为63.82%（224/351）、62.57%（209/334）,差异无统计学意义（P＞0.05）;玻璃化法与程序化法囊胚孵出率分别为34.2%（120/351）、31.74%（106/334）,差异无统计学意义（ P＞0.05）.结论： 玻璃化技术具有有效、简便、迅速的优点,是冻贮鼠胚最为理想的方法.     

携带α-地中海贫血基因人胚胎干细胞系的建立

【目的】 建立携带α-地中海贫血纯合子基因人胚胎干细胞系.【方法】 收集经胚胎种植前遗传学诊断技术诊断为携带α-地中海贫血纯合子基因的囊胚,机械法分离内细胞团,用无血清培养基进行人胚胎干细胞培养,建立携带α-地中海贫血纯合子基因的人胚胎干细胞系?对所得人胚胎干细胞进行α-地中海贫血基因的DNA序列分析与全能性鉴定. 【结果】 本研究共收集44枚PGD筛查后囊胚,分离12个囊胚内细胞团,建立两株人胚胎干细胞系.两株人胚胎干细胞系均携带α-地中海贫血纯合子基因.两株胚胎干细胞系均有正常的染色体核型.OCT-4基因与细胞表面抗原SSEA-3?SSEA-4?TRA-1-60与TRA-1-80的表达,能够向三胚层细胞分化.【结论】 携带α-地中海贫血纯合子基因的人胚胎干细胞具有向三胚层细胞分化的全能性,携带致病基因的胚胎可用于建立携带遗传疾病基因的人胚胎干细胞系.     

改良程序化慢冻提高活检人胚胎的冻存率

[目的]探讨及Jericho改良方案用于冷冻活检后胚胎的效能.[方法]将92个质量相对较好的废弃人胚胎随机分配到单纯冷冻组(n=30),胚胎活检后标准程序化慢冻组(n=32)及胚胎活检后Jericho改良程序化慢冻组(n=30).将活检后的胚胎继续培养6～10 h,3组胚胎同时进行冷冻.观察各组胚胎冷冻解冻后的冻存率及囊胚形成率.[结果]活检胚胎采用Jericho改良方案冷冻后,胚胎存活率、完整率及囊胚率分别为73%,40%和23%,较活检后标准冷冻组(16%,13%和3%)显著提高(P值分别<0.001,0.05,0.05),达到单纯冷冻组的水平(P均>0.05).[结论]采用Jericho改良方案冷冻活检人胚胎优于目前的标准化慢冻方案,Jericho方案冷冻后的胚胎具备良好的发育潜能.