大鼠脑缺血后树突状细胞参与脑损伤过程的作用及其免疫活性

目的：证明大鼠脑缺血后树突状细胞(dendritic cell，DC)是否参与脑损伤过程和所具有的免疫活性。方法：用线栓方法封闭大鼠右侧大脑中动脉制作动物模型。用免疫组化染色方法检测脑缺血1h到第6天时，缺血脑组织中DC(OX62^+)的存在，以及胶质细胞／巨噬细胞(OX42^+)转化成DC(OX62^+)的情况。同时检测活化后的DC样细胞表达MHC—Ⅱ类分子的水平。结合免疫组化和寡核苷酸探针杂交方法，检测DC样细胞的功能。结果：缺血脑半球和假手术的脑半球相比较，在1h DC的数量明显增加(t=7．143，P&;lt;0．001)。在脑缺血组中，缺血脑半球与非缺血脑半球相比较，DC的数量也增多(t=10．295，P&;lt;0．001)。脑缺血第6天，缺血组与假手术组进行比较，DC表达MHC—Ⅱ类分子(OX62^+OX6^+)显著升高(t=2．975，P&;lt;0．05)。缺血脑半球与非缺血脑半球相比较，在12，24和48h，DC表达白介素-6(interleukin-6，IL-6)mRNA，P值均&;lt;0．05，而DC表达白介素-10(interleukin-10，IL-10)mRNA在12h时，t=11．258，P&;lt;0．01，24h时，t=12．124，P&;lt;0．001。脑缺血1h到第6天，缺血脑半球与非缺血脑半球相比较，DC表达肿瘤坏死因子—α(tumor necrotic factor—α，TNF—α)mRNA有两个—α，TNF—α)mRNA有两个2．696．P&;lt;0．05)和12h(t=4．793，P&;lt;0．01)，第二个高峰期是在48h(t=3．072，P&;lt;0．05)和第6天(t=2．715，P&;lt;0．05)。脑缺血后，DC表达干扰素-γ(interferon—γ，IFN—γ)mRNA是随着脑缺血时间延长，IFN—γ表达量增加，24h时，t=2．677，P&;lt;0．05，48h时，t=2．896，P&;lt;0．05，第6天，t=6．145，P&;lt;0．001。结论：脑缺血后，脑缺血组织中DC数量的增加，提示DC参与了脑缺血过程。DC不仅在脑损伤过程中处于活化状态，而且通过DC表达的细胞因子产生免疫效应。     

大鼠脑缺血后胶质细胞向树突状细胞转化的研究

目的探讨树突状细胞( dendritic cells,DC)是否参与脑缺血损伤过程及在缺血脑组织中 DC的来源. 方法用线栓方法封闭大鼠右侧大脑中动脉制作动物模型.用免疫组化方法检测脑缺血 1 h到第 6 天时,缺血脑 DC( OX62+)的存在,以及胶质细胞 /巨噬细胞( OX42+)转化成 DC( OX62+),同时检测活化后的 DC样细胞表达主要组织相容性复合分子Ⅱ( MHCⅡ)情况. 结果脑缺血半球和假手术半球比较,在 1 h DC数量增加 (t=7.143, P< 0.001),在脑缺血组中,缺血脑半球与非缺血脑半球比, DC的数量也增多 (t=4.968, P< 0.01).脑缺血第 6天缺血组与假手术组进行比较, DC表达 MHCⅡ( OX62+ OX6+)显著差异,每 100 mm2脑组织切片中 OX62+ OX6+细胞数量比为 (53± 3)比 (33± 2)个 (t=2.975, P< 0.05).脑缺血半球在 1 h到第 6天 OX42+转变成 OX62+ OX42+细胞逐渐增加,脑缺血第 6天脑缺血半球与非缺血半球比 t=9.875, P< 0.001.脑缺血损伤面积与以每 100 mm2脑组织片为单位的 OX62+数量呈正相关 (R2=0.891 4,P< 0.001). 结论脑缺血后,脑缺血组织中 DC的数量增加, DC数量增加与脑伤面积呈正相关,提示 DC参与了脑缺血过程,大鼠脑缺血后从胶质细胞向 DC样细胞转化是脑内 DC的来源之一.     

BHA和β-ME对表观修饰后的NIH/3T3细胞向神经方向诱导的实验研究

目的通过联合应用表观修饰药物5-氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-dC)和曲古抑菌素A(TrichstatinA,TSA)对NIH/3T3细胞进行重编程,应用β-羟基酸(betahydroxyacid,BHA)和β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)进一步诱导,以期表达与神经细胞密切相关的基因。方法应用流式细胞技术检测实验组(4.5μM5-aza-dC+0.35μMTSA+1mMβ-ME+200μMBHA作用后的NIH/3T3细胞)和对照组中NIH/3T3细胞的DNA甲基化水平。应用RT-PCR的方法检测Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4的表达,免疫细胞化学染色检测巢蛋白(nestin)和神经丝轻链(neurofilamentlightchain,NF-L)的表达情况。结果实验组NIH/3T3细胞DNA甲基化水平较对照组明显降低,细胞均呈现出Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4基因的阳性表达。经过BHA和β-ME诱导后,NIH/3T3细胞呈巢蛋白和神经丝轻链阳性。结论表观修饰后的细胞经诱导后可以呈现nestin和NF-L的阳性表达。     

密度梯度离心法结合贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的:建立一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法,观察成年大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法:实验于2003-03/2004-05于哈尔滨医科大学组胚教研室完成。①用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化成年大鼠骨髓间充质干细胞。②采用倒置显微镜、透射电镜观察,免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原和细胞基质蛋白属性。③体外加成骨、成软骨诱导剂,14d分别做碱性磷酸酶组织化学、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察骨髓间充质干细胞的成骨分化及成软骨分化结果。结果:①成年大鼠骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样,具有一般干细胞的超微结构特点。②广泛表达Vimentin,CD29,CD44,不表达CD14,CD34。③加入成骨诱导剂14d后,骨髓间充质干细胞呈多层重叠生长,现碱性磷酸酶强阳性,阳性率为90.5%。④经成软骨诱导后,Ⅱ型胶原免疫组化染色,诱导14d的骨髓间充质干细胞呈现广泛的棕褐色染色,在细胞密集处细胞周围可见黄褐色染色。结论:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化成年大鼠骨髓间充质干细胞,用此种方法培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性。     

体外诱导骨髓干细胞转化成心肌细胞的实验研究

目的　探讨 5 -氮胞苷 (5 -aza)浓度对骨髓基质干细胞 (MSCs)向心肌细胞转化的影响。方法　利用梯度离心法分离大鼠MSCs ;用 5 -aza对MSCs进行体外诱导转化 ,并使用心肌特异性抗体 (肌钙蛋白I和肌凝蛋白重链 )对诱导后的MSCs进行免疫组化染色 ,进行光镜和电镜观察。结果　分离培养后的MSCs生长密集 ,形态呈纺锤状 ,在 5 μmol/L和 10 μmol/L 5 -aza的诱导下分化成类心肌细胞 ,HE染色结果 :胞浆嗜酸性 ,免疫组化染色心肌特异性抗体阳性。电镜发现 :胞核居细胞中央 ,肌丝和幼稚肌结形成。结论　 5 -aza是促进干细胞向心肌细胞转化的有效诱导剂 ,以 5 μmol/L的 5 -aza对MSCs向心肌细胞转化的影响最大。     

细胞外基质的程序性应用促进胚胎干细胞的神经分化

目的 探讨细胞外基质(ECM)在胚胎干细胞(ESCs)诱导分化中特定时期的作用.方法 将ESCs悬浮培养形成胚胎小体(Embryonic bodies,EBs),用高浓度维甲酸(RA)诱导,再将EBs接种在GL、FN、LPO基质上进行分化,利用免疫荧光方法 比较这些基质对神经分化的影响;进一步检测LPO对神经突起生长的影响.结果 高浓度RA启动并加速了nestin阳性的神经前体细胞的分化;FN对ESCs的神经分化具有剂量依赖性的促进作用,可提高神经元的分化率;LPO基质能够促进神经细胞的突起生长,进一步诱导神经细胞的成熟.结论 不同基质在分化的特定阶段起到了不同作用,在诱导神经前体分化阶段应用FN以及在诱导神经细胞分化阶段应用LPO的联合作用对ESCs向神经细胞分化作用最显著.     

不同类型的转基因细胞核供体对生产小鼠转基因克隆胚胎的影响

目的 利用体细胞核移植(SCNT)技术生产小鼠转基因克隆胚胎. 方法 利用所构建的含新霉素抗性(Neor)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双标记选择载体, 通过电穿孔的方法, 分别转染小鼠胎儿成纤维细胞和小鼠胚胎干细胞,经G418筛选14d后用于核移植.同时以未转基因小鼠卵丘细胞和成纤维细胞为核供体,进行体细胞核移植. 结果 转基因与未转基因胎鼠成纤维细胞的重构胚的囊胚(154/160)发育率为19.23%和22.91%,差异不显著(P＞0.05);转基因胚胎干细胞与胎鼠成纤维细胞的重构胚的囊胚(152/154)发育率为41.54%和19.23%,差异显著(P＜0.05);未转基因卵丘细胞与成纤维细胞的重构胚的囊胚(171/160)发育率为41.17%和22.91%,差异显著(P＜0.05). 结论 利用体细胞核移植技术,小鼠胎儿成纤维细胞和胚胎干细胞可以有效地生产小鼠转基因囊胚.     

骨髓基质干细胞治疗缺血性脑损伤的实验研究

目的探讨脑缺血后,外源性植入的骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在脑内的迁移和分化,及脑缺血后自体神经干细胞(neural stromal cells,NSCs)的动员情况。方法体外培养、扩增BMSCs 后,用绿色荧光染料PKH67标记BMSCs,通过静脉和脑内局部移植等途径将BMSCs植入大脑中动脉闭塞的SD大鼠脑内,10d后取材,免疫荧光检测BMSCs的分化、迁移情况;并比较假手术和脑缺血时脑内自体NSCs的数量。结果 (1)静脉移植组两侧脑半球中PKH67 细胞数分别是46．4±2．92和21．8±1．13／100mm2(P<0．05);(2)移植的BMSCs中40．31％表达神经元特异性标志;(3)在第8天时,脑缺血半球和非脑缺血半球Nestin 细胞数分别为 19．5±10．08和7±1．41,差异显著(P<0．05)。结论脑缺血可激活脑内自身的NSCs,使它们迁移至脑缺血半球并促进其修复;外源性BMSCs通过局部或静脉移植后可迁移到缺血脑组织附近,并且部分分化为神经元样细胞,表达神经元的特异性标志。     

无精子症和严重少精子症134例遗传学分析

目的：研究无精子症和严重少精子症患者染色体畸变及Y染色体(Yql1区)无精子症因子(azoospermic factor，AZF)缺失情况，建立Y染色体微缺失的临床筛查方法。方法：对134例患者(无精子症97例，严重少精子症37例)经染色体核型分析及AZF、区三个位点8对引物PCR扩增，检测染色体畸变和Y染色体微缺失率。结果：134例中染色体核型异常9例，占6．72％。AZF缺失18例，缺失率为13．43％。无精子症和严重少精子症AZF、缺失率分别为14．43％、10．81％。结论：染色体畸变和Y染色体微缺失是导致无精子症和严重少精子症的主要原因之一。无精子症缺失率高于严重少精子症患者。AZF区三个位点8对引物PCR扩增可作为Y染色体微缺失的临床筛查方法。