siRNA抑制人前列腺癌PC-3细胞株VEGF的表达及细胞增殖

目的:研究小干扰RNA(siRNA)对PC-3人前列腺癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)基因表达的抑制作用及抑制癌细胞增殖和诱导凋亡的作用。方法:体外合成特异性靶向人VEGF基因的siRNA，并转染到PC-3细胞中;RT-PCR和Western blotting检测siVEGF对VEGF基因和蛋白表达的抑制作用;MTT法检测siVEGF对癌细胞增殖抑制作用，流式细胞术检测siVEGF诱导细胞凋亡的作用。结果:转染siVEGF1和siVEGF2组VEGF mRNA 表达水平与空白对照组比较分别下调了60.32%和70.73%；VEGF蛋白表达水平与空白对照组比较明显受到抑制，最高抑制率达72％；转染阴性对照质粒组VEGF基因和蛋白表达水平都无明显改变。转染siVEGF1和siVEGF2的细胞增殖受到抑制，增殖抑制率分别为49.5%和55.3 %，细胞的凋亡率分别为33.9%和42.0%。结论:构建的siRNA VEGF能特异有效下调VEGF基因的表达,瞬时转染siRNA VEGF能有效抑制人前列腺癌细胞PC-3增殖并诱导其凋亡。     

UbcH10基因沉默联合紫杉醇干预对NCI-H226细胞增殖活性和凋亡的影响

目的观察小干扰RNA(siRNA)介导的UbcH10基因沉默联合紫杉醇处理对人肺鳞癌细胞株NCI-H226细胞增殖活性和凋亡的影响。方法化学合成针对UbcH10基因的siRNA-UbcH10序列,脂质体转染siRNA至NCI-H226细胞(siRNA转染组),转染后24 h,采用Real-Time PCR和Western blotting分别检测UbcH10 mRNA和蛋白的表达水平,以未予任何转染细胞作为空白对照,以阴性序列转染细胞作为阴性对照。以紫杉醇(1μmol/L)处理siRNA转染及未转染NCI-H226细胞(siRNA+紫杉醇组和紫杉醇组),分别于转染后24、48 h收集细胞,MTT比色法检测细胞增殖;转染后24 h收集细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡;以未经紫杉醇处理的siRNA转染、阴性序列转染和未予转染的NCI-H226细胞作为siRNA转染组、阴性对照组和空白对照组。结果Real-Time PCR和Western blotting检测结果显示:转染后24 h,siRNA转染组UbcH10 mRNA和蛋白的表达较空白对照组和阴性对照组显著下调(P0.01)。MTT比色法检测结果显示,siRNA转染组细胞增殖抑制率显著高于紫杉醇组和对照组(P0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞增殖抑制率显著高于siRNA转染组(P0.05)。siRNA转染组细胞凋亡率显著高于紫杉醇组和对照组(P0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞凋亡率显著高于siRNA转染组(P0.05),紫杉醇组与对照组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 UbcH10基因沉默可显著增强NCI-H226细胞对于化疗药物紫杉醇的敏感性。     

Effects of UbcH10 gene silencing combined with paclitaxel treatment on proliferation and apoptosis of NCI-H226 cells

目的 观察小干扰RNA(siRNA)介导的UbcH10基因沉默联合紫杉醇处理对人肺鳞癌细胞株NCI-H226细胞增殖活性和凋亡的影响.方法 化学合成针对UbcH10基因的siRNA-UbcH10序列,脂质体转染siRNA至NCI-H226细胞(siRNA转染组),转染后24 h,采用Real-Time PCR和Western blotting分别检测UbcH10 mRNA和蛋白的表达水平,以未予任何转染细胞作为空白对照,以阴性序列转染细胞作为阴性对照.以紫杉醇(1μmol/L)处理siRNA转染及未转染NCI-H226细胞(siRNA+紫杉醇组和紫杉醇组),分别于转染后24、48 h收集细胞,MTT比色法检测细胞增殖;转染后24 h收集细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡;以未经紫杉醇处理的siRNA转染、阴性序列转染和未予转染的NCI-H226细胞作为siRNA转染组、阴性对照组和空白对照组.结果 Real-Time PCR和Western blotting检测结果显示:转染后24 h,siRNA转染组UbcH10 mRNA和蛋白的表达较空白对照组和阴性对照组显著下调(P＜0.01).MTT比色法检测结果显示,siRNA转染组细胞增殖抑制率显著高于紫杉醇组和对照组(P＜0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞增殖抑制率显著高于siRNA转染组(P＜0.05).siRNA转染组细胞凋亡率显著高于紫杉醇组和对照组(P＜0.05),而siRNA+紫杉醇组细胞凋亡率显著高于siRNA转染组(P＜0.05),紫杉醇组与对照组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 UbcH10基因沉默可显著增强NCI-H226细胞对于化疗药物紫杉醇的敏感性.     

RNAi沉默MACC1基因表达抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移

目的探讨RNAi沉默MACC1基因表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖及迁移的影响及相关的分子机制。方法化学合成针对MACC1基因的荧光标记的siRNA-FAM,利用siRNA转染试剂将MACC1特异性siRNA-FAM转染至乳腺癌MCF-7细胞;采用RT-PCR检测siRNA对MACC1 mRNA表达的影响,Western blot检测siRNA对MACC1蛋白合成的影响;MTT实验检测沉默MACC1基因后对MCF-7细胞增殖活性的影响;Transwell迁移实验检测沉默MACC1基因后对MCF-7细胞迁移能力的影响;Western blot检测干扰MACC1对S100A4及vimentin蛋白合成的影响。结果 MACC1基因在乳腺癌MCF-7细胞高表达;针对MACC1基因的siRNA转染MCF-7细胞48 h后,siRNA组与空白对照组比较,能够显著抑制MACC1基因表达和蛋白合成,抑制效率分别为81%和75%;MACC1特异性siRNA转染MCF-7细胞24、48、72 h后,MMT结果显示与空白对照组比较,siRNA组能够抑制细胞生长,并随着时间延长抑制明显(P<0.05);转染MCF-7细胞48 h后,Transwell迁移实验结果显示siRNA组与空白对照组比较,穿过小室细胞数明显降低,其能有效抑制MCF-7细胞迁移(P<0.05);siRNA组与空白对照组相比,S100A4和vimentin表达降低(P<0.05)。以上实验阴性对照组和空白对照组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论利用特异性siRNA干扰MACC1基因表达,可显著抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移能力,且这一过程可能与S100A4和Vimentin的表达下调有关。     

小分子干扰RNA下调硬脂酰辅酶A去饱和酶-1对肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)下调硬脂酰辅酶A去饱和酶-1(SCD-1)表达对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法用设计合成的SCD-1 siRNA转染人肝癌细胞HepG2细胞株,转染后细胞分为3组:空白对照组(未做任何处理)、阴性对照组(对照siRNA转染)和SCD-1 siRNA组(SCD-1 siRNA转染)。采用反转录聚合酶链反应检测HepG2细胞SCD-1 mRNA的表达,噻唑蓝法检测HepG2细胞的增殖,用流式细胞术检测SCD-1 siRNA对HepG2细胞凋亡和细胞周期的影响。结果 SCD-1 siRNA组的SCD-1 mRNA表达明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01);转染后24、48、72 h,SCD-1 siRNA组HepG2细胞增殖较空白对照组和阴性对照组明显减慢(P<0.01);SCD-1siRNA组HepG2细胞凋亡率明显高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01);SCD-1 siRNA组HepG2细胞在合成前期(G0/G1期)的细胞比例明显高于空白对照组和阴性对照组,在合成期(S期)和合成后期(G2/M期)的细胞比例均明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)。空白对照组和阴性对照组HepG2细胞在SCD-1 mRNA表达、细胞增殖、细胞凋亡率及细胞周期方面差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 siRNA可通过下调HepG2细胞SCD-1基因的表达,抑制HepG2细胞的增殖,并促进其凋亡。     

利用RNA干扰技术下调Lon基因表达的生物学效应研究

目的:通过构建Lon基因下调的哺乳动物细胞模型表达,观察Lon基因对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响,以探讨Lon蛋白的功能.方法:设计针对Lon蛋白酶的小干扰RNA(siRNA),构建pSilencer U6 2.1-Lon真核表达载体,用脂质体法转染人乳腺癌细胞MCF7,RT-PCR检测Lon基因下调的水平,通过采用高温、紫外线照射、顺铂处理,观察Lon基因下调后细胞敏感性的变化(MTT法).结果:RT-PCR显示重组质粒pSilencer U6 2.1-Lon转染MCF7细胞,Lon基因明显下调,RT-PCR未见扩增目的带,细胞培养结果显示,细胞增殖能力明显减弱.紫外线照射和顺铂处理后的MTT结果显示,pSilencer U6 2.1-Lon转染的MCF7细胞,增殖能力明显下降,与空载体转染组(pSilencer U6 2.1)和未转染组相比有显著性差异(P＜0.05).加热应激试验显示,37,41,43℃处理后,RNA干扰转染组(pSilencer U6 2.1-Lon)与空载体转染组、未转染组相比有显著性差异(P＜0.05).而在45℃时,RNA干扰转染组、空载体转染组与未转染组之间均无显著性差异(P＞0.05).结论:RNAi能有效下调Lon蛋白的表达.Lon基因的下调可抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖能力,诱导细胞凋亡,以及可增加MCF7对紫外线和顺铂处理的敏感性.     

siRNA沉默E2F3基因对人膀胱癌细胞的增殖抑制作用

目的：探讨siRNA干扰E2F3基因对膀胱癌细胞(5637细胞)增殖的抑制作用,阐明E2F3基沉默对5637细胞增殖抑制作用的生物学机制。方法：化学合成3对编码短发夹RNA序列的、靶向E2F3基因的寡核苷酸链,经BamH Ⅰ、Hind Ⅲ 双酶切克隆至pRNAT-U6.1/Neo系统,重组构建E2F3 siRNA的RNAi质粒,以质粒转染DH5α菌株筛选得到稳定表达siRNA的细胞,转染5637细胞E2F3基因沉默,RT-PCR及Western blotting 检测E2F3表达,流式细胞术检测5637细胞周期,采用Annexin-V/PS双染法检测细胞凋亡率。结果：RT-PCR及Western blotting检测干扰后5637细胞E2F3基因表达抑制,3条干扰序列对5637细胞周期抑制且G1期细胞比例增高,与阴性转染对照组比较差异有显著性(P<0.05和P<0.001）;细胞凋亡率增加,与空白对照组及阴性转染对照组比较差异有显著性(P<0.001）。结论：siRNA干扰E2F3基因对膀胱癌5637细胞具有明显增殖抑制和促进凋亡的作用。     

靶向survivin的siRNA联合顺铂抑制肺腺癌A549细胞增殖的实验研究

目的:研究靶向survivin的siRNA和顺铂联用对肺癌细胞A549的增殖抑制作用.方法:将A549细胞分为空白对照组,阴性对照质粒pSilencer2.0-Nc转染组,顺铂处理组,pSileneer2.0-SVV2转染组,pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组.转染采用脂质体法.MTT法检测靶向survivin的siRNA和顺铂对A549细胞增殖的抑制作用;RT-PCR法检测A549细胞survivinmRNA转录水平变化情况;流式细胞术和TUNEL.法检测A549细胞凋亡情况.结果:MTT法示:pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组增殖抑制率为51.38%±1.35%,与其它各组相比抑制率明显增高,具有统计学意义(P<0.05);RT-PCR检测显示空白对照组,阴性对照质粒pSilencer2.0-NC转染组,顺铂处理组survivinmRNA表达无明显变化(P>0.05).pSilencer2.0-SVV2转染组、pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组survivin mRNA表达明显下降(P<0.05);流式细胞术和TUNEL法检测pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组凋亡率分别为42.48%±2.28%和40.65%4±3.53%,与其它各组相比凋亡率明显增高,具有统计学意义(P<0.05).结论:将靶向survivin的siRNA和顺铂联合应用可以协同抑制A549细胞增殖,共同发挥诱导细胞凋亡作用.     

RNAi沉默PLCε对Crocin抑制人膀胱癌BIU-87细胞增殖作用调控的研究

目的:观察RNAi沉默膀胱癌BIU-87细胞磷脂酶C-ε(Phospholipase C epsilon,PLCε)表达后对藏花素(Crocin)抑制人膀胱癌BIU-87细胞增殖作用的影响.方法:将携有siRNA基因的真核表达质粒PGenesil-PLC?转染BIU-87细胞后,分为5组:未转染组、pGenesil-NP阴性质粒组、pGenesil-PLC ε质粒组、Crocin组、pGenesil-PLCε联合Crocin组.MTT法观察不同处理组对BIU-87细胞的生长抑制作用.RT-PCR法检测转染后对PLCε mRNA表达的影响及各处理组PCNA(Proliferating cellnuclear antigen)、CyclinD1 mRNA表达.Western-blot检测PCNA、CyclinD1蛋白表达.结果:RNAi可抑制BIU-87细胞78.06%的PLCεmRNA表达.pGenesil-PLCε联合Crocin组可增强Crocin对BIU-87细胞的生长抑制作用,48h抑制率达45.30%,且与pGenesil-PLCε质粒组和Crocin组相比较有显著性差异(P<0.01).RT-PCR和Western-blot结果显示与RNAi沉默PLCε组比较,RNAi PLC?联合Crocin组明显下调了PCNA、Cyclin D1基因和蛋白的表达(P<0.05);较单独Crocin组比较,RNAiPLC ε联合Crocin组显著降低了PCNA基因和蛋白的表达(P<0.05),降低了Cyclin D1蛋白的表达(P<0.05),Cyclin D1 mRNA表达变化两组间无显著性差异(P>0.05).结论:沉默PLC ?基因可增强Crocin对BIU-87细胞的抑制作用,其机制与进一步下调PCNA、CyclinD1的表达有关.     

RNA干扰IDH2基因对HCT-8细胞增殖能力的影响

目的：研究RNA干扰(RNAi)对结肠癌HCT-8细胞IDH2基因表达的抑制作用及干扰后对HCT-8细胞增殖的影响,为结肠癌的基因靶向治疗提供理论依据。方法：实验分siRNA干扰质粒转染组、阴性质粒对照组和HCT-8细胞空白对照组。构建靶向基因IDH2的siRNA真核绿色荧光载体重组质粒PGPU6/GFP/Neo-IDH2,利用FuGENE HD转染剂转染HCT-8细胞,通过荧光定量PCR检测IDH2 mRNA的表达情况及MTT法检测结肠癌HCT-8细胞增殖变化。结果：在荧光显微镜下进行细胞计数,细胞转染率为74%。实时荧光定量PCR检测,siRNA重组质粒PGPU6/GFP/Neo-IDH2对IDH2基因表达的抑制率为85.02%,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。MTT检测,干扰质粒转染组细胞的增殖能力明显低于空白对照组(P<0.05)。结论：抑制IDH2基因的表达可影响结肠癌细胞的增殖能力,提示IDH2基因在结肠癌的发生发展中起重要作用,抑制IDH2基因的表达可能成为一种治疗结肠癌的方法。     

siRNA干扰AEG-1对人胰腺癌AsPC-1细胞增殖和细胞周期的影响

目的 探讨星形胶质细胞上调基因1(astrocyte elevated gene-1,AEG-1)表达水平对人胰腺癌细胞增殖和细胞周期的影响,研究其可能的分子机制。 方法 采用RNAi技术抑制AsPC-1细胞中AEG-1表达,采用Western blot检测转染前后AEG-1蛋白表达情况,实验分为未转染组、脂质体组和AEG-1 siRNA转染组3组。采用MTT法和流式细胞术分析AEG-1基因沉默后对人胰腺癌AsPC-1细胞生长及周期的影响。 结果 Western blot检测结果显示,AEG-1 siRNA转染48 h后,AsPC-1细胞中AEG-1蛋白相对灰度值为0.10±0.09,明显弱于未转染对照组的0.69±0.24和脂质体转染组的0.70±0.21(P<0.05),而未转染对照组和脂质体转染组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。转染AEG-1 siRNA的AsPC-1细胞其AEG-1基因表达量下降了82%。MTT法检测结果显示,AEG-1 siRNA干扰AsPC-1细胞后,AEG-1 siRNA干扰组AsPC-1细胞生长减慢(P<0.05)。FCM法检测结果显示,AEG-1基因沉默后,与未转染对照组和脂质体转染组相比,G₀/G₁期细胞的比例明显升高(P<0.05),S期的比例显著下降(均P<0.05)。 结论 RNA干扰AEG-1基因表达后可明显抑制人胰腺癌AsPC-1细胞增殖,且其抑制增殖作用与改变细胞周期的分布有关。      

RNA干扰HER2/neu对膀胱癌BIU-87细胞增殖和凋亡的影响

目的研究靶向HER2/neu基因的siRNA对膀胱癌BIU-87细胞增殖和凋亡的影响。方法化学合成的靶向HER2/neu基因siRNA在脂质体的介导下转染BIU-87细胞,实验分为HER2/neu siRNA组、空脂质体组、阴性siRNA序列组,以未转染BIU-87细胞为空白对照组。利用CCK-8法评价HER2/neu基因siRNA对BIU-87细胞体外生长的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测转染前后细胞中HER2/neu mRNA和蛋白表达水平的变化。结果转染HER2/neu siRNA后BIU-87细胞的存活率显著下降,从(82.37±0.90)%降低到(56.76±1.70)%,差异有统计学意义(P<0.05);同时能诱导细胞凋亡,HER2/neu siRNA组凋亡率达(45.60±0.70)%,与空白对照组、空脂质体组、阴性siRNA序列组比较差异有统计学意义(P<0.05);靶向HER2/neu基因siRNA能显著降低BIU-87细胞中HER2/neu mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结论化学合成的靶向HER2/neu基因siRNA能有效抑制HER2/neu基因在BIU-87细胞中的表达,进而能有效抑制BIU-87细胞的增殖和诱导凋亡的作用。     

siRNA干扰ski基因的表达对人肝癌HepG2细胞生物学功能的影响

目的:设计并化学合成针对原癌基因ski的siRNA分子片段,转染人肝癌HepG2细胞,观察其对HepG2细胞增殖、细胞周期和凋亡等生物学功能方面的影响.方法:设计并化学合成针对原癌基因ski的3个siRNA分子序列,阳离子脂质体法瞬间转染HepG2细胞,运用实时定量PCR法和Western印迹法检测细胞中ski基因在mRNA水平和蛋白水平的变化.然后利用MTT法和流式细胞术检测转染ski-siRNA的HepG2细胞增殖、细胞周期和凋亡等生物学功能方面指标的变化.结果:3对特异性ski-siRNA均有效地抑制了ski基因的表达,以siRNA-B抑制效果最好,可达到70%,而且随着转染时间的延长,ski的表达呈逐步下降趋势.转染ski-siRNA后HepG2细胞的增殖能力明显受到抑制(P<0.05),S期细胞明显减少,是阴性对照组的2倍以上.结论:靶向ski基因的siRNA分子片段可以有效地抑制人肝癌HepG2细胞的生长,使进入S期的细胞明显减少,其作用与下调ski基因的表达有关,ski可能是肝癌治疗的一个潜在靶点.     

ORC1基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascu lar smooth musc le cells,VSMCs)ORC1基因,探讨ORC1基因表达抑制后VSMCs增殖的变化。方法实验设置正常对照组、阴性siRNA组及阳性(ORC1 A、ORC1 B、ORC1 C)siR-NA组。应用W estern b lot检测ORC1基因表达的变化;应用MTT比色试验、3H-TdR掺入试验检测VSMCs增殖的情况。免疫细胞化学染色观察增殖细胞核抗原(proliferating cell nuc lear antigen,PCNA)表达。结果①siRNA转染后,3个阳性siRNA转染组ORC1基因表达水平均降低,尤以第2对阳性siRNA抑制效果最为显著,而空白对照组及阴性对照组间ORC1基因表达水平无显著差异。②siRNA转染使ORC1表达减弱后,VSMCs的MTT吸光度值3、H-TdR掺入量和PCNA表达量均较空白对照组及阴性对照组显著降低。结论RNA干扰介导的ORC1基因沉寂可显著抑制VSMCs增殖。     

siRNA抑制Ki-67表达对乳腺癌MCF-7／ADR细胞阿霉素耐药性的研究

目的采用Ki-67RNA表达载体干扰沉默Ki-67基因,检测其对乳腺癌MCF-7／ADR细胞株耐-67mRNA及蛋白表达的影响,观察沉默艇-67基因前后乳腺癌细胞株对阿霉素敏感性改变。方法体外合成靶向艇-67siRNA表达载体,应用脂质体法瞬时转染尉-67高表达的乳腺癌细胞株MCF-7／ADR,应用RT-PCR和Western印迹法检测转染后Ki-67mRNA及蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖活性及转染前后细胞对阿霉素敏感性的变化。结果Ki-67siRNA载体转染后24h可显著抑制乳腺癌MCF-7／ADR细胞株的Ki-67mRNA和蛋白表达及细胞的增殖活性。Ki-67siRNA组阿霉素IC50值为（6．3±0．9）μg/ml。结论si—Ki-67能够有效抑制Ki-67基因的表达,降低乳腺癌细胞的增殖能力,沉默Ki-67表达能部分逆转阿霉素耐药现象。     

肝再生磷酸酶3对肾透明细胞癌细胞A-498的影响

[目的]研究肝再生磷酸酶3 (phosphatase of regenerating liver-3,PRL-3)对肾透明细胞癌(clear cell renal cell cancinoma.CCRCC)细胞A-498的影响.[方法]本实验以肾透明细胞癌细胞A-498为实验对象,采用siRNA干涉的方法下调A-498中PRL-3表达水平,以不做任何处理为空白对照组,脂质体加随机序列的siRNA为阴性对照组,脂质体加siRNA处理组为实验组,之后通过RT-PCR及Western blotting方法检测siRNA干涉效率,绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞周期及凋亡以观察下调PRL-3对A-498细胞的影响.[结果]同阴性对照组相比,本实验所设计的siRNA能够下调PRL-3在A498细胞中的表达,其中siRNA2干涉效率更高,细胞生长曲线显示自siRNA转染60h开始,下调PRL-3能够抑制细胞的生长(P＜0.01),流式细胞仪检测发现转染72h后,下调PRL-3的表达可以促进A-498细胞G1期阻滞,S期减少,凋亡增加(P＜0.05).[结论]下调PRL-3能够明显抑制A498细胞的增殖,PRL-3很可能成为肾透明细胞癌基因治疗的新靶点.     

沉默piRNA-651抑制骨肉瘤细胞系U20S增殖和转移的影响

目的 研究非编码小RNA piRNA-651对骨肉瘤U20S细胞增殖、侵袭与转移的影响.方法 通过RNA干扰技术沉默U20S细胞中的piRNA-651,并应用实时定量PCR（qRT-PCR）检测骨肉瘤U20S细胞中piRNA-651的表达情况;流式细胞术检测细胞周期的变化,MTT实验检测沉默piRNA-651表达对细胞增殖的影响,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化,细胞划痕实验检测细胞转移能力的变化.结果 piRNA-651-siRNA可有效沉默piRNA-651在骨肉瘤细胞U20S的表达,敲低U20S细胞中piRNA-651的表达可以明显阻滞骨肉瘤细胞的细胞周期,抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭与转移能力.结论 piRNA-651在骨肉瘤的发生发展及侵袭转移中发挥着重要作用.     

干扰AURKA基因表达对人骨肉瘤细胞系U2-OS细胞增殖与细胞周期的影响

目的:探讨AURKA基因表达下调对骨肉瘤细胞增殖和细胞周期分布的影响?方法:脂质体瞬时转染法介导AURKA 小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)处理骨肉瘤U2-OS细胞, 采用实时荧光定量PCR及 Western blot方法检测转染前后AURKA mRNA和蛋白表达,CCK8实验检测细胞活力变化,流式细胞术检测细胞周期分布变化,Western blot检测周期相关蛋白的表达,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)细胞增殖实验检测细胞增殖情况?结果:AURKA siRNA作用U2-OS细胞后, AURKA mRNA和蛋白的表达水平较正常对照组及阴性对照组显著降低,且差异有统计学意义 (P < 0.05),两对照组间AURKA表达无明显差异;下调AURKA表达后,细胞活力降低,且作用72 h后抑制率最高,约为(36.63 ± 2.38)%;细胞周期中S期细胞比例下降,G2/M期细胞比例增加,与正常对照组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05),提示存在G2/M期阻滞,S期细胞增殖率下降(P < 0.05),周期相关蛋白D1(Cyclin D1)表达水平下降(P < 0.05),周期相关蛋白B1(Cyclin B1)表达水平明显增加(P < 0.05)?结论:下调AURKA表达可抑制骨肉瘤细胞U2-OS的增殖, 同时导致细胞阻滞于G2/M期?     

稳定沉默CXCR4表达的肾癌A498细胞株的构建

目的应用RNA干扰技术降低肾癌A498细胞株的CXCR4基因表达水平,并建立稳定转染细胞株。方法针对CXCR4基因设计合成siRNA,转染肾癌A498细胞株,采用RT-PCR法检测CXCR4基因表达变化,根据有效干扰片段结果合成重组shRNA质粒,稳定转染至A498细胞系并进行G418抗性筛选细胞株。采用RT-PCR和Westen印迹法检测CXCR4mRNA及蛋白表达水平,应用流式细胞技术检测CXCR4shRNA诱导A498细胞凋亡的效应,Transwell试验检测细胞侵袭能力的改变。结果将CXCR4重组shRNA质粒成功转染A498细胞后,肾癌细胞内可见绿色荧光,通过G418筛选,获得了CXCR4基因沉默的A498细胞系,RT-PCR及Western印迹检测证实该细胞系的CXCR4水平明显低于对照组的表达水平(P<0.05)。CXCR4shRNA组细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率均显著高于对照组(P<0.05),Tran-swell体外侵袭实验显示CXCR4shRNA能明显抑制A498细胞的体外侵袭力(P<0.05)。结论成功构建稳定沉默CXCR4表达的肾癌A498细胞株,转染后的细胞凋亡率升高,体外侵袭能力降低,为后续研究奠定了基础。     

特异siRNA沉默Slug基因抑制体外胰腺癌AsPC-1细胞生长的实验研究

目的：研究Slug基因沉默对胰腺癌AsPC-1细胞增殖、凋亡的影响。方法：构建靶向抑制Slug的siRNA表达载体,瞬时转染AsPC-1细胞。采用RT—PCR和Western blot法检测细胞Slug蛋白,MTT检测细胞增殖,Annexin V-FITC／PI了解细胞凋亡的变化。结果：成功构建了pGenesil-1-Slug-siRNA（pSlug-siRNA）和pCenesil-1-Neg-siRNA（pNeg-siRNA）表达质粒。pSlug-siRNA瞬时转染AsPC-1细胞72h后,细胞S1ug表达及生长受到明显抑制,细胞凋亡率明显增加。结论：Slug-siRNA抑制Slug表达,促进As-PC-1细胞凋亡并抑制细胞的增殖。