利用RNA干扰技术下调Lon基因表达的生物学效应研究

目的:通过构建Lon基因下调的哺乳动物细胞模型表达,观察Lon基因对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响,以探讨Lon蛋白的功能.方法:设计针对Lon蛋白酶的小干扰RNA(siRNA),构建pSilencer U6 2.1-Lon真核表达载体,用脂质体法转染人乳腺癌细胞MCF7,RT-PCR检测Lon基因下调的水平,通过采用高温、紫外线照射、顺铂处理,观察Lon基因下调后细胞敏感性的变化(MTT法).结果:RT-PCR显示重组质粒pSilencer U6 2.1-Lon转染MCF7细胞,Lon基因明显下调,RT-PCR未见扩增目的带,细胞培养结果显示,细胞增殖能力明显减弱.紫外线照射和顺铂处理后的MTT结果显示,pSilencer U6 2.1-Lon转染的MCF7细胞,增殖能力明显下降,与空载体转染组(pSilencer U6 2.1)和未转染组相比有显著性差异(P＜0.05).加热应激试验显示,37,41,43℃处理后,RNA干扰转染组(pSilencer U6 2.1-Lon)与空载体转染组、未转染组相比有显著性差异(P＜0.05).而在45℃时,RNA干扰转染组、空载体转染组与未转染组之间均无显著性差异(P＞0.05).结论:RNAi能有效下调Lon蛋白的表达.Lon基因的下调可抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖能力,诱导细胞凋亡,以及可增加MCF7对紫外线和顺铂处理的敏感性.     

多药耐药细胞株A549/Gem的建立及其生物学特性研究

背景和目的多药耐药是导致非小细胞肺癌患者生存期缩短的重要因素。本研究建立了多药耐药细胞株A549/Gem;通过研究其生物学特性,初步从细胞水平分析其获得性耐药的可能机制。方法以人肺腺癌细胞株A549为亲代细胞,采用"临床血浆峰浓度冲击与逐步增加剂量相结合诱导"法,用吉西他滨进行诱导,建立多药耐药细胞株A549/Gem,把诱导过程中的细胞命名为A549/Gem'。分别在诱导前、诱导过程中和诱导成功后的三个不同时间点,应用MTT法检测其耐药指数和对其他化疗药物的敏感性,置于倒置光学显微镜下观察形态学特征,通过绘制生长曲线计算倍增时间,流式细胞术分析细胞周期分布,免疫细胞化学染色检测P53、EGFR、c-erb-B-2、PTEN、PCNA、c-myc、VEGF、MDR-1、Bcl-2、nm23、MMP-9、TIMP-1和CD44v6蛋白的表达,实时荧光定量PCR法检测RRM1 mRNA表达。结果A549/Gem~ 细胞对吉西他滨耐药指数为163.228,对长春瑞宾(耐药指数为5.587±1.210)、多西他赛(耐药指数为102.147±10.259)、氟尿嘧啶(耐药指数为38.694±9.635)、依托泊甙(耐药指数>1000)、顺铂(耐药指数为2.357±11.209)耐药,对紫杉醇(耐药指数为0.264±0.024)、奥沙利铂(耐药指数为0.596±0.128)敏感;倍增时间(146.941h)比A549细胞(186.479h)缩短,G0-G1期细胞(分别为77.07%、71.30%)增多,失去PTEN、PCNA和MDR-1表达,P53、Cerb-B-2和bcl-2表达减弱,出现EGFR( )、c-myc( )表达,nm23表达增强,而MMP-9、VEGF、CD44v6和TIMP-1表达无变化,RRM1 mRNA的相对表达量明显增多。A549/Gem细胞对吉西他滨的耐药指数为129.783,并保持长春瑞宾(耐药指数为4.969±1.203)、多西他赛(耐药指数为58.669±15.206)、依托泊甙(耐药指数>1000)、顺铂(耐药指数为92.594±0.269)耐药性和紫杉醇敏(耐药指数为0.584±0.115)感性,但均较A549/Gem'细胞有所降低,而对奥沙利铂的敏感性(耐药指数为0.259±0.195)和对氟尿嘧啶的耐药性(耐药指数为0.958±0.152)消失,倍增时间(155.749 h)比A549/Gem'细胞稍延长,G0-G1期细胞稍减少,P53、EGFR、PCNA和MDR-1表达与A549/Gem'相同,出现TIMP-1、PTEN表达,Cerb-B-2、MMP-9、c-myc和bcl-2表达增强,nm23表达消失,而VEGF和CD44v6表达始终无变化,RRMl mRNA的相对表达量较A549/Gem'明显减少。与A549细胞相比,A549/Gem细胞逐渐呈现出如下形态学特征:形态不规则、形态各异、大小不一,且透光性减弱。结论A549/Gem细胞的生物学特性较A549细胞发生较大变化,其多药耐药性的发生与多种基因表达有关。     

结直肠癌早期检测的基因标志物

研究表明,肿瘤的发生和发展与癌基因和抑癌基因有着密不可分的关系.随着分子生物学理论和技术的发展,对癌基因和抑癌基因的检测已成为肿瘤临床预警和诊断的重要途径.自Fearon和Vogelstein 1990年提出结直肠癌发生的分子模型以来,结直肠癌发病的分子机制不断被阐明,通过对与结直肠癌相关的基因改变的检测可以为结直肠癌早期预警提供帮助.尤其是对具有家族病史的人进行相关基因改变的检测,检出率已经达到相当高的水平.本文对近年来被认为与结直肠癌相关的基因作一综述.     

诱导方法对多药耐药细胞系A549/Gem建立的影响

目的:探讨诱导方法对多药耐药细胞系A549/Gem建立的影响.方法:以A549细胞为原代细胞,采用4种方法,建立多药耐药细胞系A549/Gem-1、A549/Gem-2、A549/Gem-3和A549/Gem-4(统称A549/Gem).比较其诱导前后耐药指数和耐药谱、形态学特征、倍增时间、细胞周期分布及TPS、SCC、CEA、CYFRA21-1、ERCC1和RRM1 mRNA表达的变化.结果: 4种细胞对吉西他滨的耐药指数分别为 38.277、12.268、115.297和25.679,均获得多药耐药性,但耐药谱差别较大.其中,A549/Gem-1和A549/Gem-4细胞的G0-G1期细胞比例较A549细胞降低.A549/Gem细胞的倍增时间较A549细胞缩短,形态学变化显著,CEA、TPS、SCC和CYFRA21-1表达变化不大,RRM1和ERCC1 mRNA相对表达量增多.结论:A549/Gem细胞获得多药耐药性,诱导方法对其建立影响较大.     

整合素α6在子宫内膜异位症中的表达分析

目的分析子宫内膜异位症(EMS)患者在位和异位内膜组织中整合素α6的表达和分布,初步探讨其在子宫内膜异位症发生中的意义。方法收集EMS患者的子宫内膜(15例)、异位病灶组织(14例),并以正常子宫内膜组织(12例)作为对照组。采用RT PCR、Westernblot和免疫组织化学等方法,对整合素α6在这些组织中的分布和表达进行分析。另取21例新鲜组织(EMS患者的在位内膜9例,异位病灶组织6例,正常子宫内膜6例)进行流式细胞分析。结果对照组在位内膜和EMS患者同期在位内膜的整合素α6分子的表达无显著性差异;EMS患者异位病灶组织的整合素α6分子表达较在位内膜明显降低(P<0.01);异位组织的整合素α6分子表达较对照组明显降低(P<0.01)。结论整合素α6在异位子宫内膜组织中的表达下调可能与EMS的发生发展有关。     

吉西他滨耐药细胞系H460/Gem的建立及其生物学特性研究

目的:建立吉西他滨耐药细胞系H460/Gem,通过研究其生物学特性,初步从细胞水平分析其获得性耐药的可能机制。方法:以人肺大细胞癌细胞系NCI-H460为亲代细胞,采用"2/3临床血浆峰浓度间歇诱导"法,用吉西他滨进行诱导,建立耐吉西他滨的细胞亚系H460/Gem,把诱导过程中的细胞命名为H460/Gem。分别在诱导前、诱导过程中和诱导成功后的三个不同时间点,采用MTT法检测其耐药指数和对其他化疗药物的敏感性,使用倒置光学显微镜观察形态学特征,通过绘制生长曲线计算倍增时间,以流式细胞术分析细胞周期分布,以免疫细胞化学染色检测P53、EGFR、C-erbB-2、PTEN、PCNA、c-myc、VEGF、MDR-1、Bcl-2、nm23、MMP-9、TIMP-1和CD44v6蛋白的表达,采用实时荧光定量PCR法检测RRM1mRNA表达。结果:H460/Gem细胞对吉西他滨耐药指数为1.201时,对紫杉醇、氟尿嘧啶、依托泊甙、顺铂、奥沙利铂耐药,对长春瑞滨、多西他赛敏感;它的倍增时间(18.611小时)比NCI-H460细胞(16.731小时)稍延长,G0~G1期细胞减少(分别为51.56%和68.06%),VEGF、MMP-9表达减弱,失去CD44v6和P53表达,nm23表达增强,出现TIMP-1表达,EGFR、C-erbB-2、PTEN、PC-NA、c-myc、MDR-1、Bcl-2表达无变化,RRM1 mRNA的相对表达量有所减少(分别为0.1589和0.4510)。H460/Gem细胞对吉西他滨的耐药指数为1.644时,同时对氟尿嘧啶、顺铂和奥沙利铂耐药,而对紫杉醇、长春瑞滨、多西他赛和依托泊甙敏感,倍增时间(51.539小时)比NCI-H460细胞明显延长,G0~G1期细胞(57.23%)有所减少,MDR-1、nm23、Bcl-2表达增强,出现C-erbB-2表达,P53、MMP-9和VEGR表达减弱,PTEN、PCNA、c-myc、TIMP-1、EGFR和CD44v6表达无变化,RRM1 mRNA的相对表达量(0.3389)变化不大。与NCI-H460细胞相比,H460/Gem细胞逐渐呈现出如下形态学特征:形态不规则,大小不一,形态各异,且透光性减弱。结论:H460/Gem细胞的生物学特性较NCI-H460细胞发生了较大变化,其多药耐药性的发生与多种基因表达有关。     

LON基因下调对人乳腺癌细胞系MCF-7的增殖以及药物敏感性的影响

目的：应用RNAi的方法抑制丝氨酸蛋白酶LON表达，研究该丝氨酸蛋白酶的表达与肿瘤增殖以及药物敏感性之间的关系。方法：以人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象，通过RNAi下调LON基因表达，采用RT—PCR法、MTT增殖实验、流式细胞术等技术进行检测。结果：在瞬时转染与稳定转染细胞株中，RT—PCR结果证实LON基因的表达明显下调；MTT增殖实验结果显示，LON基因的下调可导致细胞的增殖能力降低，并且能够增加对化疗药顺铂的药物敏感性。流式细胞仪检测显示LON基因的下调对细胞周期没有显著影响。结论：通过RNAi下调LON基因能够抑制肿瘤细胞的增殖并且与顺铂有协同作用，其抑制作用未造成细胞周期的改变。     

血管内皮生长因子受体KDRmRNA和flt-1mRNA与子宫内膜异位症相关性研究

目的探讨血管内皮生长因子受体(VEGFR)中的fms样酪氨酸激酶受体(flt-1)和胎肝激酶受体(KDR)在子宫内膜异位症(内异症)患者异位及在位子宫内膜组织中的表达及其意义.方法采用RT-PCR技术,从核酸水平检测53例内异症患者(44例卵巢子宫内膜异位囊肿,30例内异症在位子宫内膜组织)中的VEGF受体KDRmRNA、flt-1mRNA的阳性表达率及相对表达强度,以40例正常子宫内膜组织作为对照.结果与对照组比较,研究组KDRmRNA和flt-1mRNA的阳性表达率高于对照组,差异有显著性(P＜0.05);研究组在位内膜增殖期与分泌期的阳性表达率、相对表达强度高于对照组子宫内膜组织,差异有显著性(P＜0.05);不同月经周期在位内膜组织KDRmRNA和flt-1mRNA的表达、两组增殖期KDRmRNA相对表达强度高于分泌期flt-1mRNA,而flt-1mRNA分泌期相对表达强度高于KDRmRNA.结论VEGF受体KDRmRNA和flt-1mRNA在内异症中有明显表达并呈周期依赖性.VEGF受体在内异症血管生成中的作用,可能与内异症远处转移、侵袭、种植相关.     

子宫腺肌病患者在位内膜中KDR表达的研究

目的 探讨子宫腺肌病（腺肌病）患者在位子宫内膜中血管内皮生长因子受体（VEGFR）KDR的表达及意义。方法 采用免疫组化（SABC法）方法，检测11例腺肌病患者在位子宫内膜组织（腺肌病组）及30例非内异症患者的正常子宫内膜组织（正常内膜组）中VEGF受体KDR的表达差异。结果 （1）腺肌病在位内膜及正常内膜KDR受体阳性表达率分别为81．81％、76．67％。（2）腺肌病在位内膜腺上皮细胞在增生期、分泌期阳性表达强度分别为（＋＋）和（＋＋＋），较正常内膜组相应时期的（＋～＋＋）和（＋＋～＋＋＋）有一定增高。结论 腺肌病组中KDR受体的明显表达可能与KDR受体参与腺肌病血管生成，促使子宫内膜侵入基层生长有关；也提示基底层子宫内膜侵入基层与卵巢激素相关。