Mechanism of DNA methylation in the regulation of heat shock-induced transcriptional inhibition of cyclin D1 expression.

目的 研究DNA甲基化在热休克诱导的人细胞周期素D1基因启动子活性下降调控中的作用.方法 DNA甲基化通过甲基化特异性PCR方法检测.甲基化位点突变采用Stratagene公司定点突变试剂盒.甲基化位点的作用通过报告基因技术分析启动子活性确认.结果 热休克处理可能造成细胞周期素D1基因启动子+65/67位点发生DNA甲基化,而突变该位点逆转了由报告基因活性分析研究的热休克效应.结论 启动子+65/67位点的DNA甲基化可能调控细胞周期素D1的热休克效应.     

DNA甲基化在热休克诱导细胞周期素D1表达水平降低中的转录调控机制

目的研究DNA甲基化在热休克诱导的人细胞周期素D1基因启动子活性下降调控中的作用。方法 DNA甲基化通过甲基化特异性PCR方法检测。甲基化位点突变采用Stratagene公司定点突变试剂盒。甲基化位点的作用通过报告基因技术分析启动子活性确认。结果热休克处理可能造成细胞周期素D1基因启动子+65/67位点发生DNA甲基化,而突变该位点逆转了由报告基因活性分析研究的热休克效应。结论启动子+65/67位点的DNA甲基化可能调控细胞周期素D1的热休克效应。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A对细胞周期素D1调控的影响?

目的：观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A( TSA)对细胞周期素D1表达的影响,探讨TSA抑制细胞周期素D1表达的分子机制。方法以不同浓度(20、100、400 nmol/L)的TSA处理A549细胞24 h,以RT-PCR、Western blot等方法检测细胞周期素D1 mRNA和蛋白的表达水平;以染色质免疫沉淀技术分析400 nmol/L的TSA处理A549细胞24 h后,细胞周期素 D1基因核心启动子组蛋白3第9位赖氨酸乙酰化( Ac -H3k9)水平。结果随着TSA处理浓度的增加细胞周期素D1 mRNA和蛋白表达水平下降。在400 nmol/L TSA作用下,细胞周期素D1启动子区组蛋白乙酰化程度下降。结论 TSA 造成细胞周期素D1表达下调可能与细胞周期素D1启动子乙酰化程度下降有关。     

神经细胞中乙酰化对NOS1基因启动子活性的调节

 目的 探讨乙酰化对人神经母细胞瘤SK-N-SH 细胞中NOS1基因启动子活性的调节作用。方法 构建系列截短的NOS1 5′侧翼序列萤光素酶报告基因载体,应用萤光素酶报告基因检测系统分析SK-N-SH 细胞中NOS1启动子活性,并比较组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A (TSA)刺激前后启动子活性的变化。结果 构建并鉴定了系列截短的NOS1 启动子萤光素酶报告基因载体;在NOS1基因启动子区鉴定了两个正调控区域和两个负调控区域,同时TSA可上调不同长度启动子的转录活性。结论 乙酰化参与调节神经细胞中NOS1基因启动子活性。     

5-氮-2'-脱氧胞苷及TSA对人结肠癌细胞株HT29 ING1b基因表达的影响

目的 探讨DNA5'CpG岛去甲基化和组蛋白去乙酰化对HT29人结肠癌细胞株ING1b基因启动子区域甲基化、组蛋白乙酰化及其mRNA表达的影响.方法 应用特异性DNA甲基转移酶(DNMTs)抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-dc,以下简称Aza)及组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)作用人结肠癌细胞株HT29后,用甲基化特异性PCR(MSP)检测该ING1b基因核心启动子区域CpG岛甲基化情况,用染色质免疫沉淀(ChIP)检测其乙酰化组蛋白绑定的DNA情况,并用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ING1bmRNA表达.结果 HT29人结肠癌细胞株ING1b基因核心启动子区域存在CpG岛半甲基化,且乙酰化水平低,mRNA表达水平低.经Aza及TSA干预后,ING1b基因核心启动子区域CpG岛转为非甲基化,其乙酰化水平增加,ING1b mRNA表达亦比对照组高.结论 HT29人结肠癌细胞株ING1b基因5端核心启动子甲基化及乙酰化可能是导致该基因表达沉默的主要原因,Aza逆转HT29人结肠癌细胞株ING1b基因异常甲基化,TSA能较好地提高其组蛋白乙酰化水平,并有效地激活因半甲基化所致ING1b基因沉默的再转录,诱导该基因表达,从而抑制肿瘤细胞生长.     

5-氮-2'-脱氧胞苷及曲古抑菌素A对HT29人结肠癌细胞株ING1b基因启动子区域甲基化、组蛋白乙酰化及ING1bmRNA表达的影响

目的　探讨DNA5'CpG岛去甲基化和组蛋白去乙酰化对HT29人结肠癌细胞株ING1b基因启动子区域甲基化、组蛋白乙酰化及其mRNA表达的影响。方法　应用特异性DNA甲基转移酶（DNMTs）抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷（5-Aza-2'-dc,以下简称Aza）及组蛋白去乙酰化酶（HDACs）抑制剂曲古抑菌素A（TSA）作用人结肠癌细胞株HT29后,用甲基化特异性PCR(MSP)检测该ING1b基因核心启动子区域CpG岛甲基化情况,用染色质免疫沉淀(ChIP)检测其乙酰化组蛋白绑定的DNA情况,并用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ING1bmRNA表达。结果　HT29人结肠癌细胞株ING1b基因核心启动子区域存在CpG岛半甲基化,且乙酰化水平低,mRNA表达水平低。经Aza及TSA干预后,ING1b基因核心启动子区域CpG岛转为非甲基化,其乙酰化水平增加,ING1bmRNA表达亦比对照组高。结论　HT29人结肠癌细胞株ING1b基因5端核心启动子甲基化及乙酰化可能是导致该基因表达沉默的主要原因,Aza逆转HT29人结肠癌细胞株ING1b基因异常甲基化,TSA能较好地提高其组蛋白乙酰化水平,并有效地激活因半甲基化所致ING1b基因沉默的再转录,诱导该基因表达,从而抑制肿瘤细胞生长。     

MCF-7/Adr细胞mdr-1基因启动子甲基化和组蛋白乙酰化状态与多药耐药的关系

目的：分析MCF-7/Adr及MCF-7细胞mdr-1基因启动子甲基化和组蛋白乙酰化状态,初步探讨乳腺癌多药耐药的表观遗传机制。 方法：用甲基化敏感PCR技术检测两个细胞系mdr-1基因启动子甲基化状态。实时定量PCR技术检测DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs) mRNA及组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases,HDACs) mRNA的表达。光密度值法检测组蛋白H3和H4乙酰化水平。 结果：MCF-7细胞mdr-1基因启动子呈现高甲基化,MCF-7/Adr细胞mdr-1基因启动子呈现低甲基化。与MCF-7细胞比较,MCF-7/Adr细胞DNMT1,DNMT3a及DNMT3b mRNA表达显著下降(P＜0.05)。MCF-7/Adr细胞组蛋白H3和H4乙酰化水平较MCF-7细胞明显升高(P＜0.01)。与MCF-7细胞比较,MCF-7/Adr细胞HDAC1,HDAC2,HDAC7及SIRT1 mRNA的表达显著下降(P＜0.01)。 结论：mdr-1基因启动子低甲基化、组蛋白H3和H4高乙酰化、DNMTs mRNA及HDACs mRNA低表达可能是介导MCF-7/Adr细胞MDR形成的重要表观遗传学因素。     

组蛋白乙酰化激活人脑胶质瘤中胶质细胞源性神经营养因子转录的机制研究

  目的  研究组蛋白乙酰化对人脑胶质瘤中胶质细胞源性神经营养因子基因(GDNF)的表达调控和具体机制。  方法  取正常人脑组织、低级别胶质瘤脑组织(LG-glioma)、高级别胶质瘤脑组织(HG-glioma)各6例。用组蛋白乙酰化酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制处理人脑神经胶质瘤U251细胞。实时荧光定量PCR检测脑组织及细胞中的GDNF mRNA水平,染色质免疫共沉淀(ChIP)-PCR检测GDNF启动子区转录因子cAMP应答元件结合蛋白(CREB)结合位点的H3K9乙酰化水平,以及转录因子CREB与GDNF启动子区的结合能力,同时检测组蛋白乙酰化酶和脱乙酰化酶抑制剂对转录因子CREB结合能力和GDNF表达的影响。  结果  与正常脑组织和低级别脑胶质瘤组织比较,高级别胶质瘤组织的GDNF mRNA水平高(P < 0.01),GDNF启动子区的H3K9乙酰化水平增加(P < 0.01),且GDNF启动子上CREB结合区的乙酰化水平高于非CREB结合区的乙酰化水平(P < 0.01)。高级别胶质瘤组织中CREB与GDNF启动子区的结合能力高于正常脑组织和低级别脑胶质瘤组织(P < 0.05)。组蛋白乙酰化酶抑制剂处理U251细胞后,GDNF启动子上CREB结合区的乙酰化水平下降,CREB与GDNF启动子结合活性下调,并下调GDNF mRNA和蛋白水平,而组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有相反作用(P < 0.01)。  结论  组蛋白乙酰化通过促进转录因子CREB与GDNF基因启动子区的结合,从而促进胶质瘤中GDNF的高转录。     

组蛋白高乙酰化介导的Egr-1结合促进gdnf基因高转录

目的探讨大鼠C6 胶质瘤细胞中gdnf 基因启动子II 区组蛋白H3K9 高乙酰化引发该基因高转录的机制。方法采用
ChIP-PCR技术检测了大鼠C6星形胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中gdnf基因启动子II区转录因子Egr-1结合位点处H3K9
的乙酰化水平以及Egr-1与该启动子的结合能力;利用Real-time PCR和ChIP-PCR技术,检测了组蛋白乙酰基转移酶抑制剂姜
黄素（Curcumin）和去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）处理对C6 胶质瘤细胞中gdnf 基因启动子II 区Egr-1 结合位点处
H3K9的乙酰化水平、Egr-1与之的结合能力以及该基因转录水平的影响。结果较之正常星形胶质细胞,C6胶质瘤细胞中gdnf
基因启动子II 区Egr-1 结合位点处H3K9 的乙酰化水平显著升高,并且Egr-1 与之的结合能力也显著升高（P<0.01）。当
Curcumin显著降低了Egr-1结合位点处H3K9乙酰化水平时,Egr-1与启动子II区的结合量以及gdnf基因mRNA的表达量都显
著下调（P<0.05）;而当TSA显著升高了Egr-1 结合位点处H3K9 乙酰化水平时,Egr-1 与启动子II 区的结合量以及gdnf 基因
mRNA的表达量都显著升高（P<0.05）。结论在大鼠C6胶质瘤细胞中gdnf基因启动子II区H3K9高乙酰化介导的Egr-1结合
量升高可能是其高转录的原因。
     

组蛋白去乙酰化下调对肾细胞癌BNIP3基因表达的影响

目的探讨肾细胞癌中线粒体促凋亡蛋白BNIP3表达下调机制。方法运用CCK-8法及流式细胞技术检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A（TSA）对肾癌细胞株786-O、ACHN、A498增殖、凋亡的影响;运用实时荧光定量PCR（Q-PCR）和蛋白质免疫印记（Western blot）技术检测TSA对肾癌细胞BNIP3表达的影响;运用染色质免疫沉淀（ChIP）技术检测TSA对肾癌细胞BNIP3基因启动子区组蛋白H3乙酰化状态的影响。结果经TSA处理后,3种肾癌细胞增殖均受到显著抑制（PBNIP3 mRNA（PBNIP3基因启动子区组蛋白H3呈去乙酰化状态,TSA恢复了其乙酰化状态;A498的BNIP3基因启动子区组蛋白H3呈乙酰化状态。结论BNIP3基因启动子区组蛋白去乙酰化是其在肾癌中表达下调的主要机制,并可能参与了肾癌的发生发展。     

细胞周期素D2启动子曲古菌素A效应区域的研究

目的 研究在曲古菌素A(trichostatin A,TSA)处理条件下细胞周期素D2的调控机制.方法 细胞周期素D2的mRNA水平通过RT-PCR方法 检测.细胞周期素D2的启动子片段以A549细胞基因组DNA为模板,通过高保真PCR扩增获得,并克隆到pGL3-BASIC载体中;并以此为基础通过高保真PCR扩增出不同...     

hsp90α基因在染色质模板上的热诱导转录

目的在体外将带有hsp90α基因启动子的报告基因质粒pBLCAT3α1组装为染色质模板,用于研究hsp90α基因的热诱导转录.方法采用竞争性RT-PCR定量检测基因启动子活性的方法,研究染色质模板的体外组装,并比较染色质模板与裸露DNA模板上基因的转录活性.结果优化了热休克处理的HeLa全细胞抽提物在基因转录活性研究中的实验条件:用体外重组表达的染色质组装相关因子与核心组蛋白在体外与hsp90α基因启动子质粒组装成染色质;证明染色质模板的hsp90α基因体外转录水平低于裸露DNA模板,而其热诱导效率显著高于对照组.结论在体外组装的染色质模板具有阻遏hsp90α基因转录的活性,但明显提高了该基因的热诱导表达效率.     

转录因子GATA结合蛋白3对哮喘易感基因ADAM33表达的影响

目的:探讨转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)对解整合素金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM33)基因启动子活性及mRNA表达的影响.方法:以人正常肺上皮BEAS-2B细胞DNA为模板经PCR扩增得到AD...     

STAT1对hsp90∝基因表达的负调控作用

目的 探讨转录因子STAT1对hsp90∝基因表达的调控作用。方法 将STAT1表达质粒转染Jurkat细胞,利用竞争性RT－PCR定量检测其内源性hsp90∝基因mRNA水平。共转染STAT1表达质粒和hsp90∝基因上游调控区不同长度的片段驱动的氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因质粒,利用定量RT－PCR检测CAT报告基因转录水平,用Western印迹分析方法检测42℃ 1h热激前后Jurkat细胞中STAT1酪氨酸磷酸化状态,用电泳迁移率变更分析（EMSA）检测STAT1与hsp90∝5‘基因上游调控区中含有STAT1特异结合元件的双链寡核苷酸片段特异性结合程度。结果 STAT1既可抑制Jurkat细胞hsp90∝基因的表达,又能抑制hsp90∝基因5‘上游调控区驱动的CAT报告基因活性。热激以前Jurkat细胞中的STAT1 701位酪氨酸已有一定程度的磷酸化,热激以后其磷酸化程度明显升高,而且STAT1与hsp90∝基因5‘上游调控区中的STAT1结合元件呈特异性结合。结论 STAT1对hsp90∝基因的表达具有负调控作用。     

人支气管上皮细胞中苯并芘诱导TNF-α表达的分子机制

目的：构建肿瘤坏死因子-α（TNF-α）启动子双荧光素酶报告基因载体,研究苯并芘（B[a]P）暴露对TNF-α mRNA表达的调控机制。方法：采用Real time-PCR技术检测B[a]P暴露下,人支气管上皮细胞（Beas-2B）中TNF-α mRNA随时间的变化趋势。通过分子克隆技术构建TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体并检测其活性。进一步检测Beas-2B细胞和人肾上皮细胞293T细胞暴露于B[a]P环境下,TNF-α启动子活性的变化趋势。结果：Real time-PCR检测B[a]P暴露下,24 h内,Beas-2B细胞中TNF-α mRNA表达量随时间延长升高。且B[a]P刺激Beas-2B细胞24 h内,TNF-α启动子活性也呈升高趋势。B[a]P刺激293T细胞,TNF-α启动子活性也会升高。结论：成功构建了TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体。而且,B[a]P能够促进TNF-α mRNA的转录从而促进TNF-α mRNA的表达,且promoter1要比promoter2活性强,没有细胞特异性。     

丙戊酸钠对哮喘相关基因ORMDL3的作用及其机制研究

目的: 探讨心脏死亡供体（donation after cardiac death,DCD）原位肝移植术后胆道并发症的发生因素、诊断要点和治疗方法。方法: 对2015年1月—2016年8月于南京医科大学第一附属医院肝移植中心实施的87例DCD供肝肝移植患者临床资料进行回顾性分析。87例中29例行经典原位肝移植,58例行改良背驮式肝移植,胆管重建方式均为胆总管端端吻合,无1例放置T管。结果: 87例肝移植患者中9例通过胆道造影确诊为肝移植术后胆道并发症, 8例治愈, 1例好转, 无死亡。胆道并发症发生率10.1%(9/87)。结论: DCD供体原位肝移植术后胆道并发症的发生与供肝缺血时间、DCD供肝质量、胆管吻合技术及供肝修剪技术等因素有关,术后胆道造影有助于及时诊断胆道并发症。介入技术是胆道并发症的主要治疗手段。     

热激启动子驱动的真核表达质粒pHSP-shPLK1-GFP的构建与鉴定

目的 构建热激启动子(pHSP)驱动的靶向敲低Polo样蛋白激酶1(PLK1)的真核表达质粒,并观察其对骨肉瘤U2OS细胞增殖的影响.方法 首先合成热休克蛋白HSP70的启动子,克隆至带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的真核表达质粒pEGFP-C1中,利用pHSP替换原有的CMV启动子,构建真核表达载体pHSP-GFP;其次,利用RNA干扰技术合成以plk1基因为靶向目标的shRNA,将其定向克隆至真核表达载体pHSP-GFP中形成重组质粒pHSP-shPLK1-GFP;另外设计一组阴性对照质粒pHSP-NC-GFP,最后,利用脂质体Lipo2000转染的方法将质粒转染至U2OS细胞,非热激组细胞正常培养,热激组及阴性对照组细胞42 ℃加热2 h,通过细胞免疫荧光染色实验检测GFP的表达,从而确定pHSP的驱动能力,采用Real-time PCR法检测细胞内plk1的mRNA表达水平,Western blot法检测PLK1蛋白表达水平,MTT法检测重组质粒对U2OS细胞增殖的影响.结果 成功构建了pHSP驱动的真核表达质粒pHSP-shPLK1-GFP;细胞免疫荧光染色实验结果显示pHSP可正常驱动gfp基因的表达,且GFP蛋白定位在胞质中;Real-time PCR结果显示热激组细胞plk1基因表达量明显降低,与非热激组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示热激组细胞PLK1蛋白表达量比非热激组及阴性对照组低(P<0.05);MTT结果显示热激组细胞的增殖活性被明显抑制,与非热激组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 pHSP驱动的真核表达质粒pHSP-shPLK1-GFP能在U2OS细胞中表达,在42 ℃加热条件下,该重组质粒呈现更强的下调plk1基因表达和抑制增殖作用.     

乳腺癌中细胞周期素D1基因扩增和过表达及其与c-erbB-2的关系

目的：探讨细胞周期素D1基因和表达的改变在乳腺癌中的作用及其与c-erbB-2表达的关系。方法 采用原位分子杂交和免疫组织化学技术检测59例乳腺癌组织细胞周期素D1基因扩增、mRNA及其蛋白和c-erbB-2的表达。结果 27例（45．8％）细胞周期素D1蛋白过表达,其过表达与腋淋巴结转移相关（P＜0．05）。细胞周期素D1 DNA扩增、mRNA高表达和蛋白过表达三者基本一致,与c-erbB-2过表达无相关。结论 细胞周期素D1蛋白过表达在乳腺癌频发,其基因扩增和转不增加是其重要机制之一。细胞周期素D1和c-erbB-2在乳腺癌中各自发挥独立作用,两者同时检测更有助于判断预后。     

Alteration of cyclin D1 in Chinese patients with breast carcinoma and its correlation with Ki-67, pRb, and p53

BACKGROUND: For the female population in Asia, systematic investigation on alterations of cyclin D1 in breast carcinoma is rare, and correlation between cyclin D1 expression with clinicopathological parameters, survival rate, and other prognostic marker associated with cell cycle is unclear. METHODS: Expression of cyclin D1 protein, Ki-67, pRb, and p53 was determined by immunohistochemistry in 18 cases of early breast carcinomas and 80 cases of invasive ductal carcinomas. Genetic alteration of cyclin D1 gene and overexpression of cyclin D1 mRNA were detected by Southern blot and RT-PCR, respectively. RESULTS: Expression of cyclin D1 is negative in usual ductal hyperplasia (UDH) and atypical ductal hyperplasia (ADH). However, in 52.0% (51/98) of all breast carcinomas, positive expression of cyclin D1 was observed. Five-year survival rate of the patients with positive expression of cyclin D1 (52.7%) is significantly lower than the cases with negative expression of cyclin D1 (72.1%). Positive rate of cyclin D1 protein in invasive ductal carcinoma (52.5%) is slightly higher than overexpression rate (40.8%) of cyclin D1 mRNA but significantly higher than amplification rate of cyclin D1 gene (18.4%). Expression of cyclin D1 is correlated with Ki-67 expression, but not correlated with pRb and p53 expression. CONCLUSIONS: Positive expression of cyclin D1 could serve as a poor prognostic marker for Chinese patients with breast carcinoma independent of nodal metastasis and clinical stage. Expression of cyclin D1 protein is affected more directly by overexpression of cyclin D1 mRNA rather than cyclin D1 gene amplification. The cooperation between pRb and p53 with cyclin D1 protein in the carcinogenesis of breast carcinoma is not supported by the results.