人骨髓间充质干细胞的培养及性质鉴定

目的 分离培养并鉴定人胚胎骨髓间充质干细胞。方法 抽取流产胎儿股骨骨髓,梯度离心,取含有骨髓间充质干细胞的低密度血小板层进行培养;免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原和细胞基质中的蛋白属性;酶细胞化学法测定细胞碱性磷酸酶活性。结果 培养的细胞呈现纺锤形外观;细胞膜抗原PDGFR、CD29、CD44有阳性表达,IGF－1R、CD34、CD45呈阴性表达,细胞基质中纤维粘连蛋白、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ有表达,而胶原蛋白Ⅱ和层粘蛋白没有表达;碱性磷酸酶检测呈阴性反应。结论 培养的细胞不是骨髓中的造血干细胞或骨髓基质中的成纤维细胞,是处于未分化阶段的骨髓间充质干细胞。     

小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和鉴定

目的建立一种实用高效的小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的体外分离培养方法,并进行初步表型鉴定。方法采取贴壁细胞分离法分离和培养MSCs。倒置显微镜观察原代及传代细胞的形态及生长过程,使用免疫细胞化学方法进行MSCs的初步表型鉴定。结果 MSCs贴壁生长,形态均一,呈成纤维缓胞样,生长状态良好。免疫细胞化学检测CD44、CD105、CD34阳性率分别为94.3%、82.3%、3.3%。结论采用贴壁培养法可分离培养出高纯度的MSCs。     

小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和鉴定

目的建立一种实用高效的小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的体外分离培养方法,并进行初步表型鉴定。方法采取贴壁细胞分离法分离和培养MSCs。倒置显微镜观察原代及传代细胞的形态及生长过程,使用免疫细胞化学方法进行MSCs的初步表型鉴定。结果 MSCs贴壁生长,形态均一,呈成纤维缓胞样,生长状态良好。免疫细胞化学检测显示:CD44、CD105、CD34阳性率分别为94.3%、82.3%、3.3%。结论采用贴壁培养法可分离培养出高纯度的MSCs。     

人脐血间充质干细胞体外分离、培养与鉴定

目的 建立体外分离和培养人脐血间充质干细胞的方法,并探讨脐血间充质干细胞是否具有与骨髓间充质干细胞相一致的免疫表型.方法 无菌条件下采集正常产胎儿脐血,用相对密度为1.077的淋巴细胞分离液分离脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs),采用贴壁培养法获得MSCs,体外培养并对其增殖进行观察.用流式细胞仪检测细胞周期状态和白细胞表面抗原.结果 来源于脐血的MSCs在含有15%胎牛血清和低糖DMEM培养基中可以贴壁,并表现为间充质样细胞;传3代后,此类细胞可以纯化、扩增;其细胞倍增时间为60h左右.流式细胞分析细胞周期显示大部分细胞(85%)处于G0/G1期;此类细胞稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD54、CD105,但不表达造血细胞系的表面标记CD34、CD45.结论 脐血中可培养出非造血干细胞,其白细胞表面抗原表达与骨髓间充质干细胞有较强的一致性.     

人骨髓间充质干细胞的培养及性质鉴定

目的 分离培养并鉴定人胚胎骨髓间充质干细胞。方法 抽取流产胎儿股骨骨髓,梯度离心,取含有骨髓间充质干细胞的低密度血小板层进行培养;免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原和细胞基质中的蛋白属性;酶细胞化学法测定细胞碱性磷酸酶活性。结果 培养的细胞呈现纺锤形外观;细胞膜抗原 PDGFR、CD29、CD44有阳性表达,IGF-1R、CD34、CD45呈阴性表达,细胞基质中纤维粘连蛋白、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ有表达,而胶原蛋白Ⅱ和层粘蛋白没有表达;碱性磷酸酶检测呈阴性反应。结论 培养的细胞不是骨髓中的造血干细胞或骨髓基质中的成纤维细胞,是处于未分化阶段的骨髓间充质干细胞。     

人类脐带血间充质干细胞的培养及鉴定

目的对人类脐带血中的有核细胞进行分离培养及鉴定,观察能否得到间充质干细胞。方法抽取人类脐带静脉血,进行细胞分离和培养,并进行荧光激活细胞分析。结果脐带血中间充质干细胞与骨髓中的类似,其外表呈纤维样;流式细胞术鉴定结果表明这种细胞能表达CD29、CD44、CD90、CD95、CD105、CD166以及MHCⅠ(组织相容性抗原复合体Ⅰ),但不能表达CD14、CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、CD117、CD152以及MHCⅡ(组织相容性抗原复合体Ⅱ);并且具有分化成骨细胞和脂肪细胞的潜能。结论可以从人类脐带血中成功分离培养得到间充质干细胞。     

人脐血间充质干细胞的改良分离培养

目的探讨人间脐血来源的充质干细胞在体外分离培养与扩增的方法。方法用重力离心-密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离细胞,用含15%FBS的DMEM低糖培养基培养并传代,流式细胞仪检测P3代间充质干细胞的表面标志。结果脐血来源的单个核细胞24 h即开始贴壁,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞。经自然纯化法传代后,可得到形态单一的长梭形间充质干细胞。流式细胞仪检测结果显示该细胞表达CD44。结论脐血来源的MSCs可以在体外分离培养和扩增,细胞表面标记与骨髓来源间充质干细胞一致。     

骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学鉴定

目的：建立体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的方法，描述MSCs的生物学特征，探索MSCs作为组织工程种子细胞的可行性。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法，分离纯化大鼠MSCs。利用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD14、CD29、CD34、CD45、CD105的表达率。取第4代MSCs进行成骨、成脂肪、成软骨诱导分化，观察细胞的形态变化情况，在诱导第14d进行茜素红染色和油红染色以检测MSCs是否分化成骨和脂肪细胞；在诱导第21d用阿新蓝染色法检测MSCs是否分化成软骨细胞。结果：从骨髓分离获得的MSCs为体积小、核浆比大、呈旋涡状生长的梭形细胞。第3代细胞表面标记物阳性率分别为CD14：0．67％，CD29：94．5％，CD34：0．72％，CIM5：0．39％，CD105：86．36％。MSCs在相应的诱导条件下，分化成骨、脂肪、软骨细胞。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法可分离出较纯的MSCs，经扩增培养后获取足够数量的MSCs，能满足组织工程的需要。MSCs具有多向分化的潜能，可在体外诱导分化成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，具有广阔的应用前景。     

人脐血间充质干细胞分离培养的研究进展

干细胞是一类具有自我复制能力和产生分化细胞能力的细胞,分为胚胎干细胞和成体干细胞。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）属于成体干细胞的一种,来源于胚胎发育早期的中胚层和外胚层,最早在骨髓（bone marrow,BM）中被发现。     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

人脐血间质干细胞一般特性及其多向分化潜能

 【目的】观察人脐血间质干细胞增殖能力、细胞表面分子标志及多向分化潜能。【方法】从人脐血中分离出单个核贴壁细胞并进行体外培养。将细胞以单克隆抗体标记后用流式细胞仪进行检测。向培养细胞中加入成骨、成软骨和成脂肪诱导剂，检测其多向分化能力。【结果】脐血间质干细胞原代培养时间为7周。流式细胞分析显示这些细胞CD29、CD13、CD44等表达为阳性，但是它们不表达造血干细胞表面标志物。加入成骨诱导剂会导致细胞碱性磷酸酶的表达。采用微球培养法并加入软骨诱导剂对细胞进行诱导，用阿尔新蓝染色显示有蛋白多糖表达。在加入成脂诱导剂后，会导致细胞形态学改变，且油红O染色为阳性。【结论】通过体外传代培养的方法可以从人脐血单个核贴壁细胞中得到纯化的间质干细胞。脐血有望成为间质干细胞的替代来源。     

人脐血间质干细胞一般特性及其多向分化潜能

【目的】观察人脐血间质干细胞增殖能力、细胞表面分子标志及多向分化潜能。【方法】从人脐血中分离出单个核贴壁细胞并进行体外培养。将细胞以单克隆抗体标记后用流式细胞仪进行检测。向培养细胞中加入成骨、成软骨和成脂肪诱导剂，检测其多向分化能力。【结果】脐血间质干细胞原代培养时间为7周。流式细胞分析显示这些细胞CD29、CD13、CD44等表达为阳性，但是它们不表达造血干细胞表面标志物。加入成骨诱导剂会导致细胞碱性磷酸酶的表达。采用微球培养法并加入软骨诱导剂对细胞进行诱导，用阿尔新蓝染色显示有蛋白多糖表达。在加入成脂诱导剂后，会导致细胞形态学改变，且油红O染色为阳性。【结论】通过体外传代培养的方法可以从人脐血单个核贴壁细胞中得到纯化的间质干细胞。脐血有望成为间质干细胞的替代来源。     

人脐血间充质干细胞的分离与纯化

目的:探讨人脐血间充质干细胞(MSC)的培养纯化条件。方法:比较不同的梯度离心速度及时间、接种密度、首次换液时间、不同培养基对脐血中的MSC分离及原代培养过程的影响,以流式细胞仪对优化条件下培养的MSC进行细胞周期分析,并对细胞表面标志进行检测。结果:在其他条件不变的情况下,以1 000g×15 min的梯度离心速度及时间分离脐血为最宜,5×106/mL是脐血MSC培养的适宜接种密度,首次换液时间7 d。优化条件下培养的MSC传至3代时,几乎全部强表达CD29、CD44。结论:建立了一种优化的人脐血MSC分离纯化方法。     

人脐带间充质干细胞体外分离、培养、扩增方法及生物学特性研究

目的 建立从足月脐带分离间充质干细胞和体外传代培养技术,并对其生物学特性进行研究.方法 采用双酶法分离脐带间充质干细胞,并通过传代进行纯化和扩增培养,绘制生长曲线;用流式细胞仪检测脐带表面抗原及细胞周期;采用软琼脂克隆实验以观察脐带致瘤性.结果 成功建立了脐带间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD105、CD44、CD13和CD29,不表达造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型CD31,不表达CD106、CD166和HLA-DR;细胞倍增时间为30h,细胞周期分析表明,G0～G1期和S G2 M期所占比例分别为78.84%和11.16%,脐带间充质干细胞在软琼脂中无克隆形成.结论 双酶法是一种较好的分离和培养方法间充质干细胞的方法,培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性,无致瘤性,为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据.     

OECs无血清上清液体外诱导UB-MSCs向神经细胞分化

目的:观察大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁联合阿糖胞苷抑制法获得较高纯度的嗅鞘细胞,在最佳状态细胞无血清培养后取上清液。收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,采用差速贴壁法纯化间充质干细胞,传第三代后用上述收集的嗅鞘细胞无血清上清液诱导,观察诱导分化过程,免疫组化鉴定分化结果。结果:用差速贴壁和阿糖胞苷抑制法可获得纯度高达95%的嗅鞘细胞,使用无血清嗅鞘细胞上清液培养脐血间充质干细胞后,发现能诱导脐血间充质干细胞向神经细胞形态分化,胞体呈椭圆形,伸出长突起。诱导7天后相差显微镜下可观察到神经干细胞、神经元和胶质细胞形态的细胞,与NSE、GFAP细胞免疫组化结果一致。结论:大鼠嗅鞘细胞无血清上清液有明显诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞的作用。     

人脐血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

目的探索人脐静脉血内皮祖细胞的分离培养,为内皮祖细胞的临床应用提供实验方法。方法选择脐静脉血,应用密度梯度离心法,获取单个核细胞,接种于预先包埋了人纤维连接蛋白的培养板,用加入生长因子VEGF165和bFGF的内皮细胞专用培养基EGM-2MV培养细胞,3d后,洗掉非贴壁细胞,换培养液继续培养至7d,收集贴壁细胞进行细胞分析。激光共聚焦显微镜进行细胞功能学鉴定,流式细胞术测定祖细胞和内皮细胞系标志,MTT比色法检测细胞的生长状态。结果经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞能特异性吸附FITC标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL,祖细胞标志CD133及内皮细胞特异性抗原CD34、KDR检测,其阳性率分别为(27.05±2.94)%、(16.37±2.69)%和(56.67±7.29)%;体外培养的内皮祖细胞具有良好的细胞增殖活性。结论人脐静脉血中可以分离培养内皮祖细胞,为内皮祖细胞的进一步研究及临床应用奠定了基础。     

人脐带间充质干细胞分离扩增方法的优化

【目的】 探究一种高效稳定分离、扩增人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）的方法。【方法】取材脐带20条,获得Wharton’s Jelly组织,分别用酶联合消化法（12例）和酶序贯消化法（8例）来分离、提取hUC-MSCs,比较两种方法分离hUC-MSCs的成功率、原代培养时间及获得的细胞数量;利用低糖DMEM（LG-DMEM）完全培养基和LD-Mesen培养基（MesenPro RSTM与LG-DMEM的混合培养基）分别培养hUC-MSCs,比较两种培养体系的扩增效率。对所获取细胞的免疫表型以流式细胞术进行鉴定,并诱导成脂、成骨分化验证其多向分化潜能。【结果】 酶联合消化法和酶序贯消化法成功率分别为100%（12/12）和12.5%（1/8）,二者相比有显著统计学差异（P=1.03×10-4）,前者原代培养平均时间为（14.17±1.14）d,获得细胞（1.30±0.14）×106个。2×105个hUC-MSCs用LD-Mesen和LG-DMEM两种体系培养12d后,扩增所得的细胞数分别为(14.86±0.08)×106和(5.08±0.08)×106,二者有显著统计学差异（P=1.38×10-8)。hUC-MSCs高表达CD73、CD105、CD90、CD29、CD44,不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR;并可向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化。【结论】 酶联合消化Wharton’s Jelly组织并以LD-Mesen体系进行扩增可高效获取hUC-MSCs,效率明显优于传统方法。     

人胎盘源间充质干细胞对脐血单个核细胞体外生长的支持作用

目的探讨人胎盘源问充质干细胞（PMSCs）对脐血单个核细胞（MNCs）体外生长的支持作用。方法将人胎盘组织经胶原酶消化、贴壁培养获得人PMSCs，用流式细胞仪检测细胞表面标志。以密度梯度离心法分离脐血MNCs和传代后的PMSCs进行共培养，通过细胞计数和流式细胞仪分别检测细胞的生长情况。结果从人胎盘组织中成功分离和培养PMSCs，经流式细胞仪检测其表型为CD29^＋,CD44^＋,CD105^＋、CD106^＋、CD166^＋、CD34^-,CD45^-、HLA—DR^-。人PMSCs＋脐血MNCs共培养组的细胞总数和CD45^＋细胞数在各培养时间点均明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。在培养第7天，CD45^＋、CD14^＋及CD19^＋细胞数共培养组也明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。结论人PMSCs可以作为滋养层细胞有效支持脐血MNCs的体外生长。     

人脐带间充质干细胞过敏性试验

目的：观察人脐带间充质干细胞对豚鼠的过敏性反应,为临床使用人脐带间充质干细胞的安全性提供参考。方法：培养扩增人脐带来源的间充质干细胞,制备成细胞生理盐水混悬液。将30只豚鼠分成3组,分别是模型1组、模型2组和对照组。2个模型组隔日肌注细胞生理盐水混悬液3次,实验1组于首次注射后第14天,实验2组于首次注射后第21天分别静脉注射混悬液进行攻击。观察动物有无过敏反应症状。结果：动物无明显过敏反应症状,反应级数为0级。结论：人脐带间充质干细胞免疫原性低,不易导致过敏反应。     

sCD40L诱导人脐静脉内皮细胞损伤对人脐间充质干细胞趋化性的影响

目的 应用人重组CD40L (r-CD40L)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤,研究该损伤对人脐间充质干细胞(UC-MSCs)趋化作用的影响.方法 培养HUVEC,采用不同浓度r-CD40L刺激HUVEC 24 h,应用Transwell(滤膜直径6.5 mm,孔径0.4μm)技术建立内皮细胞通透模型并计算通透系数;培养HUVEC,采用不同浓度r-CD40L刺激HUVEC 24 h,将干预后4组细胞经处理后取上清置入EP管,离心后加入Transwell(滤膜直径6.5 mm,孔径8μm)小室下室,将第5代UC-MSCs用含5％FBS的培养基调整细胞浓度为1×105/mL,接种到预处理后的Transwell小室的上室,5％ C02 37.C,培养24 h,取出后用1％结晶紫染色,200倍镜下随机计数6个无重叠细胞视野的透膜细胞数,取平均数代表该组细胞的侵袭能力.结果 随着r-CD40L刺激浓度的增加,内皮细胞通透系数逐渐升高;不同浓度r-CD40L(0、20、30、40 μg/L)刺激HUVEC 24h后,损伤的内皮细胞诱导UC-MSCs透膜细胞个数分别为10.00±1.76、25.96±2.84、37.88±3.23、49.04±2.81,组间比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 sCD40L能诱导内皮细胞损伤;并且随着内皮细胞损伤程度的增加对人脐间充质干细胞的趋化性增强.