抑癌基因p53诱导Wnt通路抑制因子sFRP的表达

目的研究p53对Wnt通路抑制因子sFRP表达的调节作用。方法将携带p53基因的复制缺陷型腺病毒载体(Adp53)导入到p53缺失的人肝癌细胞株Hep3B中,以流式细胞术检测Adp53转基因情况,以RT-PCR技术检测p53对sFRP表达的调节作用。结果sFRP mRNA水平在转染p53 20 h后即有明显升高,其中以32 h达最高水平,随后逐渐降低。量效关系研究表明在转染剂量为0.05、0.5、5、50 pfu/cell的Adp53 sFRP mRNA表达均有显著增高,尤以5 pfu/cell时表达水平最高。结论p53能明显诱导Wnt通路抑制剂sFRP的mRNA表达。     

外源性p53对Wnt通路抑制因子Dickkopf-1的表达作用

目的研究外源性p53对W nt通路抑制因子D ickkopf-1(DKK-1)的表达作用。方法将携带p53基因的复制缺陷型腺病毒载体(Adp53)导入到p53完全缺失的人肝癌细胞株Hep3B中,并以p53反以寡核苷酸阻断p53阳性细胞p53的表达,以W nt通路的关键因子-βcaten in的改变为功能指标评价W nt通路的变化。以RT-PCR技术检测W nt通路抑制因子DKK-1表达的调节作用,以流式细胞术检测Adp53的转基因情况,肝癌细胞中p53和β-caten in的表达。结果DKK-1mRNA水平在转染Adp53 20 h后即有明显升高,32 h达最高水平,随后逐渐降低。β-caten in表达水平随着转染时间和转染剂量的增加,阳性细胞百分比强度和平均荧光量强度表达水平逐渐下降。以p53反以寡核苷酸阻断p53阳性细胞p53表达后,抑制剂DKK-1的表达逐渐降低,-βcaten in表达水平逐渐增加。结论外源性p53能明显诱导W nt通路抑制剂DKK-1的表达,进而产生抑制W nt通路的作用。     

抗肿瘤药羟喜树碱对Wnt通路抑制剂FrpHE的表达作用

目的研究加入羟喜树碱后Wnt通路抑制因子FrpHE(frizzled relatd protein)在人肿瘤细胞株中的表达调控作用。方法选择人肝癌HepG2(HepG2,含野生型p53;Hep3B,p53缺失)和人大肠癌(Lovo,含野生型p53),人神经胶质瘤细胞(U251,p53突变)细胞株为模型,观察抑制剂FrpHE以及反映Wnt通路功能变化的-βcatenin的表达。以RT-PCR技术检测Wnt通路抑制因子FrpHE表达的调节作用,以流式细胞术检测肿瘤细胞中Wnt通路的关键调节因子-βcatenin的表达。结果加入羟喜树碱24h后FrpHE mRNA表达水平在人肝癌细胞(HepG2,含野生型p53;Hep3B,p53缺失)中与对照组相比表达水平显著增加。在人大肠癌细胞(Lovo,含野生型p53)和人神经胶质瘤细胞(U251,p53突变型)中,未见FrpHE mRNA表达。-βcatenin的阳性细胞百分比强度和平均荧光量强度与对照组相比,表达水平降低。结论羟喜树碱在人肝癌细胞中能明显诱导抑制剂FrpHE mRNA的表达。     

化疗药羟喜树碱诱导Wnt信号通路抑制剂DKK-1的表达作用

目的 研究加入抗肿瘤药羟喜树碱后Wnt信号通路抑制因子DKK(dickkopf-1)在人肿瘤细胞株中的表达调控作用.方法 选择四个不同p53状态的人肝癌HepG2(HepG2,含野生型p53;Hep3B,p53缺失)和人大肠癌(LoVo,含野生型p53),人神经胶质瘤细胞(U251,p53突变)加入抗肿瘤药羟喜树碱后,观察抑制剂DKK-1以及反映Wnt信号通路功能变化的β-catenin的表达.以RT-PCR技术检测Wnt信号通路抑制因子DKK-1的表达作用,以流式细胞术检测肿瘤细胞中β-catenin的表达.结果 加人羟喜树碱24 h后DKK-ImRNA表达水平在人肝癌细胞(HepG2,含野生型p53;Hep3B,p53缺失)、人大肠癌细胞(LoVo,含野生型p53)和人神经胶质瘤细胞(U251,p53突变型)中与对照组相比表达水平显著增加.β-catenin的阳性细胞百分比强度与对照组相比表达水平降低.结论 羟喜树碱在人肝癌细胞、人大肠癌细胞、人神经胶质瘤细胞中能够诱导抑制剂DKK-1 mRNA的表达.     

葛根素抑制人子宫颈癌细胞株HeLa增殖和诱导凋亡作用研究

目的:探讨葛根素对人子宫颈癌细胞株HeLa的作用及其机制。方法:取对数生长期的HeLa细胞分别用不同剂量的葛根素处理(0μmol,12.5μmol,25μmol,50μmol)。细胞培养48 h后,利用MTT法检测HeLa细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡水平,RT-PCR法检测Bax mRNA和Bcl-2 mRNA水平。Western blotting法检测Wnt、β-catenin、Bax、Bcl-2、p53和p21表达水平。结果:葛根素成剂量依赖性地抑制HeLa细胞增殖,促进细胞凋亡,促进BaxmRNA表达,减少Wnt、β-catenin、Bcl-2 mRNA、p53和p21表达。结论:葛根素可抑制宫颈癌HeLa细胞增殖并诱导其凋亡,其作用机制与减少Wnt/β-catenin信号通路活化相关。     

化疗药顺铂对Wnt通路抑制因子的表达作用

目的 研究抗肿瘤药顺铂(cisplatin,Pt)对Wnt通路抑制因子FrpHE(frizzled relatd protein)和 DKK-1(dickkopf-1)表达的调节作用.方法 培养人肝癌HepG2、Hep3B、人大肠癌Lovo和人神经胶质瘤U251细胞,并分别加入5 μmol/L Pt作用24 h,以RT PCR技术检测FrpHE和DKK-1mRNA,以流式细胞术检测肿瘤细胞中Wnt通路的关键调节因子β-catenin的表达.结果 顺铂作用24 h后,FrpHE mRNA表达水平在人肝癌细胞较对照组表达水平显著增加(P<0.001).在人大肠癌细胞和人神经胶质瘤细胞中,未见FrpHE mRNA表达.DKK 1mRNA表达水平在加入Pt作用后的人肝癌细胞、人大肠癌细胞和人神经胶质瘤细胞均较对照组表达水平显著增加.β-catenin的阳性细胞百分比和平均荧光强度与对照组相比均降低(P<0.001).结论 化疗药顺铂能够诱导肝癌细胞FrpHE mRNA和人肝癌、肠癌、神经胶质瘤细胞DKK-1 mRNA的表达,抑制Wnt通路.     

Bcl-2和p53基因对永生化软骨细胞端粒酶活性影响的实验研究

目的：探讨原癌基因bcl-2 和肿瘤抑制基因p53调节永生化细胞端活性的机理。方法：兔髁突软骨细胞通过真核表达载体转梁人端粒酶催化亚基hTERT，经G418筛选，挑选阳性克隆培养，使用原位杂交和荧光TRAP检测转染细胞bcl-2和p53 Mrn水平和端粒酶活性。结果：未转染的细胞无端粒酶活性；100代转染后的软骨细胞端粒粒酶活性明显高于未转染细胞；同时 bcl-2 mRNA和p53 mRNA水平有所降低， bcl-2 mRNA水平明显低于未转染hTERT和端粒阴酶软骨细胞。结论 bcl-2和p53参与了细胞永生化过程中端粒酶活性的调节。     

Wnt／β-catenin信号途径促进肌源性干细胞向神经细胞分化

目的探讨Wnt／β—catenin信号途径在肌源性干细胞（musclederivedstemcells,MDSCs）分化过程中的调控作用。方法对照组单纯体外培养MDSCs;实验组采用丙戊酸（valproicacid,VA）诱导培养MDSCs分化为类神经细胞;抑制剂组在实验组的基础上采用Dickkopf-l（DKK-1）和sFRP抑制Wnt／β—catenin信号途径。免疫细胞化学检测各组MDSCs的分化情况。RT—PCR检测MDSCs中Wnt3amRNA表达的变化,Westernblot检测MDSCs中GSK-3β、β—catenin蛋白含量的变化。结果实验组和抑制剂组MDSCs经VA诱导后出现神经细胞分化现象,抑制剂组分化水平明显低于实验组,对照组未见分化。与对照组相比,实验组和抑制剂组Wnt3amRNA和β—catenin表达水平增加,实验组明显高于抑制剂组。实验组和抑制剂组GSK-3B表达水平低于对照组。结论MDSCs向类神经细胞分化过程中Wnt／i3-catenin信号通路被激活,Wnt／β-catenin信号通路阻断能够部分抑制MDSCs向类神经细胞分化。     

RNA干扰技术抑制HPV16 E6基因表达对宫颈癌细胞株CaSki增殖的影响

目的观察HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)能否抑制宫颈癌细胞生长,并探讨其作用机理。方法化学合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,应用细胞计数的方法测定细胞生长曲线、活细胞率及细胞生长抑制率。运用实时荧光定量RT-PCR、流式细胞术检测转染后不同时间点细胞周期、HPV16 E6、p53、p21 mRNA及蛋白表达的变化。结果转染HPV16 E6 siRNA后,细胞生长明显受到抑制。流式细胞术结果显示并未将细胞阻滞在G1期。实时荧光定量RT-PCR显示,转染24h,E6 mRNA的表达比空白组降低了20.11倍(P<0.05),而p53、p21 mRNA的表达无明显变化。转染48h,E6蛋白表达明显下调,Pp53、P21蛋白表达相应地升高。结论HPV16 E6 siRNA可通过特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复P53蛋白的功能活性而发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用。     

双氯芬酸抑制肝癌细胞增殖和促进环氧合酶-2 mRNA作用的表达

目的 观察环氧合酶抑制剂双氯芬酸钠对体外培养的肝癌细胞HepG2、Hep3B和正常肝细胞系QSG-7701增殖的作用以及药物对环氧合酶-2（COX-2）mRNA表达的影响，探讨COX-2与肝癌细胞增殖的关系。方法 采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞计数法测定药物作用24、48、72h后细胞增殖活性，半定量逆转录聚合酶链反应检测各种细胞系COX-2 mRNA的表达水平以及药物作用对基因表达的影响。结果双氯芬酸在10～200μmol/L浓度依赖性地抑制HepG2和Hep3B细胞的增殖，50μmol／L作用48h后抑制率分别为40．47％和54．49％，半数抑制浓度分别为70．54和48．39μmol／L。双氯芬酸对正常肝细胞株QSG-7701的抑制作用较弱，作用48h的半数抑制浓度为189．91μmol／L。HepG2、Hep3B细胞均表达COX-2 mRNA，QSG-7701细胞几乎不表达COX-2 mRNA。双氯芬酸和化疗药5-氟尿嘧啶均可增强HepG2和Hep3B细胞COX-2 mRNA的表达。结论 双氯芬酸特异性地抑制表达COX-2的肝癌细胞HepG2和Hep3B的增殖，并且诱导COX-2 mRNA表达上调，提示COX-2在肝癌细胞增殖中具有重要意义。     

Induction of apoptosis in human Hep3B hepatoma cells by norcantharidin through a p53 independent pathway via TRAIL/DR5 signal transduction

<正>Objective:To investigate the inhibitory activities of norcantharidin(NCTD),a demethylated analogue of cantharidin,on Hep3B cells(a human hepatoma cell line) with deficiency of p53.Methods:The survival rate of the Hep3B cells after treating with NCTD was measured by MTT assay.Cell cycle of treated cells was analyzed by flow cytometry,and DNA fragmentation was observed by electrophoresis.The influence of inhibitors for various caspases and anti-death receptors antibodies on the NCTD-induced apoptosis in the cells was determined. Results:NCTD treatment resulted in growth inhibition of Hep3B cells in a dose- and time-dependent manner.Cell cycle analysis of the cells after treatment with NCTD for 48 h shows that NCTD induced G_2M phase arrest occurs at low concentration(≤25μmol/L) but G_0G_1 phase arrest at high concentration(50μmol/L).The addition of both caspase-3 and caspase-10 inhibitors completely inhibited DNA fragmentation.Addition of anti-TRAIL/DR5 antibody significantly inhibited DNA fragmentation.Conclusion:NCTD may inhibit the proliferation of Hep3B cells by arresting cell cycle at G_2M or G_0G_1 phase,and induce cells apoptosis via TRAIL/DR5 signal transduction through activation of caspase-3 and caspase-10 by a p53-independent pathway.     

miR-188-5p对胰岛素抵抗Hep G2细胞的改善作用研究

目的 探讨miR-188-5p对Hep G2细胞胰岛素抵抗的影响。 方法 采用高浓度葡萄糖（30 mmol/L）诱导处理人肝癌Hep G2细胞24 h构建胰岛素抵抗细胞模型,实验分为6组：对照组、模型组、miR-188-5p mimic组、mimic-NC组、miR-188-5p inhibitor组及inhibitor-NC组。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR)检测Hep G2细胞中miR-188-5p表达水平;MTT法检测细胞增殖率;生化实验检测细胞内葡萄糖及糖原含量;免疫荧光染色观察细胞中葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter type 4 protein,GLUT4）的表达。 结果 与对照组比较,模型组miR-188-5p表达、细胞增殖率、葡萄糖摄取及糖原含量均明显降低（P＜0.05）,GLUT4蛋白表达减少。与模型组比较,miR-188-5p mimic组miR-188-5p表达、细胞增殖率、葡萄糖摄取及糖原含量均明显升高（P＜0.05）,GLUT4蛋白表达也增加,而miR-188-5p inhibitor组趋势与miR-188-5p mimic组相反。 结论 胰岛素抵抗Hep G2细胞中miR-188-5p表达降低,上调miR-188-5p表达可促进细胞增殖,缓解葡萄糖代谢障碍。     

转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肝癌细胞系的凋亡与p53及Smad4活化相关

目的:明确转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肝肿瘤细胞系凋亡及其与Smad的关系.方法:选用3种含有不同p53基因状态的人肝肿瘤细胞系,应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)对TGF-β1诱导的肝肿瘤细胞的凋亡进行了定量检测.为明确凋亡机制,还应用LF2000把含有Smad结合元件和荧光素酶基因的TGF-β1可诱导的荧光素酶报告质粒对细胞进行了转染,后经TGF-β1作用,分别检测其相对荧光素酶活性.结果:在应用TUNEL检测的3个细胞系中,TGF-β1仅能诱导HepG2细胞(野生型p53)凋亡,而Huh-7(突变型p53)和Hep3B细胞(缺失型p53)则凋亡较少.荧光素酶检测显示,HepG2细胞对TGF-β1反应较强,而Huh-7和Hep3B细胞其荧光素酶的表达较低.结论:HepG2细胞系比Huh-7和Hep3B细胞系更易发生TGF-β1诱导的凋亡,Smad4也许是TGF-β1信号转导途径的主要调控因子之一.     

转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肝癌细胞系的凋亡与p53及Smad4活化相关

目的:明确转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肝肿瘤细胞系凋亡及其与Smad的关系.方法:选用3种含有不同p53基因状态的人肝肿瘤细胞系,应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)对TGF-β1诱导的肝肿瘤细胞的凋亡进行了定量检测.为明确凋亡机制,还应用LF2000把含有Smad结合元件和荧光素酶基因的TGF-β1可诱导的荧光素酶报告质粒对细胞进行了转染,后经TGF-β1作用,分别检测其相对荧光素酶活性.结果:在应用TUNEL检测的3个细胞系中,TGF-β1仅能诱导HepG2细胞(野生型p53)凋亡,而Huh-7(突变型p53)和Hep3B细胞(缺失型p53)则凋亡较少.荧光素酶检测显示,HepG2细胞对TGF-β1反应较强,而Huh-7和Hep3B细胞其荧光素酶的表达较低.结论:HepG2细胞系比Huh-7和Hep3B细胞系更易发生TGF-β1诱导的凋亡,Smad4也许是TGF-β1信号转导途径的主要调控因子之一.     

知母皂苷B对大鼠海马注射β-AP(25～35)致tau蛋白磷酸化的影响

目的 观察大鼠双侧海马注射β淀粉样肽[β-AP（25～35）]后，海马内p53、Wnt途径抑制剂DKK和磷酸化tau蛋白表达变化，并用此动物模型观察知母皂苷B的作用。方法 用RT-PCR法检测p53和DKK mRNA表达的变化，用免疫组化法检测磷酸化的tau蛋白。结果 AD模型组海马内神经元的tau蛋白过度磷酸化，而p53和DKK mRNA的表达与假手术对照组相比也显著增多：而知母皂苷B给药治疗组均可使这种现象得到明显改善。结论 知母皂苷B可通过抑制β—AP引起的p53及其后续的DKK的表达增加而有效改善AD大鼠脑内神经元的tau蛋白过度磷酸化。