西伯利亚土拨鼠自然感染病毒性肝炎肝脏病理观察

近年来,国内外相继在土拨鼠身上发现与人类乙型肝炎病毒(HBV)相似的病毒—土拨鼠肝炎病毒(WHV)此病毒属于一种内源性DNA多聚酶和含有大单股缺口的环状基因组的小DNA病毒,并与HBV抗原间呈交叉反应。因WHV不同于地松鼠和鸭乙型肝炎病毒,可持续感染土拨鼠发生慢性活动性肝炎和肝癌。我们结合血清学从病理组织学方面对土拨鼠肝炎进行研究。     

荧光定量PCR检测土拨鼠肝炎病毒核酸方法的建立

目的建立土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)核酸的荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法,应用于土拨鼠肝炎病毒模型的研究。方法分别根据土拨鼠肝炎病毒核心抗原(WHcAg)和表面抗原(WHsAg)的DNA序列设计13对扩增引物,从中筛选无非特异性扩增及引物二聚体且灵敏度高的引物,用于土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测。建立感染土拨鼠肝炎病毒的土拨鼠血清中WHV核酸的Real-timePCR检测方法。结果根据WHsAg基因的5’端设计的一对引物WHVSF1与WHVSR1,检测灵敏度可达1×101拷贝/μL,病毒拷贝数与Real-time PCR Ct值的标准曲线的R2值为0.997,且电泳未见明显非特异性条带及引物二聚体。结论建立了土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测方法,该方法为进一步研究土拨鼠肝炎病毒模型奠定了基础。     

RNA干扰抑制土拨鼠肝炎病毒X基因表达

目的:研究土拨鼠肝炎病毒(WHV)序列特异性siRNA对WHV X基因表达的抑制作用。方法:以WHV全长质粒为模板PCR扩增WHV X基因,克隆到pXF3H载体构建WHX-HA融合蛋白真核表达质粒(pXF3H-WHx);合成siRNA的模板序列,克隆到siRNA表达质粒psiRNA构建shRNA表达质粒(psiWx1、psiWx2);质粒pXF3H-WHx与psiWx1、psiWx2共转染Hela细胞,Western blot检测WHV X蛋白的表达。结果:Hela细胞中WHVX蛋白的表达受siRNA的抑制,psiWx1表达的siRNA抑制90%以上的X蛋白表达,并呈剂量依赖性,但是WHV X基因靶位点中2个突变的核苷酸可使这种干扰作用消失。结论:质粒表达的siRNA序列特异性抑制WHV X蛋白的表达。     

siRNA联合恩替卡韦在原代肝细胞中抑制土拨鼠肝炎病毒基因表达和复制

目的:在原代土拨鼠肝细胞中研究siRNA联合恩替卡韦(ETV)对土拨鼠肝炎病毒(WHV)基因表达和复制的抑制作用。方法:分别设计合成针对WHV PreS1、S、C、X基因的4种siRNA,转染原代土拨鼠肝细胞,同时给予ETV处理,Southern和Northern印迹检测WHV病毒复制中间体和mRNA水平,realtime PCR检测细胞上清中WHV DNA。结果:4种siRNA对WHV基因表达和复制的作用显示出不同的动力学特征,siWHs和siWHx的抑制作用最强,而siWHpreS1和siWHc的活性相对较弱。在原代肝细胞中,首先出现的是WHV mRNA水平的降低,然后是WHV复制中间体水平的降低,siWHs和siWHx最高抑制60%～70%的mRNA和病毒复制中间体,同时抑制细胞上清中90%的WHV DNA。另外siWHx与ETV联合应用不仅可以增强抗病毒作用,而且可以防止ETV停药反跳。结论:siRNA在WHV自然感染的原代肝细胞中可以有效抑制病毒的基因表达和复制,因而siRNA有可能开发成为新的抗HBV药物,尤其适用于核苷(酸)类似物的联合应用。     

土拨鼠肝炎病毒转基因小鼠模型的建立

目的:建立土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck hepatitis virus,WHV)转基因小鼠模型,以用于嗜肝病毒感染的发病机制研究。方法:采用微注射技术将1.3-倍WHV基因[野生型和WHV S抗原(WHV surface antigen,WHsAg)缺陷型]注射入C57BL/6xC3H小鼠的胚胎,然后与C57BL/6小鼠回交,建立WHV转基因小鼠。肝内WHV DNA复制和mRNA表达水平分别采用Southern杂交和real-time RT-PCR检测,血清中WHV病毒载量采用real-time PCR检测,HE染色进行肝组织病理学检测,ELISA检测血清中WHV核心抗体,流式细胞仪检测WHV核心抗原(WHV core antigen,WHcAg)特异性细胞毒性T淋巴细胞。结果:成功建立野生型WHV转基因小鼠和WHsAg缺陷型转基因小鼠。WHsAg缺陷型小鼠肝内WHV复制水平显著高于野生型小鼠,野生型WHV转基因小鼠血清WHV载量104¹08copies/mL。而且雄性小鼠肝内和血清WHV复制水平显著高于雌性小鼠。16周龄以上的WHV转基因小鼠约半数血清可检测出高滴度的WHV核心抗体。而且少数转基因小鼠可以检测到WHcAg特异性细胞毒性T淋巴细胞。结论:这种新建的WHV转基因小鼠肝内可检测到病毒复制和mRNA表达,血清有高水平的WHV病毒载量,可以用于嗜肝病毒感染的发病机制、抗病毒治疗等研究。     

美国乙型肝炎实验动物土拨鼠在中国繁殖成功(简报)

土拨鼠作为乙型肝炎动物模型具的突出的价值。除人乙型肝炎病毒外,土拨鼠肝炎病毒(WHV)是唯一可整合入其宿主细胞DNA的趋肝病毒,并可形成慢性感染、肝细胞癌和Delta联合感染。这些特性为黑猩猩等所不及。目前迫切需要阐明的乙型肝炎慢性化和免疫耐受机理,整合病毒基因组在肝细胞癌发生过程中的作用,Delta联合感染和超感染的     

土拨鼠肝炎与肝细胞癌

土拨鼠肝炎的病因是病毒感染,而土拨鼠肝炎病毒感染与土拨鼠肝细胞癌的发生有密切关系;土拨鼠肝炎病毒与人乙型肝炎病毒有交叉免疫反应;其超微结构与人乙型肝炎病毒相似。     

抗土拨鼠肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的制备、性质鉴定及初步应用

为研制出能与土拨鼠肝炎病毒核心蛋白（WHc）结合的特异单克隆抗体，使之能特异性地对土拨鼠肝炎病毒（WHV）进行检测。并应用于相关肝炎病毒的筛查。以原核表达的土拨鼠肝炎病毒重组核心蛋白（WHc1～149氨基酸）免疫BALB／c小鼠，常规杂交瘤技术进行细胞融合，有限稀释法克隆化，间接酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫组织化学（IHC）筛选、鉴定。     

黄鼠携带HV的研究初报

近年来在对乙肝的防治研究中,国外相继发现了一些与HBV相似的动物病毒,有土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck he-patitis Virus),地松鼠肝炎病毒(Grou-nd hepatitis Virus),鸭肝炎病毒(Du-ck hepatitis Virus)。并把这一类病毒以HBV为代表组成一个新的病毒科。称之为嗜肝DNA病毒科(HepadnaViridae)。国内亦已证实青海的喜马拉雅亚种土拨鼠(Marmota himaliyana)和内蒙古的西伯利亚种土拨鼠(Marmota Cibirca)携带有WHV。     

DNA疫苗诱导的免疫应答控制土拨鼠肝炎病毒复制

目的:研究DNA疫苗在嗜肝病毒慢性感染的个体诱导产生的细胞和体液免疫应答水平,及其对嗜肝病毒复制的抑制作用,探索打破病毒特异性免疫耐受的新途径。方法:利用土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)转基因小鼠模型,采用WHV核心抗原(WHV core antigen,WHc Ag)的真核表达质粒(p WHc Im和p CGWHc)作为DNA疫苗免疫3次后,分别采用流式细胞仪检测WHc Ag特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxical T cells,CTL),ELISA检测血清抗-WHc抗体水平,realtime PCR检测血清WHV DNA载量。结果:DNA疫苗在转基因小鼠体内诱导高水平的抗-WHc-Ig G2a抗体和WHc Ag特异性的CTL应答,而且DNA疫苗介导的免疫应答显著抑制WHV复制。与对照组相比,DNA疫苗处理使WHV转基因小鼠血清病毒载量下降2~3个Log值,其中p CGWHc免疫组的6只小鼠中3只血清DNA降至检测低限以下。结论:DNA疫苗可以在转基因小鼠体内诱导产生强烈的细胞和体液免疫应答,并控制WHV复制,提示DNA疫苗在打破嗜肝病毒特异性免疫耐受中具有重要作用,有可能开发成为乙型肝炎治疗的新方法。     

CpG联合恩替卡韦在体内诱导早期病毒学应答抑制土拨鼠肝炎病毒的复制

目的:研究CpG寡脱氧核苷酸对嗜肝病毒复制和基因表达的抑制作用及其作用机制,探索抗病毒治疗的新方法。方法:利用土拨鼠肝炎模型研究P类CpG的免疫刺激和抗病毒活性。土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)慢性感染的土拨鼠12只分为4组,分别接受CpG皮下注射(4 mg/kg,每周1次,共16周)、恩替卡韦(entecavir,ETV)饲养(0.5 mg·kg-1·d-1,共12周)、CpG联合ETV治疗,或不处理作为对照。在处理后的第1、2、3天,1、2、3、4、8、12、16、20、24和28周,采用定量PCR检测血清WHV载量和PBMC内ISGs mRNA的水平,ELISA检测WHs Ag(WHV surface antigen)水平,生物活性分析血清IFN水平。结果:相比对照组和CpG或ETV单独治疗组,CpG联合ETV治疗显著抑制WHV的复制和表达,出现早期病毒学应答并强烈抑制血清WHs Ag抗原水平。CpG联合ETV治疗组的4只动物中有3只在治疗的13~17周后血清WHs Ag低于检测下限。另外,接受CpG治疗的大部分动物血清中检测到IFN、PBMC中Mx A mRNA显著上调(10~100倍)。结论:P类CpG在慢性WHV感染的土拨鼠体内诱导天然免疫,从而产生强烈的病毒抑制作用。通过优化方法达到长期持续的病毒抑制效果,将促进在HBV感染的个体开展类似的研究,从而开发成为乙型肝炎治疗的新方法。     

人类乙型肝炎病毒感染旱獭模型研究进展

旱獭肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)是继人类乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)之后发现的另一个嗜肝DNA病毒。旱獭慢性感染WHV可逐步发展重型肝炎和肝癌,与人类感染HBV发展过程极为相似。最初WHV病毒学和发病机制研究来自于捕获的、自然感染WHV的野生野旱獭,由于其饮食、寄生虫感染、环境毒性、WHV感染源和感染进程等背景资料,给研究带来障碍。目前,一些实验室已经在室内成功饲养、繁殖旱獭,实验动物化的旱獭在WHV和肝癌研究中显示出优势:可以给新生旱獭接种、感染WHV,培育慢性WHV旱獭携带者。实验研究已经发现WHV可导致肝癌,与流行病学和HBV是人类肝癌诱因的分子病毒学研究研究结果一致。慢性WHV旱獭携带者是人类HBV慢性感染的抗病毒治疗的临床前评估最有价值的动物模型,可以用于侯选抗病毒药物评估以及实验疫苗、免疫调节剂治疗和预防HBV感染性疾病的后遗症的安全性和有效性研究。本文综述了WHV分子病毒学特征、旱獭及其他动物自然感染嗜肝DNA病毒情况,以利于研究人类HBV。     

嗜肝DNA病毒分子生物学与肝细胞癌研究进展

嗜肝DNA病毒主要由人乙型肝炎病毒(HBV)、土拨鼠肝炎病毒(WHV)、地松鼠肝炎病毒(GSHV)以及鸭乙型肝炎病毒(DHBV)组成,可引起急性、慢性肝炎和肝细胞癌(HCC)。本文将对近二年来国外学者就嗜肝DNA病毒分子生物学与HCC关系的研究进展进行讨论。     

一月龄土拨鼠肝炎病毒感染模型的建立

目的建立土拨鼠慢性病毒性肝炎的动物模型。方法对一月龄的土拨鼠进行颈外静脉注射感染土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus,WHV）,使用两个剂量（高剂量：2.5×107 WID50;低剂量：5×106 WID50）感染,感染后在不同时间采用荧光定量PCR法测定血清中病毒DNA拷贝数,ELISA测定血清中WHsAg和WHcAb,并监测AST和ALT,肝脏活检HE染色观察病理变化,免疫组化检测WHsAg观察肝脏内病毒分布。结果感染后16周内,土拨鼠肝脏酶学AST和ALT水平均明显升高,土拨鼠血清内病毒载量在感染后第2周开始升高,16周达到高峰期,随后,低剂量组的病毒载量开始下降,而高剂量组的病毒载量仍接近106拷贝/ml。感染动物血清内可检测到WHsAg和WHcAb,肝脏病理切片显示小灶性肝细胞坏死伴炎细胞浸润及散在出血的急性肝炎症状,胞浆内可见WHsAg阳性分布。24周时,低剂量组土拨鼠血清内WHsAg和病毒DNA无法检出,提示其为急性自限性肝炎;高剂量组土拨鼠血清内依然可检测出WHsAg和病毒DNA,提示转为慢性感染。结论建立了急性病毒性肝炎转为慢性感染的土拨鼠模型,提示急性肝炎的病程发展除与土拨鼠感染年龄相关外,也与病毒感染剂量相关。     

鸭乙型肝炎病毒的组织培养及其在抗病毒药物研究中的应用(简报)

嗜肝病毒属包括四种病毒:人乙型肝炎病毒(HBV)、土拨鼠肝炎病毒(WHV)、地松鼠肝炎病毒(GSHV)和鸭乙型肝炎病毒(DHBV)。长期以来,这属病毒无法在体外培养,限制了对该病毒的深入研究。1986年.美国学者成功地用DHBV感染了原代的鸭肝细胞培养,并观察到DHBV在肝细胞中复制。根据本实验室的条件,本研究用胰蛋白酶加链霉蛋白酶或EDTA消化肝组织的方法。用RPMI-1640     

新生与成年土拨鼠肝组织中部分差异表达的基因比较分析

目的 新生土拨鼠感染土拨鼠肝炎病毒后,大部分发展为慢性肝炎,而成年土拨鼠感染后则多发生急性自限性肝炎[1]。本实验目的就是寻找其肝组织中可能导致这种预后差异的关键基因。 方法 采用全基因组表达谱芯片技术,对比新生与成年小鼠肝组织基因表达差异,选取目的基因,再通过多个物种序列比对,设计简并引物,在土拨鼠肝组织cDNA中扩增对应基因,测序,再次设计引物,进行实时荧光定量PCR。 结果 与新生土拨鼠相比,成年土拨鼠肝细胞中与钙离子重吸收相关基因DNM1（Dynamin 1）、DNM3（Dynamin 3）及Prkcc（Protein kinase C,gamma）表达率明显升高,分别上升2.65?.25倍,1.90?.34倍,2.94?.54倍。 结论 在钙离子重吸收通路中,以上三个在两组动物肝脏中表达差异最明显的基因,在新生组与成年组土拨鼠之间也有明显差异。此类基因造成肝细胞内钙离子浓度的差别,间接影响其中肝炎病毒的复制。这种表达差异很可能是导致两个年龄段动物感染土拨鼠肝炎病毒后转归不同的原因之一。     

土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒的构建、原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

目的构建土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒并进行原核表达、抗体制备。方法应用基因工程技术将编码截短型土拨鼠肝炎病毒核心蛋白（WHcAg1～149aa）的基因片段装入原核表达载体pQE60上,在JM109菌内进行诱导表达,使用切胶回收及Ni-NTA柱两种方法纯化目的蛋白。将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验、免疫组织化学及Western blot检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功地构建了含截短型土拨鼠肝炎病毒核心区基因的质粒并获得表达,经纯化得到了分子量约为16.5kD的重组核心蛋白,免疫家兔获得了高效价的特异性多克隆抗体,而且与HBcAg有交叉反应。结论获得的重组截短型土拨鼠肝炎病毒核心抗原（1～149aa）纯度高,免疫原性强。获得的兔抗-WHc效价高,特异性好,与HBcAg有交叉反应。     

RNAi通过PKR和TLR通路活化天然免疫

目的:研究特异性RNA干扰(RNA interference,RNAi)上调天然免疫的分子机制。方法:分别从土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck hepatitis virus,WHV)转基因小鼠和WHV慢性感染的土拨鼠分离原代肝细胞,转染针对WHV和小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),同时用特异性siRNA抑制剂和信号通路抑制剂,研究RNA活化蛋白激酶(RNA-activated protein kinase,PKR)、Toll样受体(toll-like receptor,TLR)3、7/8和视黄酸诱导基因Ⅰ(Retinoic acid-inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)/黑色素瘤分化相关基因5(Melanoma differentiation-associated gene-5,MDA5)等信号通路在RNAi上调天然免疫中的作用,Real-time RT PCR检测靶基因和MxA的mRNA水平,Western blot检测信号通路分子磷酸化PKR、核因子κB(Nuclear FactorκB,NF-κB)和干扰素调节因子(interferon regulator factor,IRF)3的蛋白水平。结果:针对WHV和GAPDH的RNAi介导的黏病毒抵抗蛋白A(myxovirus resistance A,MxA)上调可以被PKR抑制剂和内体酸化抑制剂所阻断,特异性RNAi可以诱导PKR磷酸化和NF-κB与IRF3的核内转位。结论:特异性RNAi介导的靶RNA降解产物可能通过PKR和TLR-3,-7/8通路活化天然免疫。     

非灵长类动物中乙型肝炎病毒样病毒的研究近况综述

近年发现土拔鼠(Wood Chuck)、地松鼠(Ground Squirrel)鸭,(Duck、黑尾草原犬鼠和树鼩都发现了与乙型肝炎病毒(HBV),似有亲缘关系的肝炎病毒。不少动物虽然未发现隐匿的 HBV,但发现抗—HBs 阳性,为寻找 HBV 感染的动物模型开辟了广阔的前景。一、非灵长类动物中 HBV 样病毒的性质1.土拔鼠肝炎病毒(WHV)WHV 病毒体为45nm、球状颗粒,它的核心直径为27nm,与 HBcAg 有交叉抗原反应。含 DNA 多聚酶的颗粒在氯     

HBV、HCV双重感染与原发性肝癌

<正>世界卫生组织肝癌预防会议指出,乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)与肝癌有密切的、特定的因果关系,两者相关率高达80％,因此认为HBV仅次于烟草是第二种已知的人类致癌物。随着HBV感染率的下降,丙型肝炎病毒(HCV)在慢性肝病及原发性肝癌中的伴随率逐渐升高。现就HBV、HCV双重感染致肝癌的相关性研究进展分述如下: