正常人肝细胞中HBV-PHSA受体基因表达的研究

作者根据乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ａｄｒ型ＰｒｅＳ２基因序列设计合成一对聚合酶链反应（ＰＣＲ）引物，经特异性试验后，用于扩增正常人肝细胞中多聚人白蛋白受体（ＰＨＳＡｒ）基因转录产物。结果：ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＮＡ－ＰＣＲ扩增结果均为阳性，而相应骨骼肌总ＲＮＡ扩增结果呈阴性，提示乙型肝炎病毒ＰｒｅＳ２区与ＰＨＳＡｒ基因外显子序列具有一定程度的同源性；同时表明ＰＨＳＡｒ基因在肝组织中处于表达状态，而对ＨＢＶ不敏感的组织如骨骼肌则不表达。该研究结果与其它ＨＢＶ－ＰＨＳＡｒ研究相比，进一步证实了ＰＨＳＡｒ在ＨＢＶ感染肝细胞的作用。     

反义硫代寡核苷酸抗乙肝病毒作用机理的探讨

为了探讨反义寡核苷酸（ＡＳＯＮ）进行抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因治疗的可行性及ＡＳＯＮ抗ＨＢＶ作用机理,设计合成了针对ＨＢＶ不同基因位点的ＡＳＯＮ〔ＰｒｅＳ２翻译起始位点、ＨＢＶ调节成份顺向重复序列（ＤＲ２）和增强子Ⅱ〕。以ＨｅｐＧ２·２·１５细胞为细胞模型,动态观察了这三种ＡＳＯＮ不同浓度不同时间的抗ＨＢＶ作用。结果表明：这三种ＡＳＯＮ对ＨＢｅＡｇ的抑制率分别为９１．１％、４４９％和５６４％,对ＨＢｓＡｇ的抑制率分别为６５７％、６０１％和５１５％,无关序列无明显抑制作用。应用反义寡核苷酸技术,为研制新一代抗ＨＢＶ基因治疗药物奠定了基础,探讨了特异性阻断ＨＢＶ基因表达的可能途径。ＡＳＯＮ抑制作用机理可能是ＡＳＯＮ作用于病毒逆转录和翻译水平甚至复制水平上     

抗人卵巢癌单克隆抗体COC183-B2重链可变区基因的体外扩增、克隆及序列分析

目的：分离抗人卵巢癌单克隆抗体ＣＯＣ１８３Ｂ２重链可变区（ＶＨ）基因并测定其序列。方法：用反转录ＰＣＲ扩增抗人卵巢癌单抗ＣＯＣ１８３Ｂ２ＶＨ基因，将其克隆入ＰＵＣ１９载体，重组子用Ｓａｎｇｅｒ’ｓ双脱氧链终止法测定序列，将序列与ＧｅｎｅＢａｎｋ及已发表的抗体序列比较。结果：ＶＨ基因全长３５４ｂｐ，属鼠免疫球蛋白重链混杂亚类（ｓｕｂｇｒｏｕｐｍｉｓｃｅｌａｎｅｏｕｓ），由种系基因的ＶＨ，Ｄｓｐ２．５及ＭＵＳＪＨ４重排而来。该ＶＨ基因序列已被ＧｅｎｅＢａｎｋ收录（ａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏＡＦ０４５０２３）。结论：该ＶＨ基因为抗人卵巢癌单抗ＣＯＣ１８３Ｂ２功能性重链可变区基因。     

乙型肝炎病毒相关性肝癌与p53基因变化的关系

目的：探讨与ＨＢＶ感染相关的肝癌其ｐ５３基因变化及意义，方法：收集１６例西安地区的肝癌及其旁肝组织，应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测了组织中ＨＢＶＤＮＡ的状态，免疫组化确定ＨＢＶ的ＨＢｓＡｇ，ＨＢｘＡｇ和肿瘤抑制基因Ｐ５３蛋白的分布，采用ＰＣＲ扩增后直接ＤＮＡ序列分析，检测了ｐ５３基因第５～８外显子的基因序列。结果：１６例中１３例ＨＢＶＤＮＡＳｏｕｔｈｅｒｎ杂交阳性，１０例癌组织和１３例癌旁组织ＨＢｘ     

同步检测183例血清乙肝病毒标志物,Pre—S2,pHSA—R,HBsAg—Ig …

为探讨乙肝病毒标志物、Ｐｒｅ－Ｓ２、ＰＨＳＡ－Ｒ、ＨＢｓＡｇ－ＩｇＭ及ＨＢＶ－ＤＮＡ之间的关系,对１８３例既往乙肝病毒标志物阳性的ＨＢＶ感染者,同步采用放免方法定量检测乙肝病毒标志物、Ｐｒｅ－Ｓ２、ＰＨＳａ－Ｒ、ＨＢｓＡｇ－ｉｇＭ,用ＰＣＲ方法检测ＨＢＶ－ＤＮＡ。结果显示,ＨＢＶ－ＤＮＡ、Ｐｒｅ－Ｓ２、ＰＨＳＡ－Ｒ、ＨＢｓＡｇ０ＩｇＭ在“大三阳”中检出率分别为８６．３６％、９６．９７％、９３．９４     

原发性肝癌中HBV X,S,Pre—S,C基因片段整合与ras,myc癌基因 …

用地高辛标记的ＨＢＶ基因组探针检测了６６例肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）中ＨＢＶ的存在状态，从中筛选出３２例仅有ＨＢＶ ＤＮＡ整合的ＨＣＣ作为研究对象，进一步检测了ＨＢＶ Ｘ基因、Ｓ基因、Ｐｒｅ－Ｓ、Ｃ基因ＤＮＡ片段的整合情况，并探讨了ＨＢＶ４种基因亚片段整合与ｒａｓ、ｍｙｃ癌基因表达的关系。结果显示，ＨＢＶ Ｘ、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ和Ｃ基因片段的整合率分别为８７．５％（２８／３２）、６２．５％（２０／３２）、     

HBV前S1蛋白的检测对乙肝患者的临床意义

ＨＢＶ的衣壳蛋白包括Ｓ ,和前Ｓ蛋白 ,后者又分为前Ｓ1(Ｐｒｅ -Ｓ1)和前Ｓ2 (Ｐｒｅ -Ｓ2 )蛋白 ,前Ｓ蛋白在ＨＢＶ附着和侵入细胞机制中起着重要作用[1] 。本文采用酶联免疫分析法和放射免疫分析法 ,对乙肝病人及ＨＢＶ携带者的血清进行Ｐｒｅ -Ｓ1蛋白和乙肝标志物的检测 ,分析在各种型别乙肝病人体内Ｐｒｅ -Ｓ1的存在情况 ,从而评价Ｐｒｅ -Ｓ1在ＨＢＶ感染过程中的作用。1　材料和方法1 1　病人来源　收集慢性ＨＢＶ携带者及慢性肝炎病人共 2 1 6例 ,其中ＨＢＶ携带者 (仅ＨＢｓＡｇ ) 4 5例 ;慢乙肝病人中大三阳病人(ＨＢｓＡｇ …     

HBV亚基因整合及其致癌性研究

探讨乙型肝炎病毒亚基因在肝细胞癌发生中的作用。方法 以ＢａｍＨ，Ｉ，ＢｇｌⅡ酶切３．２ｋｂ ＨＢＶ ＤＮＡ，回收其ＨＢｓ，ＨＢｘ，ＨＢｃ，ＰｒｅＳ亚基因片段，以地高辛甙元标记成探针。以ＨＢＶ探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析其存在状态，以ＨＢＶ亚基因探针Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交亚基因转录。     

原发性肝癌中 HBV X、S、Pre-S、C 基因片段整合与 ras、myc 癌基因表达的关系

用地高辛标记的ＨＢＶ基因组探针检测了６６例肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）中ＨＢＶ的存在状态，从中筛选出３２例仅有ＨＢＶＤＮＡ整合的ＨＣＣ作为研究对象，进一步检测了ＨＢＶＸ基因、Ｓ基因、Ｐｒｅ－Ｓ、Ｃ基因ＤＮＡ片段的整合情况，并探讨了ＨＢＶ４种基因亚片段整合与ｒａｓ、ｍｙｃ癌基因表达的关系。结果显示，ＨＢＶＸ、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ和Ｃ基因片段的整合率分别为８７．５％（２８／３２）、６２．５％（２０／３２）、６２．５％（２０／３２）和２５．０％（８／３２）。ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ在ＨＣＣ中的表达率分别为５０．０％（２０／４０）、８１．２％（２６／３２）。通过对ＨＣＣ中４种ＨＢＶ基因片段整合与ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ表达之间关系的研究，显示ｐ６２ｍｙｃ的表达与ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－Ｓ基因整合关系密切，ｐ２１ｒａｓ的表达则主要与ＨＢＶＸ基因整合有关（Ｐ＜０．０５）。提示ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－ＳＤＮＡ片段在宿主细胞染色体上的整合可能直接或通过其蛋白启动ｍｙｃ和（或）ｒａｓ癌基因的表达。     

正常人肝细胞中HBV—PHSA受体基因表达的研究

作者根据乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ａｄｒ型ＰｒｄＳ２基因序列设计合成一对聚合酶链反应（ＰＣＲ）引物，经特异性试验后，用于扩增正常人肝细胞中多聚人白蛋白受体（ＰＨＳＡｒ）基因转录产物。结果：ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＮＡ－ＰＣＲ扩增结果均为阳性，而相应骨骼肌总ＲＮＡ扩增结果呈阴性，提示乙型肝炎病毒ＰｒｅＳ２区与ＰＨＳＡｒ基因外显子序列具有一定程度的同源性；同时表明ＰＨＳＡｒ基因在肝组织中处于表达状态，而对ＨＢＶ不     

乙型肝炎病毒前S1、前S2抗原及e抗原与病毒DNA之间的相关分析

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）血清学标志物及HBV DNA之间的相关性。方法 应用定量PCR内标法检测HBV DNA,筛选出100例未经干扰素和核苷（酸）类似物治疗、丙氨酸氨基转移酶（ALT）／天冬氨酸氨基转移酶（AST）正常且HBV DNA阳性的慢性乙型肝炎患者。用微粒子酶免分析法、ELISA方法检测乙肝血清学标记物。筛选出40名健康人作为质控对照。结果 HBV DNA阳性乙肝患者：（1）乙肝e抗原（HBeAg）阳性率为75％;乙肝e抗体（抗-HBe）阳性率25％;乙肝前s1抗原（PreS1-Ag）阳性率为69％;乙肝前S2抗原（PreS2-Ag）阳性率为77％;（2）75例HBeAg阳性患者中PreS1-Ag阳性54例,PreS2-Ag阳性60例;25例抗-HBe阳性患者中PreS1-Ag阳性14例,PreS2-Ag阳性17例。PreS1-Ag、PreS2-Ag阳性率在两种情况下的差异均无统计学意义（均P〉0．05）;（3）HBeAg阳性时,PreS1-Ag、PreS2-Ag均阴性的阴性率（8％）低于抗-HBe阳性时的阴性率（28％）,差异有统计学意义（P〈0．05）;（4）PreS1-Ag与PreS2-Ag同为阳性、阴性的72例。结论 慢性乙型肝炎患者HBeAg、PreS1-Ag、PreS2-Ag阳性与HBV—DNA阳性的符合率较高。PreS1-Ag、PreS2-Ag阳性率与HBeAg的阳性无明确相关。PreS1-Ag、PreS2-Ag阴性率与抗-HBe阳性有较好的相关性。     

乙型肝炎病毒C基因多态性及其蛋白特性分析

目的:调查温州医学院大学生人群乙型肝炎病毒(HBV)C基因多态性及其HBc蛋白特性变化,为了解乙肝病毒核心抗原(HBcAg)变异提供理论依据。方法:采用HBV-C基因特异性引物对21份温州医学院大学生HBV携带者(血清学检测为大三阳患者)血清标本进行PCR扩增鉴定,并取19份PCR检测阳性产物直接测序;进一步用Vector NTI 8.0和DNA Star软件分析HBV-C基因多态性及HBc蛋白特性的变化。结果:21份标本中,HBV-C DNA阳性率达90.48%(19/21),与标准基因序列(Gen Bank X01587)比较,HBV-C基因同源性为93.3%～95.1%。HBV-C基因分别形成51种突变模式,其中一处由于核苷酸的改变,翻译的氨基酸也发生了相应的改变,此处氨基酸序列的第130处脯氨酸(Pro)突变为苏氨酸(Thr),其余标本均为同义突变;但突变处编码蛋白在亲水性、表面可及性及抗原性与标准株相比较无明显变化。结论:温州医学院大学生HBV携带者的HBV C基因具有多态性,但是由C基因决定的核心蛋白序列相对保守。     

HBV PreS1蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应

目的 利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵质粒,并检测其表达产物对cdc25酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用.方法 聚合酶链反应(PCR)扩增HBV PreS1基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵重组质粒pSos-PreS1.经测序正确后其将转化酵母菌cdc25感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无自激活作用.结果 序列测定证实重组诱饵质粒pSos-PreS1构建成功.重组质粒转化入酵母细胞后,经检测其表达产物对cdc25酵母细胞无毒性作用,对报告基因亦无自激活作用.结论 可以利用SRS来研究与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步研究乙型肝炎病毒的致病机制奠定了基础.

Abstract：

Objective To construct a yeast expression vector of hepatitis B virus (HBV) PreS1 gene using the Sos-recruitment system (SRS), and evaluate the effect of the expression product on the growth of the yeast cells and activation of the reporter gene. Methods The coding sequence of HBV preS1 was amplified by PCR and cloned into the yeast expression plasmid pSos. The recombinant bait plasmid pSos- PreS1 was verified by sequencing before transformation into competent yeast cells. The effects of the expression product on the yeast cell growth and activation of the reporter gene were evaluated. Results The yeast expression vector of HBV PreS1 gene was constructed sucessfully. The recombinant bait plasmid showed no toxic effect on yeast cdc25H cells without a self-activation of the reporter gene. Conclusion The SRS can be used to study the proteins interacting with HBV PreS1 protein and provides a means for obtaining insight into the pathogenic mechanism of HBV.     

重庆地区C/adrq+亚型 HBV流行株PreS/S、EnhII/CP/PreC标准参照序列的初步建立

目的：建立重庆地区基因型C／血清型adrq HBV流行株PreS/S、EnhII/CP/PreC基因标准参照序列，为HBV变异的研究奠定基础。方法：测定18例无症状携带者HBV的PreS/S、EnhII/CP/PreC序列，应用同源性分析和对齐比较等方法确定HBV亚型，并拟定基因型C／血清型adrq HBV的PreS/S、EnhII/CP/PreCC标准参照序列。结果：9株基因型B／血清型adw2、6株基因型C／血清型adrq ，3株基因型B／血清型aywl；建立的重庆地区HBV基因型C／血清型adrq HBV流行株PreS/S、EnhII/CP/PreC标准参照序列与东北华南地区同亚型的标准序列比较分别用13个、2个核苷酸差异，可引起4个、1个氨基酸差异。结论：初步建立了重庆地区基因型C／血清型adrq HBV流行株PreS/S、EnhII/CP/PreC基因标准照参照序列。     

HBVPreS2反义寡核苷酸对HepG 2.2.15细胞系HLA-I类抗原表达及生物活性的影响

目的 :观察针对乙型肝炎病毒 (HBV)PreS2 基因特异性反义寡核苷酸 (asON)对转基因细胞HepG2 .2 .15表面的人类白细胞I类抗原 (HLA I)基因表达的影响。方法 :设计合成互补于HBVPreS2 翻译起始区的反义寡核苷酸即序列I ,并设非互补序列作对照即序列II ,免疫细胞化学染色观察asON对HepG2 .2 .15表面表达的HLA I类抗原的影响 ,用ELISA法动态检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg的变化 ,放射免疫测定法检测asON对宿主细胞自身分泌蛋白 血清铁蛋白的影响。结果 :HepG2 .2 .15细胞表面HLA I类抗原表达降低 ,用药组和对照组相比有统计学意义 (P <0 .0 5 )。asON能够抑制HBV表达HBsAg和HBeAg ,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为 6 6 %和 91% ,而序列II对HBsAg和HBeAg的抑制率均为 11%。asON对宿主细胞自身分泌蛋白无影响 ,即对宿主细胞无毒性作用。结论 :asON以序列特异性方式抑制HBV基因表达而对宿主细胞无毒性作用 ,HLA I类抗原表达降低 ,这对减轻过度炎症反应 ,阻止慢性肝炎至重症肝炎的发生具有重要意义     

重庆地区HBV流行株PreS/S、EnhII/CP/PreC 基因标准参照序列的初步建立

目的：建立重庆地区HBV流行株PreS／S、EnhⅡ/CP／PreC基因标准参照序列，为HBV变异的研究莫定基础：方法：测定15例无症状携带HBV的PreS／S、EnhⅡ/CP／PreC序列，应用同源性分析和对齐比较等方法确定基因型／血清型，并拟定标准参照序列。结果：9株基因型B／血清型adw2、3株基因型B／血清型aywl、3株基因型C／血清型adrq ；建立的重庆地区HBV流行株(基因型B／血清型adw2)PreS／S、EnhⅡ/CP／PreC标准参照序列与华东华南地区同亚型的标准参照序列比较分别有6个、1个核苷酸差异。结论：初步建立了重庆地区HBV流行株PreS／S、EnhⅡCP／PreC基因标准参照序列。     

乙肝系列血清学标志和HBV DNA定量分析

目的 :探讨乙型肝炎病毒血清学指标的表现模式与HBVDNA之间的内在联系。方法 :949例在本院就诊有诊断不同的病人血清标本 ,用ELISA法检测 949例病人血清标本的各血清免疫学标志 ,用荧光定量PCR法实时定量检测HBVDNA。结果 :HBeAg阳性的标本HBVDNA全部呈阳性 ,阳性率达 1 0 0 % ,并且HBVDNA载量平均值大于 1 0 7拷贝 /ml。HBsAg、抗 HBe、抗 HBc阳性的模式中HBVDNA阳性率高达 84.1 % ,平均拷贝数在 1 0 6 ～ 1 0 7/ml之间。有 61例检测不到e系统 ,但有 59例HBVDNA呈阳性 ,平均拷贝数也较高。HB sAg阴性而其他抗体阳性的HBVDNA阳性率达 9.7% ,平均拷贝数较低 ,在 1 0 4 /ml左右。ELISA法全阴的HBVDNA阳性率为 4 .2 % ,平均拷贝数为 1 0 4 /ml。抗 HBc IgM阳性者 ,HBVDNA阳性率为 98.7%。前S1 蛋白阳性者 ,HBVDNA阳性率为 93 .8%。结论 :尽管HBeAg、抗 HBc IgM、前S1 蛋白 (PreS1 )等血清学标志是乙肝病毒复制的良好指标 ,但不能代替HBVDNA的定量测定 ,只有HBVDNA才是乙型病毒性肝炎复制和传染性的直接病原学依据。这种实时定量检测的荧光定量PCR技术可以检测HBV的真实感染和复制情况 ,它和ELISA法检测的血清学指标相结合 ,具有临床价值     

基于基因免疫的抗HBV M蛋白单克隆抗体的制

目的 以基因免疫制备抗乙型肝炎病毒M蛋白的单克隆抗体。方法 构建表达M蛋白的重组质粒pcDNA3-PreS2／S，免疫雌性BALB／c小鼠，以杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果 目的基因片段PreS2／S(875bp)正确插入质粒pcDNA3，重组质粒转染细胞上清、基因注射肌肉、脾脏局部均可检测到M蛋白表达。免疫小鼠后以杂交瘤技术获得了一株分泌抗HBVM蛋白的杂交瘤细胞株2D3。结论 证实了基因免疫可用于制备抗乙型肝炎病毒M蛋白单克隆抗体。     

乙肝病毒PreS1抗原的临床应用

目的:评价检测乙肝病毒PreS1抗原的临床应用价值. 方法:将临床送检的1000份乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阳性的血清标本进行PreS1抗原检测,同时用FQ-PCR进行HBV-DNA测定. 结果:PreS1总阳性率为52.0%,HBV-DNA阳性率为50.8%,HBeAg阳性率为21.0%. PreS1总阳性率明显高于HBeAg阳性率. PreS1与HBV-DNA的总符合率为94.4%. 结论:PreS1抗原作为乙肝感染和复制的血清学指标敏感性高于HBeAg,对提示乙肝患者的病情发展和转归有重要临床意义. PreS1可以作为一项新的乙肝病毒复制的传染性指标.     

乙型肝炎病毒大蛋白（LHBs）检测的临床价值

目的探讨乙型肝炎病毒大蛋白（LHBs）诊断乙型肝炎的意义。方法采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测乙型肝炎病毒大蛋白（LHBs）、乙肝病毒前S1（PreS1）,采用荧光定量PCR方法检测HBV DNA。结果 HBeAg阳性样本中乙型肝炎病毒大蛋白与HBV DNA的检出无显著性差异（χ2=2.46,P〉0.05）;乙肝病毒前S1与HBV DNA的检出有显著性差异（χ2=17.34,P〈0.01）;乙型肝炎病毒大蛋白吸光度值（OD值）与HBV DNA拷贝数相关系数r=0.912,P〈0.05。在HBeAg阴性样本中LHBs的吸光度均值和阳性率均呈线性增加,Pre S1的吸光度均值以及阳性率与HBV DNA拷贝数均不相关。结论乙型肝炎病毒大蛋白（LHBs）与HBV DNA有良好正相关,与乙肝前S1（Pre S1）相比,LHBs可更好反映临床乙肝病毒复制水平。