应用BSP联合TA克隆测序检测胰腺癌中RASSF1A基因启动子区异常甲基化

目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用?方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联合TA克隆测序检测胰腺癌细胞株PANC-1及胰腺癌组织?癌旁组织及正常胰腺组织中RASSF1A启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine(5-aza-dC)处理PANC-1,观察处理前后甲基化率变化情况,逆转录PCR观察RASSF1A 的mRNA表达情况?结果:在PANC-1细胞中RASSF1A启动子的甲基化率平均为100.00%,在正常胰腺?癌旁及癌组织中平均分别为1.79%?93.75%和100.00%,与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P < 0.01),而癌旁及癌组织之间无明显差异(P > 0.05)?在PANC-1细胞?胰腺癌组织及癌旁组织中RASSF1A基因无表达,在正常胰腺组织中RASSF1A基因呈阳性表达;PANC-1细胞经5-aza-dC处理后,RASSF1A的甲基化率下降(88.89%,P < 0.05),mRNA表达无变化?结论:胰腺癌细胞株PANC-1及癌组织?癌旁组织RASSF1A基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1中RASSF1A基因的表达沉默?该基因异常甲基化有望成为胰腺癌的早期诊断指标和治疗靶点?     

胰腺癌细胞株SPARC基因启动子区甲基化状况的研究

目的检测6种胰腺癌细胞株中SPARC基因启动子区5’CpG岛甲基化状况。方法以ASPC、BX-PC3、CFPAC、PANC1、SW 1990、PaTu8988等胰腺癌细胞株及正常人胚肾细胞AD293标本为研究对象,采用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测细胞株SPARC基因启动子区5’CpG岛甲基化状况。结果6例胰腺癌细胞株中3例(ASPC、CFPAC-1、BxPC3)细胞株发生完全甲基化;3例(PANC-1、Patu8988、SW 1990)发生部分甲基化,正常人胚肾上皮细胞AD293未发生甲基化。结论SPARC基因启动子区5’CpG岛甲基化改变是胰腺癌SPARC基因的一种重要失活方式,SPARC基因启动子区的高甲基化是胰腺癌细胞区别于正常细胞的分子事件之一,可能在胰腺癌的发生、发展中起重要作用。检测SPARC基因高甲基化可能会成为一种新的诊断胰腺癌的肿瘤标志物。     

胰腺癌中人RUNT相关转录因子3基因启动子区甲基化及其临床意义

目的检测胰腺癌人RUNT相关转录因子3(RUNX3)基因启动子的甲基化情况并探讨其临床意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)检测56例胰腺癌组织及癌旁组织、14例正常胰腺组织、3株人胰腺癌细胞株(PANC1、CFPAC-1、SW1990)、1株正常肝细胞株(HL-7702)中RUNX3基因启动子区CpG岛甲基化状态。检测用甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-cdR)处理前后胰腺癌细胞株RUNX3 mRNA的表达。分析RUNX3异常甲基化与胰腺癌临床特征的关系。结果56例胰腺癌组织中,51.79%(29/56)存在RUNX3基因启动子区CpG岛的异常甲基化,癌旁胰腺组织有10.7%(6/56)存在异常甲基化,而正常胰腺组织中未检测到RUNX3基因异常甲基化。RUNX3基因异常甲基化与患者病理分化程度(r=0.314,P=0.018)、淋巴结转移(r=0.370,P=0.005)显著相关。在5-Aza-cdR处理前,胰腺癌细胞株PANC1、CFPAC-1、SW1990的RUNX3 mRNA无表达或低表达,经5-Aza-cdR处理后各胰腺癌细胞株RUNX3 mRNA恢复表达。结论胰腺癌组织及胰腺癌细胞株均存在RUNX3基因CpG岛异常甲基化;RUNX3启动子的高甲基化与其基因表达降低有关,与胰腺癌组织分化程度、淋巴结转移相关。     

人胰腺癌细胞株HHIP基因甲基化状态检测和分析

目的:探讨人胰腺癌细胞株HHIP表达与其甲基化的关系,为胰腺癌发生机制的研究提供新的信息。方法:以人胰腺癌细胞株 BxPC-3、CFPAC-1、PANC-1、AsPC-1和PaTu8988s为研究对象,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫细胞化学染色(S-P)法检测去甲基化制剂——DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR) 处理前后各胰腺癌细胞株HHIP mRNA/蛋白表达的变化,用甲基化特异性 PCR(MSP)结合测序检测HHIP基因CpG岛甲基化状态。结果:5-Aza-CdR处理前,胰腺癌细胞株BxPC-3、CFPAC-1、PANC-1、AsPC-1和PaTu8988s无HHIP mRNA/蛋白表达;经5-Aza-CdR处理后,HHIP mRNA/蛋白重新表达。MSP结合测序显示上述胰腺癌细胞株HHIP基因CpG岛存在高甲基化。结论:人胰腺癌细胞株HHIP表达抑制与其基因CpG岛高甲基化相关。HHIP 基因CpG岛高甲基化可能在胰腺癌的发生、发展中起一定作用。     

3种结肠癌细胞株中DLC-1基因的表达及其启动子区的甲基化状态研究

目的:研究候选抑癌基因DLC-1在结肠癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨结肠癌细胞株DLC-1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性.方法:采用RT-PCR技术分别检测DLC-1基因在人结肠癌细胞株CaCo-2、HT-29和LoVo中的表达水平;应用甲基化特异性PCR(MSP)方法和亚硫酸氢盐修饰DNA测序检测启动子区域甲基化状态;分别用0、5、10 μmol·L-1浓度的去甲基化药物5氮杂胞苷处理DLC-1基因启动子区域高甲基化状态细胞后,再检测DLC-1基因mRNA表达水平.结果:人结肠癌细胞株CaCo-2和LoVo中DLC-1 mRNA呈阳性表达,HT-29中的表达呈阴性表达;CaCo-2和LoVo细胞DLC-1基因启动子区域未发生甲基化,而HT-29出现启动子区高甲基化状态;经5氮杂胞苷药物干预后,HT-29结肠癌细胞的DLC-1基因表达明显增强.结论:结肠癌细胞株HT-29中DLC-1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关.     

3种胃癌细胞株中GSTP1基因表达及其启动子区甲基化状态的研究

目的研究候选基因GSTP1在胃癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨胃癌细胞株GSTP1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性。方法采用RT-PCR和Western blot技术分别检测GSTP1在人胃癌细胞株MGC803、BGC823和SGC7901中的mRNA和蛋白表达水平。甲基化特异性PCR(MSP)法检测启动子区域甲基化状态。分别用不同浓度的去甲基化药物5-氮杂胞苷处理GSTP1基因启动子区高甲基化状态细胞后,再检测GSTP1基因蛋白表达水平。结果人胃癌细胞株BGC823和SGC7901中GSTP1 mRNA和蛋白呈阳性表达,MGC803中mRNA和蛋白呈阴性表达;BGC823和SGC7901细胞GSTP1基因启动子区域未发生甲基化,而MGC803细胞启动子区呈高甲基化状态;经5-氮杂胞苷药物干预后,MGC803细胞的GSTP1蛋白表达明显增强。结论胃癌MGC803细胞株中GSTP1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关。     

启动子甲基化调控胰腺癌他扎罗汀诱导基因1表达的研究

目的 研究他扎罗汀诱导基因1(tazarotene-induced gene-1,TIG1)在胰腺癌中的表达情况及启动子在胰腺癌细胞中的甲基化状态。 方法 收集67组胰腺癌和对应癌旁组织,用SP法进行TIG1蛋白检查并分析TIG1在癌、癌旁组织的表达差异。培养胰腺癌细胞株PANC1、BxPC3和SW1990,提取细胞总DNA,甲基化修饰后亚硫酸盐测序PCR(BSP)分析启动子CpG岛甲基化状态;筛选细胞总RNA,用实时定量PCR(real-time PCR)依次测各细胞株、经5-杂氮-2-脱氧胞嘧啶(5-aza-dC)干预前后TIG1 mRNA的表达差异。 结果 TIG1在癌组织中的表达低于癌旁组织(P<0.05)。TIG1的表达与胰腺癌的大小、分期无相关性,但与部位存在相关性(P<0.05)。TIG1在BxPC3和SW1990细胞中存在高甲基化状态,分别为(92±2)%和(86±2)%,在PANC1细胞甲基化率为(40±2)%。TIG1甲基化的BxPC3和SW1990细胞经5-aza-dC处理后TIG1表达明显上调(P<0.05),而甲基化的PANC1细胞经同样处理后TIG1的表达变化不明显。 结论 癌组织中TIG1的表达显著低于癌旁组织。不同部位胰腺癌TIG1的表达存在差异。TIG1基因在BxPC3和SW1990胰腺癌细胞中的低表达与甲基化有关。TIG1基因甲基化可能是调控胰腺癌细胞TIG1表达的重要分子机制之一。      

白血病细胞雌激素受体多个启动子甲基化的实验研究

目的检测白血病细胞雌激素受体（estrogen receptors,ER）基因启动子区CpG岛甲基化状态情况,探讨雌激素受体基因多个启动子区包括ERα（ERα-A,-B and-C）和ERβ甲基化与其表达异常的联系。方法应用RT—PCR检测6种白血病细胞株以5′-杂氮-2-脱氧胞苷（5′-Aza-Dc）去甲基化前后ER基因表达活性并应用甲基化特异性PCR技术（methylation specific PCR,MSP）检测10例正常人白细胞和6种白血病细胞株以5′-Aza-Dc去甲基化前后ER基因甲基化状态。结果ER各启动子在白血病细胞株中均出现甲基化或半甲基化带,但只有ERα-A基因表达沉默而且在正常人白细胞中呈未甲基化状态,在以5′-Aza-Dc处理细胞株后ERα-A基因表达恢复。结论白血病细胞的雌激素受体基因启动子区存在高甲基化现象并导致其基因表达沉默,可能为白血病的致病机制分析提供了一个新的方向,提示ERα-A基因启动子CPG岛的甲基化有可能成为白血病的新的参考标记物。     

人胃癌细胞株CDX2基因表达与其启动子区甲基化的关系

目的:探讨人胃癌细胞株CDX2基因表达与其启动子区甲基化的关系.方法:不同浓度5-aza-CdR处理MKN45细胞株,甲基化特异性PCR(MSP)检测用药前后CDX2启动子甲基化状态;实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测CDX2和DNMT1 mRNA和蛋白表达.结果:MKN45细胞株CDX2基因启动子区域高甲基化,CDX2 mRNA表达极低,蛋白不表达;经3种浓度5-aza-CdR处理MKN45细胞72 h后,细胞中CDX2 mRNA和蛋白表达均出现上调,而DNMT1表达出现下调.结论:CDX2基因表达下调与其启动子CpG岛高甲基化有关,DNMT1可能参与该过程的调节.     

胃癌中IRX1的表达与启动子区甲基化的相关性

目的 探讨胃癌中同源盒基因IRX1的表达与启动子区甲基化修饰之间的关系.方法 生物信息学软件分析IRX1基因启动子区;RT-PCR检测胃癌细胞株及手术切除胃癌组织IRX1基因mRNA表达水平;MSP及BSP法检测启动子区甲基化状态;检测去甲基化试剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷的干预对胃癌细胞IRX1基因表达的逆转效应.结果 经生物信息学预测IRX1基因转录起始点上游启动子区富含CpG岛;胃癌细胞株及胃癌组织IRX1基因表达有不同程度下调;MSP及BSP检测显示所有胃癌细胞株启动子区呈高甲基化状态;经5-Aza-CdR处理的细胞株IRX1基因的表达有不同程度上调.结论 胃癌中IRX1基因的表达下调与启动子区甲基化修饰有一定关系,为探讨IRX1基因作为去甲基化治疗靶点的可能性提供了实验数据.     

DNA甲基化异常对mir-615-5p在胰腺癌细胞株PANC-1中表达影响

目的:描述胰腺癌细胞株中DNA异常高甲基化对ndRNA表达抑制所起的作用.观察DNA甲基转移酶抑制剂对miR-615-5p在胰腺癌细胞株PANC-1中甲基化状态和表达的影响.方法:甲基化芯片筛选出在胰腺癌细胞株PANC-1中存在异常甲基化的miRNA.采用去甲基化药物5-氮杂胞苷(5-aza-2-adeoxycyfid...     

S100A2在胰腺癌继发耐放射细胞株中的表达及其意义

目的观察S100A2与胰腺癌继发耐放射细胞株的相关性。方法检测胰腺癌细胞株及其继发耐放射株中S100A2基因及蛋白质的表达水平,以及应用去甲基化试剂5-氮杂-2-脱氧胞苷处理耐放射细胞株后的改变,并检测相关放射敏感性的改变。结果胰腺癌细胞株SW1990耐放射株与亲本株相比S100A2的基因、蛋白质水平均明显较低（2—3倍）,耐放射细胞株经5-氮杂-2-脱氧胞苷处理后S100A2的mRNA、蛋白质水平均较用药前明显升高（2—5倍）,且处理后的细胞株耐放射性明显降低。结论S100A2在胰腺癌继发耐放射细胞株中的低表达可能是引起其继发耐放射特性的机制之一。     

miR-431-5p通过调控AKT1抑制胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和促进凋亡研究

目的研究miR-431-5p对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响和潜在的分子机制。方法qRT-PCR检测人正常胰腺上皮细胞hTERT-HPNE和胰腺癌细胞CFPAC-1和PANC-1中miR-431-5p表达水平。转染miR-431-5p模拟物至胰腺癌CFPAC-1细胞中过表达miR-431-5p后,MTT法测定细胞增殖活性,Transwell检测细胞迁移和侵袭,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测细胞中Cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2、E-cadherin、MMP-2和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-431-5p与AKT1的调控关系。结果与hTERT-HPNE细胞相比,胰腺癌细胞PANC-1和CFPAC-1中miR-431-5p表达量降低（P < 0.05）。过表达miR-431-5p后,CFPAC-1细胞活性、迁移和侵袭细胞数降低,凋亡率升高,Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白表达水平降低,p21、Bax和E-cadherin蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义（P < 0.05~P < 0.01）。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-431-5p在CFPAC-1细胞中靶向负调控AKT1表达。同时过表达miR-431-5p和AKT1后,CFPAC-1细胞活性、迁移和侵袭细胞数升高,凋亡率降低,Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白表达水平升高,p21、Bax和E-cadherin蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义（P < 0.05）。结论miR-431-5p通过靶向抑制AKT1降低胰腺癌CFPAC-1细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并促进细胞凋亡,可能是胰腺癌的潜在分子治疗靶点。