杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

目的:构建杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SAHH,并检测其对酵母细胞的毒性和自激活作用。方法:应用RT-PCR扩增杜氏盐藻的SAHHcDNA,测序分析后与酵母双杂交诱饵载体pGBKT7连接,构建诱饵载体pGBKT7-SAHH。用PEG/LiAc法将诱饵载体转入AH109和Y187酵母中,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无毒性和自激活作用。结果:成功构建了诱饵载体pGBKT7-SAHH并成功转化到酵母细胞AH109和Y187中,表达的融合蛋白对宿主酵母细胞无毒性。在AH109和Y187酵母细胞中诱饵载体均未激活报告基因HIS3和ADE2,但是激活了报告基因MEL1。结论:诱饵载体pGBKT7-SAHH可用酵母双杂交方法筛选与SAHH相互作用的蛋白。     

Foxp3酵母双杂交诱饵表达载体的构建、鉴定和其毒性及自激活效应检测

目的利用酵母双杂交系统,构建人Foxp3酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其进行鉴定.方法获得正常人外周血 PBMC,抽提mRNA,通过巢式 RT-PCR 在人外周血PBMC中获得Foxp3基因片断,纯化后连接至 pMD18-T 载体,测序正确,EcoRⅠ、SalⅠ双酶切pMD18-T-Foxp3和酵母表达载体 pGBKT7,回收产物并连接,重组质粒命名为 pGBKT7-Foxp3,测序正确,用醋酸锂法将重组质粒转化酶母菌 AH109,在缺陷性培养基上观察pGBKT7-Foxp3 在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能.结果 RT-PCR 扩增出的DNA 片段约1 203 bp,大小正确,与pMD18-T载体连接,测序正确.构建的诱饵载体pGBKT7-Foxp3,测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确.pGBKT7-Foxp3转化酵母感受态AH109,在SD/-Trp 板上生长良好,在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落,在SD/-His/-Trp/X-α-Gal、SD/-Ade /-Trp/X-α-Gal平板上不能生长,说明AH109[pGBKT7-Foxp3]转化成功,对酵母菌株AH109不具有毒性且不具自主激活报告基因的功能.结论成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7-Foxp3,可作为酵母双杂合系统中的"诱饵", 为下一步利用酵母双杂交系统筛选Foxp3相互作用蛋白创造了条件.     

Peroxiredoxin Ⅱ酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活效应检测

目的:应用酵母双杂交体系,构建人peroxiredoxinⅡ(PrxⅡ)蛋白酵母双杂交诱饵载体,并检测该载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。方法:用PCR扩增PrxⅡ基因cDNA中编码完整开放阅读框的基因片段;将该基因片段与pGBKT7载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;用醋酸锂法(Li-Ac)将序列正确的重组质粒pGBKT7-PrxⅡ转化入AH109酵母菌株,在缺陷性培养基上观察pGBKT7-PrxⅡ在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和单倍体及二倍体自激活功能。结果:成功构建pGBKT7-PrxⅡ重组质粒。转化有重组质粒和pGBKT7空载体的酵母菌都能在SD/-Trp/X--αgal平板上长出粉红色菌落,在SD/-His/-Trp/X--αgal,SD/-Ade/-Trp/X--αgal平板上不能生长,两种酵母菌在SD/-Trp液体培养基中培养16 h后,菌液的OD600均值均为0.9,说明AH109[pGBKT7-PrxⅡ]转化成功,对酵母菌株AH109无毒性且不具自主激活报告基因的功能。结论:成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7-PrxⅡ,该载体可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”,该诱饵载体可应用于酵母双杂交系统3筛选PrxⅡ相互作用蛋白。     

用于筛选COPS3相互作用蛋白酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-COPS3的构建及鉴定

目的 用COPS3基因片段构建酵母双杂交GAL4系统的诱饵载体pGBKT7-COPS3，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。方法 运用RT-PCR技术从骨肉瘤细胞系SOSP-9607中扩增出COPS3基因片段，克隆入pUC19质粒，经测序正确后，插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中，将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果 成功获得COPS3基因片段，其表达蛋白对酵母菌AH109无毒性，对报告基因亦无激活作用。结论可以利用酵母双杂交GAL4系统来研究与COPS3相互作用蛋白。     

人HL-60细胞GRα-LBD诱饵表达载体的构建和鉴定

目的:构建糖皮质激素(Glueocorticoid,GC)受体α配体结合域(GRα-LBD)的诱饵表达载体,为小分子配体酵母三杂交系统的建立奠定基础.方法:RT-PCR扩增HL-60细胞的GR α-LBD,克隆入诱饵载体pGBKT7中,测序正确后,再把构建好的诱饵载体pGBKT7-GR α-LBD转化到酵母AH109细胞中,提取酵母蛋白,并用Western blot分析诱饵蛋白的表达情况.同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果:成功扩增了GRα-LBD,并成功亚克隆到pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母AH109细胞中,无毒性和自激活作用,Westrrn blot分析也证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白.结论:成功构建了GRα-LBD酵母诱饵表达载体,为建立小分子配体酵母三杂交系统奠定了基础.     

Survivin基因诱饵表达载体的构建和鉴定

目的 构建Survivin基因诱饵表达载体,为建立酵母双杂交系统筛选Survivin蛋白靶蛋白奠定基础.方法 从人K562细胞中提取总RNA作为模板,逆转录得到Survivin cDNA,通过特异引物扩增Survivin基因的ORF区,然后与诱饵表达载体pGBKT7连接,构建诱饵表达载体pGBKT7-Survivin,再把构建好的诱饵载体pGBKT7-Survivin转化到酵母AH109细胞中,并用Western blot分析诱饵蛋白的表达情况.同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果 成功扩增了Survivin基因的ORF区,并成功将其克隆到诱饵表达载体pGBKT7中,测序结果 正确.诱饵载体成功转化到酵母AH109细胞中,无毒性和自激活作用,Western blot分析证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白.结论 成功构建了Survivin基因的ORF区的酵母诱饵表达载体,为建立酵母双杂交系统筛选Survivin蛋白靶蛋白奠定基础.     

Bit1基因在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的:用Bit1基因片段构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法:运用RT-PCR技术从卵巢癌细胞系Caov-3中扩增出Bit1基因片段,克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果:成功获得Bit1基因片段,Bit1基因表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性,对报告基因亦无激活作用. 结论:可以利用酵母双杂交Gal4系统来研究与Bit1相互作用的蛋白.     

硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ诱饵质粒的构建和检测

目的 构建硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ(PrxⅡ)诱饵质粒,同时检测其在酵母菌内的表达和对酵母细胞的毒性.方法 提取人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞的RNA,利用RT-PCR获得其cDNA, PCR方法扩增PrxⅡ基因片段,纯化后以内切酶双酶切PrxⅡ和酵母表达载体pGBKT7,回收产物并连接,重组质粒命名为pGBKT7-PrxⅡ, 将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用.结果 构建的诱饵载体pGBKT7-PrxⅡ测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确.将pGBKT7-PrxⅡ成功转化入酵母感受态AH109,并证明PrxⅡ蛋白对酵母无毒性作用.结论 证实了PrxⅡ蛋白无酵母毒性,诱饵质粒pGBKT7-PrxⅡ可以用于酵母双杂交研究前列腺癌发病机制.     

酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-PML-V的构建、表达及鉴定

目的:构建早幼粒细胞白血病基因变异蛋白(Promyelocytie leukemia,PML-V)的诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system)筛选与PML-V相互作用的蛋白建立实验基础.方法:PCR扩增PML-V,克隆人诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将构建好的诱饵载体pGBKT7-PML-V转化到酵母细胞AH109中,并利用蛋白印迹法(Western Blotting)分析诱饵蛋白的表达情况.同时检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用.结果:成功扩增了PML-V基因片断,并克隆人pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性、渗漏和自激活作用,Western Blotting分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白.结论:成功构建了PML-V结合域的酵母诱饵表达载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础.     

乙型肝炎消毒前S区不同片段在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的 用含乙型肝炎病毒（HBV）前S区不同大小的cDNA片段构建酵母双杂交诱饵载体，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。方法 PCR扩增含HVB前S区不同大小的cDNA片段，分别克隆入pUC19质粒，经测序正确后，再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。将重组质粒导入酵母菌AH109。检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果 成功获得含HBV前S区不同大小的cDNA片段，HBV前S区不同片段所表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性，但是对报告基因均有激活作用。结论 不能利用酵母双杂交Ga14系统3来研究与HBV前S区相互作用的蛋白；证实了HBV前S区不同片段所表达的蛋白的自激活功能，为进一步研究乙型肝炎病毒致病机制打下了基础。     

“心病”循“因”

患者女, 31岁,来自黑龙江,因心慌、胸闷、憋气半个月,来心内科门诊。进入诊室时,有两位 50多岁的妇女陪同,均面有愠色。当我请患者详说病史时,有一位妇女说:“挂了那么多科的号,看了那么多医生,做了那么多检查,吃了那么多药,什么事也不管。”从她那愤愤不平的态度中,我已感     

“直”与“真”的思考

《小儿药证直诀》一书为我国现存第一部儿科专著,作者对书名中"直"怀有疑问,思考后提出三个假设。通过查阅文献得出结论,书名"真"因避讳制度改为"直"的可能性大。     

"一个目标"和"三个改进"--关于提高德育课教学效果的思考

德育课作为学校对学生进行德育的专设课程，有着不同于一般文化课程教学的特殊规律和方法．在教学内容已作系统规定的情况下，教学效果的好坏，往往取决于对这些规律和方法的运用。笔者以为，提高德育课的教学效果，应着力于树立“一个目标”和在“三个改进”上下功夫。     

从"两个凡是"到"两个突破"

从"两个凡是"到"两个突破",中国共产党把马克思主义基本原理同中国实际相结合,形成了邓小平理论、"三个代表"重要思想和科学发展观三大理论创新成果.三大理论创新成果都是解放思想、实事求是、与时俱进的结果.创新性是它们共同的真谛.应随着时代、形势和实践的发展,坚持思维方式、理论的创新和实践的创新,不断地把社会主义事业和马克思主义理论推向前进.