人乳头瘤病毒致癌特性及其E6和E7蛋白致癌机制的研究进展

人乳头瘤病毒（HPV）是一种感染人的乳头瘤病毒科病毒,主要感染上皮细胞,其高危型别（主要是16和18型）可引起恶性肿瘤。高危型HPV感染上皮细胞后,其DNA能整合入细胞基因组,并由于其E2基因表达障碍不能有效抑制E6、E7基因转录而持续高表达E6和E7 2种癌蛋白。E6和E7蛋白可分别抑制P53蛋白和pRb蛋白的作用而使细胞周期失控,在细胞基因组受到损伤时细胞周期仍然向前进展;E6蛋白能通过影响多种凋亡调节蛋白或因子的表达而抑制细胞凋亡;E6蛋白和E7蛋白能协同作用上调端粒酶的表达而使细胞永生化;以上机制最终导致受感染细胞发生恶性转化或癌变。本文对HPV的致癌特性及其所表达的E6蛋白和E7蛋白扰乱细胞周期、抑制细胞凋亡并活化端粒酶使细胞永生化的致癌机制的研究进展进行了综述。     

HPV致宫颈癌机制研究进展

人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）是一类无包膜的具有嗜上皮特性的双链DNA病毒,由核酸及衣壳蛋白构成,其基因组可分为早期编码区（E区）、晚期编码区（L区）和长控制区（LCR）,研究表明高危型HPV的持续感染与宫颈癌的发生密切相关,当HPV病毒感染机体后,其基因组可随机整合到宿主细胞DNA中,随后沉默E2基因的表达,削弱E2蛋白对E6、E7基因的抑制,使E6、E7蛋白过表达,辅以E5蛋白的表达,促使感染细胞永生化甚至癌变。因此研究HPV的病毒结构及其致病机制对防治HPV感染及预防HPV相关恶性肿瘤,尤其是宫颈癌的发生、发展尤为重要。本文拟就HPV的病毒结构、致病机制研究进展进行综述。     

共表达HPV16L1、L2、E67蛋白的重组非复制型痘苗病毒的构建

目的：构建共表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1、L2、E67蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法：以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术筛选共表达HPV16L1、L2、E67蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果：该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1、L2、E6、E7基因插人;经Western blot检测,重组病毒能稳定表达HPV16L1、L2、E67蛋白。结论：非复制型重组痘苗病毒NTVJE67CKL IL2可作为预防和治疗HPV16相关肿瘤及其癌前病变的候选疫苗。     

表达HPV16 L1、L2E7蛋白的非复制重组痘苗病毒的构建和鉴定

目的:构建防治宫颈癌的表达人乳头瘤病毒16型、HPV16)L1、L2E7蛋白的非复制重组痘苗病毒疫苗株.方法:以痘苗病毒为载体,利用同源重组技术筛选共表达HPV16 L1、L2E7蛋白的重组痘苗病毒,用PCR和Western-blot技术进行鉴定.结果:该病毒在鸡胚成纤维细胞(CEF)中连续传代15代,经PCR检测证实病毒基因组中有HPV16 L1、L2E7目的基因插入,Western-blot检测证实病毒可以稳定表达L1、L2E7蛋白.结论:构建的病毒NTVJL1L2E7可以在真核细胞中表达HPV16 L1、L2E7蛋白,可以作为治疗和预防HPV16相关疾病的候选疫苗.     

表没食子儿茶素没食子酸酯对HPV11早期基因E6、E7mRNA表达的影响

目的 利用人工构建的含人乳头瘤病毒(HPV)11型基因组的HaCaT细胞(简称为HPV11.HaCaT细胞),研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对该细胞生长的抑制作用,以及受试物对HPV11早期基因E6和E7 mRNA表达的影响。方法 在HaCaT及HPV11.HaCaT细胞培养基中添加不同浓度的EGCG后,应用MTT比色法检测受试物对细胞生长增殖的影响;用相对荧光定量PCR法检测HPV11.HaCaT细胞中HPV11 E6、E7 mRNA表达的改变。结果 EGCG能抑制HaCaT和HPV11.HaCaT细胞的生长,不同浓度EGCG作用下,细胞生存率为52%~95%、64%~90%,呈浓度和时间依赖趋势。EGCG作用于细胞12h和24h后,HPV11.HaCaT细胞中HPV11 E6、E7基因的mRNA表达水平明显下降(P<0.05)。结论 EGCG在体外能抑制含HPV11基因组的HaCaT细胞生长,并能抑制HPV11功能基因E6、E7表达。     

人乳头瘤病毒与宫颈癌关系研究进展

人乳头瘤病毒 (HPV)属乳多空病毒科的乳头瘤病毒属 ,球形无包膜 ,毒粒直径 45～ 5 5nm ,基因组呈双链状DNA分子 ,具有高度宿主细胞特异性。HPV根据核酸杂交分型 ,目前已鉴定多达 10 0多种型别。女性生殖道尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤样病变 (CIN)及宫颈癌等均与HPV感染有关。在良性病变中HPV -6及 11型感染多见 ,在恶性病变及外阴癌中则以HPV -16,18,3 1,3 5型多见 ,但以 16,18两型最为重要。1　HPV基因组结构与功能1 1　HPV基因组分为 3个区段　①早期区 (E) :含 8个开放读码框架 (ORF) ,编码病毒蛋白依次为 :E6,E7,E1,(E8) ,E2…     

HPV58型E7基因重组痘苗疫苗免疫保护作用的实验研究

目的制备含人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗,并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果。方法利用PCR方法扩增HPV58E7DNA片段,在消除其转化活性的基础上,构建表达HPV58E7的重组痘苗病毒疫苗并免疫小鼠,观察该疫苗对E7阳性肿瘤细胞生长的抑制作用,体外诱导、测定细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性。结果经定点突变的HPV58E7基因转化活性显著降低,用突变的E7基因构建的重组痘苗病毒免疫小鼠后,能抑制E7阳性肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期;免疫小鼠脾淋巴细胞体外可诱导产生针对E7阳性肿瘤的CTL细胞。结论在消除转化活性的基础上,HPV58E7可用于治疗与HPV58感染有关的肿瘤。     

干扰素诱导蛋白IFI16与HPV16E6、E7蛋白相互作用的研究

目的：研究人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)16型E6、E7蛋白与干扰素诱导蛋白IF116的相互作用，初步揭示IF116拮抗HPV16E6、E7致瘤活性的分子机制。方法：(1)体外GST阻滞分析：克隆、表达及纯化GST-HPV16E6和GST-HPV16E7融合蛋白，将含有IF116蛋白的EB病毒阴性伯基特淋巴瘤(BJAB)细胞提取物与上述纯化蛋白孵育，通过Western Blotting分析蛋白质的体外相互作用；(2)免疫共沉淀分析：构建表达His-HPV16E6蛋白的真核表达载体，将表达有IF116和His-HPV16E6蛋白的293T细胞裂解物与抗His抗体孵育，用IF116抗体检测共沉淀蛋白复合物中IF116蛋白的存在；将表达有IF116和HPV16E7蛋白的CaSki和SiHa细胞裂解物与HPV16E7抗体孵育，检测共沉淀蛋白复合物中E7与IF116是否结合。结果：成功构建了原核表达质粒pGEX-4T／HPVl6E6及pGEX-4T／HPV16E7，并表达、纯化获得GST-HPV16E6及GST-HPV16E7融合蛋白。体外GST阻滞分析结果表明，用IFll6单抗做WesternBlotting分析可检测到复合物中IF116蛋白，表明GST-HPV16E6和GST-HPV16E7均可与IF116蛋白结合。免疫共沉淀分析进一步证实，共沉淀蛋白复合物中也可检测到IF116蛋白，证明在细胞中HPV16E6和E7蛋白也能与IF116蛋白结合。结论：无论在体外还是在细胞中，抑瘤因子IFll6蛋白均能特异性地结合HPVl6E6和E7蛋白。为进一步揭示IF116拮抗HPV主要癌蛋白E6、E7的分子机制奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型E6蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的人乳头瘤病毒16型早期蛋白6真核表达载体pcDNA3．1（-），E6，为研究HPV16 E6蛋白在细胞永生化作用中的机制奠定实验基础。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增E6基因。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后，亚克隆至pcDNA3．1（-）真核表达载体中；阳性克隆经双酶切鉴定后转染RAW264．7巨噬细胞，Western blotting鉴定其在RAW264，7细胞中的表达。结果重组载体经酶切、PCR及测序证明插入片断序列正确无误，转染RAW264．7细胞后可在细胞中表达HPV16E6蛋白。结论成功构建的HPV16E6真核表达载体pcDNA3，1（-）／E6能在RAW264．7细胞中表达E6蛋白。     

HPV58型E7基因重组痘苗疫苗保护作用的实验研究

目的：制备含人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗，并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果。方法：利用PCR方法扩增HPV58 E7 DNA片段，在消除其转化活性的基础上，构建表达HPV58 E7的重组痘苗病毒疫苗并免疫小鼠，观察该疫苗对E7阳性肿瘤细胞生长的抑制作用，体外诱导、测定细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）活性。结果：经定点突变的HPV58 E7基因转化活性显著降低，用突变的E7基因构建的重组痘苗病毒免疫小鼠后，能抑制E7阳性肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期；免疫小鼠脾淋巴细胞体外可诱导产生针对E7阳性肿瘤的CTL细胞。结论：在消除转化活性的基础上，HPV58E7可用于治疗与HPV58感染有关的肿瘤。     

高危型HPV在泌尿生殖系统肿瘤研究中的进展

人乳头瘤病毒(HPV)是一种嗜鳞状上皮细胞的病毒,高危型HPV的基因产物E6、E7具有细胞转化功能;E6通过使p53蛋白大量表达,并与野生型p53结合,使后者丧失修复损伤DNA的功能,导致肿瘤的发生。通过研究高危型HPV与宫颈癌、膀胱癌、阴茎癌、子宫内膜癌等泌尿生殖系统肿瘤的相关性,可以为肿瘤的诊断、治疗、预测提供理论依据。     

宫颈癌组织中HPV16 E6、E7蛋白水平与患者临床病理特征及预后的关系

目的 探究宫颈癌组织中16型人乳头瘤病毒E6蛋白（human papilloma virus type 16 E6 protein,HPV16 E6）、16型人乳头瘤病毒E7蛋白（human papilloma virus type 16 E6 protein,HPV16 E7）水平与患者临床病理特征及预后的关系。 方法 选取行宫颈癌根治术87例患者的肿瘤组织、癌旁组织、正常宫颈组织标本进行研究,采用免疫组织化学法检测组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达情况,并结合患者临床病理特征进行分析,采用Kaplan-Meier生存曲线比较患者3年生存情况,采用COX回归分析各项因素对患者预后的影响。 结果 免疫组化结果显示肿瘤组织中HPV16 E6、HPV16 E7阳性率高于癌旁组织和正常组织（P＜0.05）; HPV16 E6及HPV16 E7蛋白阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者（P＜0.05）;多因素分析显示HPV16 E6、HPV16 E7阳性是宫颈癌患者预后不良的独立危险因素（P＜0.05）。 结论 HPV16 E6、HPV16 E7蛋白在宫颈癌组织中阳性表达,与患者临床病理特征和预后相关,可能作为治疗宫颈癌的新靶点发挥作用。     

保妇康栓对人乳头状瘤病毒抑制作用的实验研究

目的:探讨中药制剂保妇康栓对人乳头状瘤病毒(HPV)16亚型的抑制作用。方法:以不同浓度的含保妇康栓培养基体外培养宫颈癌细胞系CaSki和宫颈永生化细胞H8,相差显微镜下观察活细胞形态学变化;采用四甲基偶氮唑蓝比色法以及流式细胞术技术检测不同浓度保妇康栓对细胞增殖的影响;应用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测人乳头状瘤病毒HPV16亚型E6E7的表达。结果:不同浓度的保妇康栓可以抑制细胞的增殖;在药物作用下,CaSki细胞G1期细胞增加(P<0.05),G2、S期细胞减少(P<0.05),CaSki细胞凋亡率高于对照组(P<0.05),而对H8细胞周期和凋亡率影响不明显;两种细胞HPV16E6E7基因片段mRNA表达均明显低于对照组(P<0.01)。结论:保妇康栓在体外抑制宫颈癌细胞系CaSki和宫颈永生化细胞H8增殖,其机制可能是通过抑制HPV16E6E7表达而抑制肿瘤细胞生长。     

人乳头瘤病毒E6/E7蛋白在宫颈病变筛查中的应用

目的:探讨人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)E6/E7蛋白在宫颈癌筛查中的作用。方法:选取宫颈疾病患者70例,行宫颈病理学检查及新柏氏液基细胞学(TCT)检测,比较高危型HPV E6/E7 mRNA与HPV DNA分型检测宫颈癌病变及非典型鳞状细胞(ASC-US)患者高级别宫颈癌病变的敏感度、特异度。结果:高危型HPV E6/E7 mRNA检测与HPV DNA分型检测宫颈病变总检出率分别为60.0%(42/70)、67.1%(47/70);两种方法检测慢性宫颈炎及CINⅠ、CINⅡ~Ⅲ、宫颈癌检出率差异均无统计学意义(P>0.05);宫颈病变的敏感度、阳性预测值及阴性预测值差异无统计学意义(P>0.05),高危型HPV E6/E7 mRNA检测的特异度明显高于HPV DNA分型检测(P<0.05);ASC-US患者高危型HPV E6/E7 mRNA检测的特异度明显高于HPV DNA分型检测(P<0.05)。结论:与HPV DNA分型检测方法相比,高危型HPV E6/E7 mRNA检测对预测宫颈病变特异度更强,特别是对TCT检测为ASC-US患者的分流意义更为明确。     

宫颈癌及癌前病变中人乳头瘤病毒16载量与整合频率的研究

目的 研究人乳头瘤病毒(HPV)16病毒载量、基因组整合状态与癌前病变进展的关系,探讨HPV基因组整合频率作为宫颈病变程度标志物的可行性.方法 收集宫颈脱落细胞标本337例,通过PCR扩增、DNA测序分析筛选出HPV16单一感染的样品40例,利用实时定量PCR检测早期基因E2、E6和β-肌动蛋白的拷贝数,分析病毒载量和整合状态.结果 (1)校正后病毒载量在正常组、低度鳞状上皮内病变(LSIL)组、高度鳞状上皮内病变(HSIL)组和宫颈鳞癌组的中位数分别是0.11拷贝/细胞、18.55拷贝/细胞、44.63拷贝/细胞、7.6拷贝/细胞,正常组低于LSIL与HSIL组,宫颈鳞癌组低于HSIL组.(2)在正常、癌前病变(LSIL-HSIL)和宫颈鳞癌中E2/E6比值的中位数分别是0.93、0.84、0.64,E2/E6比值与病变的严重程度显著相关.(3)随着病变程度的升高,游离型比例逐渐降低:正常4/5、LSIL4/6、HSIL 10/16、宫颈鳞癌5/13,整合型(混合+整合)比例逐渐升高:正常1/5、LSIL 2/6、HSIL 6/16、官颈鳞癌8/13.2例完全整合的标本均为宫颈鳞癌.结论 HPV16病毒载量可能不是预测宫颈病变的理想指标.HPV16整合频率与宫颈病变严重程度正相关,可能可作为HPV16感染后宫颈上皮细胞病变发展的预估指标.

Abstract：

Objective To investigate the association between viral load, genomic integration frequency of HPV 16 and cervical carcinogenesis and assess the probability that HPV 16 integration frequency may be utilized as a marker for cervical cancer. Methods Forty cases of HPV16 single infection were selected from 337 cervical scrape samples by PCR (polymerase chain reaction) amplification and DNA sequencing. The copy numbers of E2, E6 and β-actin were quantified to evaluate the viral load and integration status by real-time PCR. Results ( 1 ) The median number of adjusted viral load of normal group, LSIL (low-grade squamous intraepithelial lesion) group, HSIL (high-grade squamous intraepithelial lesion) group and squamous cervical cancer group were 0. 11, 18. 55, 44. 63 and 7.6 copies per cell respectively. The viral load was higher in LSIL-HSIL group than that in normal group while lower in squamous cervical cancer group than that in HSIL group. (2) The median number of E2/E6 was 0. 93 in normal group, 0. 84 in precancerous group (LSIL-HSIL) and 0. 64 in squamous cervical cancer group respectively. It showed a descending trend with the progression of cervical disease. (3) With the disease development, the proportion of episomal form decreased ( normal group 4/5, LSIL group 4/6, HSIL group 10/16, cervical squamous cancer group 5/13 ) whereas that of integrated form ( mixed and totally integrated)increased (normal group 1/5, LSIL group 2/6, HSIL group 6/16, cervical squamous cancer group 8/13).Both totally integrated cases were cervical squamous cancer. Conclusion ( 1 ) HPV 16 viral load may not be an ideal marker to predict cervical carcinogenesis. (2) Due to a positive correlation between HPV16 genomic integration frequency and cervical neoplastic progression, HPV 16 integration frequency may be a potential marker of early diagnosis for cervical lesion progression.     

宫颈癌妇女人乳头瘤病毒16E6/E7基因变异分析

目的了解宫颈癌妇女人乳头瘤病毒(HPV)16E6/E7基因变异的情况,为HPV防治提供流行病学数据。方法从大量样本中筛选出HPV16阳性标本180例,其中宫颈癌患者100例,宫颈不典型增生患者50例,宫颈炎症患者30例,对宫颈脱落细胞样本采用PCR方法扩增HPV16 E6/E7基因,然后对反应产物采用DNA测序法获得基因序列,在GeneBank进行经BLAST分析,寻找变异位点。结果宫颈癌患者中E6核苷酸变异率为82.00%(82/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);宫颈癌HPV16E6最频繁的序列变异为T178G(60/100),其他常见变异为T350G、C335T/A442C、T178G/G39T,年轻宫颈癌组E6核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但两者T178G变异率存在明显差异(=0.000)。宫颈癌患者HPV16 E7核苷酸变异率为74.00%(74/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);E7最频繁序列变异为A647G 32.00%(32/100),其他常见的变异为A647G/C749T/T843C/T846C、A647G/C749T/T846C、C749T/C790T、A647G/C749T;年轻宫颈癌组E7核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但A647G变异率存在明显差别(=0.03)。结论宫颈癌患者明显存在HPV16E6E7核苷酸变异,HPVE6 T178G、E7 A647G可能与宫颈癌年轻化密切相关,故对该人群的检测并及时尽早采取干预措施。     

Chimeric virus-like particles of the human papillomavirus type 16 (HPV 16) as a prophylactic and therapeutic vaccine

Infection by certain human papillomaviruses (HPV), most notably HPV types 16 and 18, is the major risk factor for cervical cancer. Worldwide, this disease represents the second most frequent malignant tumor in women; thus, there is urgent need for efficient therapy and prevention. The natural history of cervical cancer and its precursors (cervical intraepithelial neoplasias), as well as animal experiments, strongly suggest that the immune system controls both the primary infection (by neutralizing antibodies directed against the major structural protein L1) and the progression of the disease (via cytotoxic T cells specific for the viral oncoproteins expressed in transformed cells, e.g., E7). By the expression of an HPV 16 L1E7 fusion protein, we have generated chimeric virus-like particles (CVLP). Immunization of mice with CVLPs induces neutralizing antibodies directed against L1 virus-like particles (devoid of the E7 portion) and E7-specific T cells as measured in vitro. Vaccinated animals are protected against tumor growth following inoculation of syngeneic HPV 16-transformed cells. In addition, we observed a therapeutic effect of vaccination on pre-existing tumors. This data allowed us to conclude that CVLPs are suitable for prevention and therapy of HPV infection. A vaccine based on HPV 16 L1E7 CVLPs is currently under development.     

应用E2基因缺失的检测评价宫颈病变中HPV16感染状态

目的:应用E2基因缺失的检测了解宫颈病变中HPV16病毒染色体的存在状态,探讨其与宫颈癌的关系.方法:应用多重聚合酶链反应(PCR)对HPV16感染标本将其E2基因的C端、N端、铰链区分别与E6基因同时进行扩增,应用Scion Image 4.0软件对E2基因、E6基因电泳条带面积灰度值进行半定量分析,判定HPV16是...