腺病毒介导绿色荧光蛋白转染神经干细胞的实验研究

目的:研究复制缺陷型腺病毒(replication deficient adenoviral vectors,AdVec)介导外源基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)感染体外培养的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)表达的可行性及感染效率,探讨EGFP作为NSCs示踪剂的可行性。方法:体外原代培养、扩增大鼠NSCs,扩增、纯化AdVec-EGFP病毒液,以AdVec-EGFP病毒液感染NSCs,荧光显微镜观察AdVec-EGFP在NSCs中的表达和转染效率,免疫细胞化学鉴定重组子。结果:EGFP报告基因AdVec-EGFP高效感染NSCs,转染后6 h荧光蛋白开始表达,48 h后达高峰,感染率为(76±2)%,且NSCs的生物学性状没有发生变化。结论:AdVec-EGFP具有较高的介导外源基因表达于NSCs的效率,是NSCs体内、体外研究较理想的示踪剂。     

腺病毒载体介导EGFP转染大鼠骨髓间质干细胞研究

目的：探讨腺病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染大鼠骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的生物学特性。方法：骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓MSCs并采用流式细胞术进行鉴定。利用脂质体法通过腺病毒转染获得EGFP修饰的大鼠骨髓MSCs。结果：成功分离得到大鼠MSCs,腺病毒转染后大鼠骨髓MSCs过表达绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因,且转染后MSCs具有成骨分化潜能。结论：通过腺病毒转染能获得EGFP标记的大鼠MSCs,为MSCs组织工程和基因治疗研究提供了依据。     

腺病毒介导EGFP基因转染神经干细胞的实验研究

目的探讨腺病毒（adenovirus）介导的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因在神经干细胞（NSCS）的表达规律及转染对神经干细胞增殖、分化的影响。方法用不同感染复数的携带EGFP基因的腺病毒（Ad/EGFP）转染NSCS,在荧光倒置相差显微镜下观察EGFP的表达情况,同时用台盼蓝染色、细胞球计数、免疫细胞化学方法分别检测对照组和转染组细胞的活力、增殖、分化情况。结果Ad/EGFP转染16 h后NSCS发出绿色荧光,在第7天左右荧光强度达高峰并可持续稳定表达20天左右,Nestin表达阳性。在分化后细胞的胞体与突起均可见绿色荧光,部分细胞β-Ⅲtubu lin、GFAP表达阳性。同时观察到对照组和转染组的NSCS在第7天、14天、21天时细胞活力、增殖、分化情况均无统计学差异（P〉0.05）。结论Ad/EGFP可以高效转染新生大鼠海马NSCS,且不影响NSCS的存活、生长和分化。EGFP基因是神经干细胞的理想的报告基因。     

神经营养素-3基因转染神经干细胞的实验研究

目的：用神经营养素-3（NT-3）基因修饰神经干细胞，并观察在转染后的神经干细胞内的表达情况，为进一步的研究奠定基础。方法：采用阳离子脂质体介入法，将含绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒表达载体pAd—NT—3转染原代培养的神经干细胞，观察GFP及NT-3两种蛋白的表达，镜下测定转染率，采用免疫组化和逆转录酶-多聚酶链反应（RT-PCR）方法进行鉴定。转染后的神经干细胞经G418筛选，获得成功转染NT-3基因的NSCs克隆。结果：镜下观察到绿色荧光蛋白长期表达在转染后的神经干细胞，转染率可达40％。免疫组化和RT-PCR结果显示NT-3在转染后的神经干细胞可以长期表达。结论：NT-3基因，通过腺病毒的介导，以阳离子脂质体为载体，可有效的转染培养的神经干细胞并长期表达。     

小鼠BMPRⅠb基因慢病毒载体构建及转染神经干细胞

目的:构建携带小鼠BMPRⅠb基因的慢病毒载体,并转染神经干细胞,为研究BM-PRⅠb在BMPs调控神经干细胞分化中作用奠定基础。方法:利用RT-PCR从小鼠脑组织中获得BMPRⅠb基因,然后定向插入慢病毒表达质粒,进行双酶切及测序鉴定。将鉴定成功的重组慢病毒质粒和另外两种辅助质粒共转染包装细胞,收集、浓缩慢病毒并检测其滴度。利用获得的慢病毒载体转染NSCs,并观察目的基因表达情况。结果:RT-PCR产物经电泳及测序证实克隆成功BM-PRⅠb基因,酶切及测序鉴定成功构建重组慢病毒质粒,共转染293T细胞72h后大部分细胞表达绿色荧光,病毒滴度为5×108 TU/ml。慢病毒感染后的NSCs表达绿色荧光且BMPRⅠb mRNA表达上升。结论:成功构建BMPRⅠb基因慢病毒载体,并成功转染NSCs。     

绿色荧光蛋白作为神经干细胞示踪标记的实验研究

目的研究携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的腺病毒感染神经干细胞(neural stem cells,NSCs)后的荧光稳定性和持久性及其对NSCs生物学特性的影响;探讨利用其作为NSCs示踪标记的可行性.方法利用GFP-腺病毒空载体感染NSCs(NSCs-GFP),经G418筛选并连续传代,在相差显微镜下观察未感染NSCs和感染NSCs的形态以及在荧光显微镜下观察感染NSCs及其诱导分化后的GFP表达情况;并检测NSCs-GFP的细胞活性和细胞周期.调整GFP标记神经干细胞浓度为1×105/μl,将其植入大鼠侧脑室内,观察其在脑内的表达.结果未感染NSCs和感染NSCs的形态学、细胞活性和细胞周期等无明显差异(P＞0.05).GFP在诱导分化后的NSCs-GFP子代细胞中有高表达,并且第1代和第20代NSCs-GFP的绿色荧光无明显差别.在植入侧侧脑室周围可见绿色荧光的强表达,且持续时间较长.结论 GFP荧光稳定持久,对转染细胞的生物学特征无明显影响,并且移植后的荧光呈长时间强表达,因此可以将其作为神经干细胞的示踪标记,这将有利于神经干细胞移植后的可塑性研究.     

慢病毒介导GFP基因转染神经干细胞的实验研究

目的 探讨以慢病毒(Lentivirus,LV)为载体,转染绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)基因至神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)的方法,观察其转染效率.方法 应用包装细胞293T将三种质粒载体pGC-E1-GFP、pHelper1.0 和pHelper2.0经脂质体转染重组,构建成表达GFP的慢病毒载体(Lentiviral vector-GFP,LV-GFP).并从孕14天大鼠胚胎的脑组织分离出神经干细胞,采用无血清培养法,进行体外培养、扩增.取经过5次传代神经干细胞,以1×105个细胞/500μl/孔接种于24孔板,分别按复感染指数(Multiplicities of infection,MOIs值)为0、1、5、10、15、20加入LV-GFP稀释液100μl,每一滴度加六孔,共六组.48～72小时后于倒置荧光显微镜下观察各组GFP的表达效率,并在72小时后进行神经干细胞球进行计数,以观LV-GFP对NSCs增殖的影响.并行流式细胞仪检测,得出各组NSCs的 GFP阳性转染率.结果 除MOI值为0的对照组外,48～72小时后各孔均有GFP表达.MOI值从0增至10,细胞的阳性表达率逐渐提高(P<0.05),MOI值为10的组能获得>90%的转染率.但MOI值从10增至20,形成的神经干细胞球数目却逐渐减少(P<0.05).结论 LV是将目的 基因转入NSCs的理想载体.以MOI为10的滴度,LV可将GFP基因高效转入神经干细胞内并表达.     

小鼠pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreenl慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的 构建共表达小鼠Wnt3a(mWnt3a)与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体,感染神经干细胞(NSCs),观察mWnt3a在NSCs中的表达.方法 利用同源重组技术将mWnt3a基因插入慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreenl.构建pLVX-Wnt3a-IRES-Zs-Greenl慢病毒重组质粒,通过瞬时转染法包装出病毒上清,感染NSCs,设为Wnt3a-NSCs组;同时设GFP感染NSCs组(GFP-NSCs组)和未感染NSCs组(NSCs组)作为对照.免疫荧光染色法对Wnt3a-NSCs组NSCs进行nestin鉴定;Real-Time PCR检测各组细胞mWnt3a mRNA的表达;Western blotting检测各组细胞mWnt3a、β-catenin蛋白的表达.结果 经限制性内切酶检测、基因测序和绿色荧光观察证实成功构建了携带mWnt3a基因的重组慢病毒,且慢病毒滴度达3×108TU/mL.Wnt3a-NSCs组NSCs在荧光显微镜下证实有绿色荧光,且nestin表达阳性.Real-Time PCR和Western blotting结果显示感染后7d,Wnt3a-NSCs组mWnt3a mRNA和蛋白以及β-catenin蛋白均明显高于GFP-NSCs组和NSCs组(P＜0.01).结论 成功构建了表达mWnt3a基因的慢病毒载体,在体外培养条件下可以成功转染NSCs.     

缺氧诱导因子-1α与绿色荧光蛋白在神经干细胞中的共表达

目的:以携带缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)及绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的腺病毒转染大鼠神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),观察HIF-1α和GFP在NSCs中的表达以及对NSCs生物学特性的影响,为HIF-1α基因转染的NSCs移植治疗缺血性脑血管病提供物质基础.方法:利用携带HIF-1α和GFP基因的重组腺病毒转染NSCs,相差显微镜下观察NSCs的形态及在荧光显微镜下观察NSCs及其诱导分化后的GFP表达情况;观察HIF-1α基因在NSCs中的表达;并检测NSCs的细胞活性.应用免疫荧光技术检测神经干细胞及其诱导后分化细胞的特异性蛋白巢蛋白(Nestin)、神经微丝蛋白(Neurofilament protein)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP).结果:重组腺病毒转染NSCs后外源性基因及绿色荧光蛋白有持续稳定表达;转染后的NSCs的形态学、细胞活性和分化能力等与未转染的NSCs无明显差异(P＞0.05);检测神经元标志物神经微丝蛋白和胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白,证实转染后的NSCs仍然具有多向分化潜能.结论:NSCs转染携带HIF-1α和GFP基因的重组腺病毒后能够持续、稳定地表达HIF-1α和GFP,生物学特征正常.     

小鼠pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的 构建共表达小鼠Wnt3a（mWnt3a）与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体,感染神经干细胞(NSCs),观察mWnt3a在NSCs中的表达。方法 利用同源重组技术将mWnt3a基因插入慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1,构建pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒重组质粒,通过瞬时转染法包装出病毒上清,感染NSCs,设为Wnt3a-NSCs组;同时设GFP感染NSCs组（GFP-NSCs组）和未感染NSCs组(NSCs组)作为对照。免疫荧光染色法对Wnt3a-NSCs组NSCs 进行nestin鉴定;Real-Time PCR检测各组细胞mWnt3a mRNA的表达;Western blotting检测各组细胞mWnt3a、β-catenin蛋白的表达。结果 经限制性内切酶检测、基因测序和绿色荧光观察证实成功构建了携带mWnt3a基因的重组慢病毒,且慢病毒滴度达3×108 TU/mL。Wnt3a-NSCs组NSCs在荧光显微镜下证实有绿色荧光,且nestin表达阳性。Real-Time PCR和Western blotting结果显示感染后7 d, Wnt3a-NSCs组mWnt3a mRNA和蛋白以及β-catenin蛋白均明显高于GFP-NSCs组和NSCs组（P<0.01）。结论 成功构建了表达mWnt3a基因的慢病毒载体,在体外培养条件下可以成功转染NSCs。     

人APOEε2及ε4等位基因修饰的神经干细胞的建立

目的构建APOEε2和APOEε4的真核表达载体,转染APOE敲除鼠神经干细胞,分别建立转染APOEε2和ε4的神经干细胞系。方法以前期克隆得到的APOEε3cDNA为基础,通过定点突变技术得到APOEε2和APOEε4cDNA,亚克隆入表达载体pEGFP-N1,构建pEGFP-N1-APOEε2及pEGFP-N1-APOEε4的真核表达载体,经双酶切和测序确定序列及阅读框正确。以脂质体转染法转染APOE敲除鼠神经干细胞,通过G418筛选,建立转染APOEε2和ε4的神经干细胞系。采用RT-PCR、Westernblot及免疫荧光法检测APOE的表达。结果APOE敲除鼠NSCs转染6h后发出绿色荧光,48h达到高峰,荧光显微镜下观察转染率约(40.0±2.3)%,转染pEGFP-N1-APOE的NSCs在筛选至第10天可见细胞克隆形成。经鉴定保持了自我更新、多向分化保持性,其中分化为神经元的比例为(32.15±2.61)%,各组之间无明显差异。结论成功构建了稳定表达源性APOEε2及ε4的神经干细胞克隆,相应等位基因修饰的神经干细胞能高效表达目的基因蛋白并保留其干细胞特性。     

BDNF基因逆转录表达载体的构建和在淋巴细胞中的表达

【目的】构建含脑源性神经营养因子基因(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNFgene)逆转录表达载体并了解其在淋巴细胞中的表达,探讨治疗基因的非损伤性脑内转移的新途径。【方法】用RT-PCR方法从大鼠海马组织总RNA中扩增(cDNA)BDNF片段,应用基因重组技术将大鼠(cDNA)BDNF克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒进行鉴定,采用LipofectAMINE将重组大鼠(cDNA)BDNF导入PA317细胞,获取高滴度的病毒上清转染大鼠淋巴细胞,应用流式细胞仪(FCM)检测大鼠淋巴细胞BDNF的表达,噻唑蓝(MTT)法检测淋巴细胞培养上清对PC12细胞增殖的影响。【结果】扩增出大鼠(cDNA)BDNF片段,限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒pLXSN-BDNF,BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达BDNF蛋白,其培养上清能促进PC12细胞增殖。【结论】成功构建了BDNF基因逆转录表达载体,BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达和分泌具有生物活性的BDNF蛋白,为治疗基因的非损伤性脑内转移奠定了一定基础。     

BDNF-GFP转染神经干细胞对脊髓损伤大鼠BDNF表达的影响

目的探讨脑源性神经营养因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF）和绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）转染后神经干细胞（Neural Stem Cells,NSCs）移植对脊髓损伤大鼠BDNF表达的影响。方法以携带BDNF-GFP基因的腺病毒转染NSCs,免疫组化及Western blot检测转染后NSCs BDNF表达。40只Wistar大鼠中假手术组8只,32只大鼠制成T9左侧横断模型,并随机分成四组：BDNF和GFP修饰的N-SCs移植组、GFP修饰的NSCs移植组、单纯NSCs移植组和模型组。在各NSCs移植组,脊髓损伤后向横断处显微注射等体积细胞,模型组在相同的部位注射等体积的PBS。实时定量PCR检测各实验组BDNF表达情况。结果免疫组化显示BDNF-GFP转染的NSCs可表达BDNF（黄色荧光）。Western blot结果显示BDNF-GFP转染的NSCs可表达相对分子质量约为41kU的融合蛋白条带。NSCs移植可使BDNF的表达量明显增高（P〈0.05或P〈0.01）,以BDNF-GFP转染的NSCs移植组BDNF表达量最高（P〈0.01）。结论 BDNF-GFP转染后NSCs可在脊髓半切模型中存活并高表达具有生物活性的BDNF。     

大鼠BDNF基因复制缺陷型重组腺病毒的构建与鉴定

 【目的】构建携带大鼠脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并初步检测其体外表达目的基因的能力。【方法】提取大鼠脑组织总RNA，使用RT—PCR方法扩增BDNF目的基因并将其克隆入pMD18-T Simple载体测序，将测序完全正确的BDNF目的基因克隆入pShuttle2中，然后利用体外连接法将BDNF目的基因克隆入Adeno—X^TM腺病毒骨架中。Lipofectamine^TM 2000法转染HEK293细胞包装携带BDNF目的基因的重组腺病毒，少量提取重组腺病毒DNA检测证实为复制缺陷型BDNF基因重组腺病毒后大量扩增。蛋白电泳及Western blot法初步检测BDNF目的基因在HEK293细胞中的表达。【结果】成功构建了携带大鼠BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒。并证实其在HEK293细胞中可高水平表达BDNF目的基因。【结论】利用体外连接法可方便、快捷地构建携带BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并可在体外高水平表达表达其所携带的目的基因。     

人EGFR基因真核表达质粒的构建及其在293细胞中的表达

目的:构建人表皮生长因子(EGFR)基因真核表达系统,拟为EGFR靶向腺病毒准备包装细胞.方法:用RT-PCR法,从人A431细胞中逆转录出EGFR基因cDNA,插入到pcDNA3.1(+)质粒中,拟构建EGFR真核表达载体,经测序证实.用脂质体将重组质粒转染293细胞,经G418筛选获得稳定表达EGFR重组克隆,用Western blot鉴定转染细胞中EGFR基因的表达.结果:经限制性内切酶酶切及测序结果分析证实EGFR基因已插入重组质粒.Western blot方法证实转基因293细胞中存在人EGFR基因的表达.结论:成功构建的人EGFR/pcDNA3.1(+)真核表达系统能够在293细胞稳定表达.     

重组Persephin腺病毒对6-OHDA损伤神经干细胞的保护作用

[目的]探讨Persephin对6-羟基多巴(6-OHDA)损伤神经干细胞的保护作用.[方法]用RT-PCR法从人胚胎脑获得Persephin cDNA,构建重组Persephin腺病毒.用Western blot方法分析Persephin基因的表达,Hoechst染色和流式细胞术测定6-羟基多巴对神经干细胞凋亡的诱导作用.[结果]从人胎脑成功克隆了人Persephin cDNA,构建了其腺病毒载体.Western blot证实重组Persephin腺病毒在神经干细胞中的表达,表达的Persephin可抑制6-羟基多巴诱导的神经干细胞凋亡.[结论]Persephin对6-羟基多巴损伤神经干细胞具有保护作用.     

克隆大鼠内皮素B受体基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定

目的克隆大鼠内皮素B受体（EDNRB）基因，构建含有EDNRB基因的重组腺病毒载体，为转染神经干细胞和基因治疗先天性巨结肠（HD）奠定基础。方法从大鼠心脏组织中提取总RNA，用RT—PCR方法扩增出约1580bp的片段，并将该片段克隆到载体pAdtrack—CMV中，进行酶切鉴定和序列分析。结果证实成功构建了含有EDNPd3基因的重组腺病毒质粒。结论克隆到正确的大鼠EDNPd3基因，并构建出重组质粒pAd—EDNRB，为下一步重组腺病毒颗粒和基因治疗打下基础。     

逆转录病毒介导的脑源性神经营养因子在大鼠成肌细胞中表达及分泌

目的：研究经逆转录病毒载体的介导将脑源性神经营养因子（ＢＤＮＦ）ｃＤＮＡ导入大鼠成肌细胞，为体内移植治疗打下基础。方法：采用电穿孔法将重组大鼠ＢＤＮＦｃＤＮＡ导入ＰＡ３１７包装细胞，获取高滴度的病毒上清转染成肌细胞。Ｇ４１８筛选转染的成肌细胞，采用Ｎｏｒｔｈｅｍ杂交和ＰＣ１２细胞存活检测。结果：证实转染细胞内有ＢＤＮＦｍＲＮＡ的表达并具有促进细胞存活的生物学活性。结论：ＢＤＮＦｃＤＮＡ可在真核细胞内表达并具有生物学效应，可用于神经系统基因治疗的研究。     

胞嘧啶脱氨酶基因修饰神经干细胞及其表达的离体实验研究

目的 探讨胞嘧啶脱氨酶(cytimidine deaminase，CD)基因修饰神经干细胞及其基因表达。方法 通过构建真核表达质粒pCMVCD，限制性内切酶消化鉴定后，采用Lipofectamine 2000脂质体介导法转染新生大鼠室管膜下区神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)，G418筛选阳性克隆，加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-Flourocytosine，5-FC)，MTT比色法测定NSCs的生存率。结果 本实验成功地培养并鉴定了神经干细胞，并将CD基因成功地转染了神经干细胞，G418阳性NSCs对低浓度5-FC高度敏感。结论 CD基因修饰神经干细胞的离体实验研究为干细胞治疗研究提供依据。     

人胰岛素样生长因子-1真核表达载体的构建及在神经干细胞中的表达

目的:构建人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)真核表达载体,并在人脐血神经干细胞(NSCs)中表达。方法:采用RT-PCR法从人胎肝中克隆IGF-1基因,将其导入真核表达载体pcDNA3.1中,用脂质体转染法将重组质粒转染人脐血NSCs。分别采用RT-PCR和免疫荧光细胞化学法检测转基因NSCs中IGF-1mRNA和蛋白的表达。结果:琼脂糖电泳显示RT-PCR扩增出462bp的条带;重组载体pcDNA3.1-IGF-1经HindⅢ与BamHⅠ双酶切后,得到5428bp和462bp的两个条带;目的基因转染的NSCs经RT-PCR扩增出一条与目的基因一致的条带;免疫荧光细胞化学检测到IGF-1蛋白的表达。结论:成功构建了人IGF-1基因的真核表达载体,转染后IGF-1重组蛋白在人脐血NSCs中能成功表达。