庚型肝炎病毒不同地理株5‘端非编码区序列的变异性分析

目的：为明确了解中国不同地区（广东，云南，香港）庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）株５‘端非编码区（ＮＣＲ）序列的差异。方法：采用逆转录巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，从广东省２例，云南省１例，香港３例共６例ＨＧＶ感染者血浆中扩增ＨＧＶ５’ＮＣＲ ｃＤＮＡ片段，为２３８ｂｐ，ＰＣＲ产物纯化后直接经对脱氧链末端终止法测定核苷酸序列。结果：中国ＨＧＶ株间５‘ＮＣＲ相应序列的同源性介乎９２．９３％￣９７．９８     

用尿嘧啶－DNA－糖基化酶控制聚合酶链反应的产物污染

聚合酶链反应（ＰＣＲ）灵敏度极高，痕量的ＰＣＲ产物能污染新的ＰＣＲ体系（称为产物污染）导致假阳性结果，我们通过在所有的ＰＣＲ扩增中掺入ｄＵＴＰ使ＰＣＲ产物含“ｄＵ”，在以后的ＰＣＲ扩增前用尿嘧啶－ＤＮＡ糖基化酶（Ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ－Ｇｌｙｃｏｌａｓｅ，ＵＤＧ）处理，然后加热去除ＵＤＧ活性防止了产物污染。ＵＤＧ切割磷酸糖骨架上的尿嘧啶，可阴止ＤＮＡ聚合酶对它的复制，而对普通ＤＮＡ（即含”ｄＴ”）无影响。因为ＵＤＧ不与ｄＵＴＰ反应，而且在ＰＣＲ扩增前加热变性失活，使含尿嘧啶的污染物的污染得到很好控制。     

变性高效液相色谱法检测CpG岛胞嘧啶甲基化

目的 建立一种新型的ＣpＧ岛胞嘧啶甲基化快速检测方法。方法 用亚硫酸氢钠处理ＤＮＡ,丙用链特异性聚合酶链反应（ＰＣＲ）对错配修复基因hＭＬＨ１启动子含ＣpＧ位点的靶序列进行扩增;利用变性高效液相色谱法（ＤＨＰＬＣ）在部分变性温度下测定靶序列的保留时间,并与亚硫酸氢钠－酶切法测定结果进行比较。结果 用ＤＨＰＬＣ对结肠癌细胞株ＲＫＯ和胃癌细胞株ＰＡＣＭ８２的hＭＬＨ１启动子进行测定,发现ＲＫＯ细胞ＰＣＲ产物的保留时间显长于ＰＡＣＭ８２细胞ＰＣＲ产物的保留时间（６．７min比６．２min）。ＲＫＯ细胞ＰＣＲ产物保留时间的延长是亚硫酸氢钠处理后的模板中胞嘧啶和鸟嘌呤含量较ＰＡＣＭ８２高所致。从此结果分析,可以判断出ＲＫＯ的hＭＬＨ１启动子已甲基化,而ＰＡＣＭ８２细胞未甲基化。此结果与酶切法结果完全一致。结论 新方法可以快速检测ＣpＧ岛胞嘧啶甲基化。     

PCR循环测序法检测K-ras和HCV 5'非编码区基因变异

目的：建立一种简单、快速、可靠的ＤＮＡ序列分析方法，并利用此方法分析Ｋｒａｓ基因和ＨＣＶ５′非编码区基因的变异情况。方法：ＰＣＲ循环测序法是将ＰＣＲ扩增与核酸序列分析相结合的一种研究方法。根据此技术原理，建立了以ＰＣＲ扩增引物为测序引物，利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶、荧光标记的２′，３′双脱氧核苷三磷酸（ｄｄＮＴＰ）直接进行ＰＣＲ扩增产物序列分析的方法。应用该方法对人肺癌组织中的Ｋｒａｓ癌基因和丙型肝炎病毒５′非编码区（ＨＣＶ５′ＮＴＲ）进行了序列测定。结果：肺癌组织中的Ｋｒａｓ基因第１外显子第３５位碱基发生点突变（ＧＧＴ→ＧＡＴ）；属于高度保守区的ＨＣＶ５′ＮＴＲ存在基因变异。结论：ＰＣＲ循环测序法具有简单、快速、结果可靠等特点，为基因突变的检测和病原体的核酸序列分析提供了一个快速实用的方法。     

单克隆抗体可变区DNA序列的测定

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法获得单克隆抗体重、轻链的可变区基因，并进行了ＰＣＲ产物直接ＤＮＡ序列测定，或将扩增产物分别插入ｐＵＣ１８质粒，筛选出阳性克隆，用末端终止法进行ＤＮＡ序列测定。得到大约３５０ｂｐ可变区基因，符合Ｉｇ可变区基因编码。直接法简便可靠，节省时间和试剂；而克隆法带有酶切位点，有利于基因工程抗体的构建和表达。     

肝细胞癌患者中p53基因的突变研究

为了解肝细胞癌（ＨＣＣ）中ｐ５３基因的突变情况，收集８６例ＨＣＣ手术切除标本，采用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ／ＳＳＣＰ）、聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（ＰＣＲ／ＲＦＬＰ）和ＤＮＡ序列分析，研究了ｐ５３基因的突变情况。８６例ＨＣＣ中，ｐ５３基因的突变率为３６％，其中，密码子２４９的突变率为３３．７％，１例ＳＳＣＰ和ＲＦＬＰ均提示密码子２４９存在突变者经ＤＮＡ序列分析显示密码子２４９的第三个碱基发生了ＡＧＧ／ＡｒｇＡＧＴ／Ｓｅｒ突变。以上结果提示，ＨＣＣ中，ｐ５３基因的突变主要以点突变为主，主要发生在密码子２４９，其突变率、突变谱和突变方式与启东等ＨＣＣ高度流行区相似     

用PTVS检测t（14；18）PCR产物的DNA序列

为确定聚合酶链反应（ＰＣＲ）和地高辛（ＤＩＧ）系统检测ｔ（１４；１８）的特异性，我们采用ＰＧＥＭ－Ｔｖｅｃｔｏｒ系统（ＰＴＶＳ）和双脱氧链终止技术克隆并测定了ＲＬ细胞系和一个ＮＨＬ患者－Ａｍｂｒｏｓｅｎ的ｔ（１４；１８）ＰＣＲ产物的ＤＮＡ序列。结果表明两者的ＰＣＲ扩增产物均为ｂｃｌ－２－ＪＨ融合基因片段，证实ＰＣＲ－ＤＩＧ系统是一种特异的检测ｔ（１４；１８）的方法。同时还表明用ＰＴＶＳ对ＰＣＲ。产物进行克隆测序优于直接用双脱氧法测序。     

黑色素瘤抗原-1基因在肝细胞癌中的表达

目的 检测黑色素瘤抗原－１（ＭＡＧＥ－１）ｍＲＮＡ在肝细胞癌（ＨＣＣ）中的表达,为用ＭＡＧＥ－１基因编码蛋白作为疫苗对ＨＣＣ患者进行免疫治疗提供依据。方法 用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法对４５例ＨＣＣ患者组织和相应癌旁肝组织以及１６例肝硬化组织和１２例正常肝组织的ＭＡＧＥ－１ｍＲＮＡ表达情况进行了研究,对６例ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物的目的基因片段进行ＤＮＡ序列测定,并以测序证实为ＭＡＧＥ－     

日本血吸虫中国大陆株副肌球蛋白编码基因的PCR扩增

根据已知的日本血吸虫菲律宾株的副肌球蛋白分子的部分ｃＤＮＡ序列，设计两对寡核苷酸引物（引物１／２和引物３／４），以聚合酶链式反应（ＰＣＲ），用引物１／２从本室两个日本血吸虫中国大陆株ｃＤＮＡ库中均扩增出与预期大小（９２７ｂｐ）一致的特定ＤＮＡ片段。巢式ＰＣＲ——以第一扩增产物为模板，用引物３／４扩增出约５００ｂｐ的单一条带，与预期片段（４９４ｂｐ）大小一致。表明ＰＣＲ产物为编码副肌球蛋白的目的基因片段。     

日本血吸虫大国大陆株副肌球蛋白编码基因的PCR扩增

根据已知的日本血吸虫菲律宾株的副肌球蛋白分子的部分ｃＤＮＡ序列，设计两对寡核苷酸引物（引物１／２和引物３／４），以聚合酶链式反应（ＰＣＲ），用引物１／２从本室两个日本血吸虫中国大陆株ｃＤＮＡ库中均扩增出与预期大小（９２７ｂｐ）一致的特定ＤＮＡ片断。巢式ＰＣＲ－以第一扩增产物为模板，用引物３／４扩增出约５０００ｂｐ的单一条带，与预期片段（４９４ｂｐ）大小一致。表明ＰＣＲ产物为编码副肌球蛋白的目的基因     

ABI PRISM TM 3100型遗传分析仪最佳反应体系探讨

目的探讨ABI PRISMTM 3100型遗传分析仪的最佳反应体系,使DNA序列测定高效且经济。方法运用含有重组质粒的饱和大肠杆菌E.coli菌液,采取碱裂解法提取质粒。依据测序原理,分别通过调整模板量、BigDye Mix的用量和反应体系的体积来确定ABI PRISMTM 3100型遗传分析仪的最佳反应条件。结果针对该样本,测定DNA序列的最佳反应体系为:模板量100 ng,BigDye Mix 2μL,引物1.6 pmol,双重蒸馏水补足总体积为10μL。结论该反应体系保证了ABI PRISMTM 3100型遗传分析仪的测序质量,且大大节约了成本。     

应用焦磷酸微测序技术行HLA-DRB基因型分析

目的应用焦磷酸微测序技术进行HLA-DRB基因型分析.方法PCR扩增外显子2基因片段,经链亲和素包被磁珠纯化、制备单链DNA测序模板,应用焦磷酸微测序技术进行实时测序和HLA-DRB基因分型.结果焦磷酸微测序技术-次可判读40～80个碱基,采用3-4个微测序可以判读全部扩增区域的多态性位点,测序结果与HLA数据库基因序列比较,可准确进行HLA-DRB基因型分析.结论焦磷酸微测序技术应用于HLA-DRB基因型分析具有高分辨率、高通量和快速等优点,该方法可应用于器官及骨髓移植的供体/受体筛查.     

碱裂解法快速提取口腔拭子DNA对CHRNA3基因多态性的研究

目的建立一种快速的从口腔拭子中提取DNA的方法,研究其在尼古丁乙酰胆碱受体α3(CHRNA3)基因多态性分析中的应用。方法以NaOH和乙二胺四乙酸(EDTA)配制碱裂解液,以三羟甲基氨基甲烷-EDTA(TE)为中和液,经加热裂解和中和两步提取口腔拭子DNA。以提取的DNA为模板,用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析对CHRNA3基因的rs6495309进行分型。对不同基因型的样本测序验证。结果 PCR扩增和酶切的靶带清晰,无非特异性条带。酶切结果与测序结果吻合。结论碱裂解法提取口腔拭子DNA具有快速、简便、经济、可靠的特点,可以用于CHRNA3基因多态性的分析。     

基于水凝胶的基因组DNA固定法研究

目的：通过对人基因组DNA固定化的研究,探讨特异性高的单点共价固定方法,实现对人基因组DNA的反复利用。
方法：选取Mirzabekov等发明的DNA-水凝胶共聚化学法作为基因组DNA固定方法,使用甲基丙烯酰胺凝胶作为固相支持载体,以(CH2)6-NH2氨基末端修饰的PCR产物及甲酸随机断裂修饰的pGEM-T-HLA-G质粒为模板,使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其固定效率,并通过PCR法检测该固定方法的热稳定性。将该法初步应用于人类基因组DNA的固定和反复利用,对基因组DNA扩增的片段进行测序,排除突变可能。
结果：使用甲基丙烯酰胺凝胶作为固相支持载体,实现了对质粒DNA以及人基因组DNA的固定和反复使用,该方法可以经受16轮的PCR扩增（每轮36个循环）。测序结果证实基因组DNA的扩增片段未发生突变。
结论：甲基丙烯酰胺凝胶法固定DNA的热稳定性好,特异性高,可用于全基因组测序及SNP检测。     

多位点ARMS-PCR法进行HBVS区检测分型

目的：建立一种准确有效的PCR法HBV分型的实验方案。方法对80例包含了 HBV不同型别（B/C/D型）的血清样本进行了 HBV S区测序，通过分析国人 HBV B/C/D型S区碱基固有差异位点，设计得针对各种HBV 型别的高度特异性A RM S引物与探针，并用于另外120例HBV样本的PCR检测实验，同时进行测序进行检测准确度验证。结果多位点ARMS-PCR法与测序法的型别检出吻合率为99．5％，其中一例HBV B/C型混合感染由ARMS-PCR法检出并经追溯确认。结论经验证可见设计于S区型别固有差异位点之上的ARMS引物与探针于PCR检测中能以极高的特异性对 HBV 血清样本进分型，并能检出 HBV 混合型中的劣势病毒株。PCR法以其低成本、结果容易判定以及高灵敏度等优点，于临床HBV分型上是更为推荐的分子诊断学方法。     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

Y染色体STR基因座DYS385等位基因分型标准物的制备及群体遗传学研究

目的　采用分子克隆技术大量制备优质标准 STR基因座等位基因分型标准物 ,解决长期困扰STR分型上存在的准确性和标准化问题。方法　先用 PCR扩增出 Y染色体上 DYS385基因座的 9个等位基因片段 ,将其插入 p U C重组质粒中 ,经 DNA测序分析证实插入片段的结构及大小 ,按国际标准将插入的等位基因片段进行命名 ,最后经转染、扩大培养、扩增及再鉴定后制备出标准的 DYS385等位基因分型标准物。结果　应用此法制备出大量的 DYS385等位基因分型标准物 ,并将其成功地应用于该基因座在中国成都地区汉族及德国美茵茨地区高加索人群体中的基因型分布频率调查。结论　该法制备的 STR基因座等位基因分型标准物在法科学实践中应用价值极高 ,DYS385基因座是一个适合我国群体分析和法科学应用的遗传标记     

中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白2基因的分子？…

目的 为设计研制安全有效的人脑型疟疫苗提供科学依据。方法 应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）对５例中国脑型疟患者恶性朱虫云南省勐腊县勐罕（ＣＭＨ／ＹＮ）分离株和云南省盈江县农场（ＣＹＪ／ＹＮ）分离株基因组裂殖子表面蛋白２（ＭＳＰ２）基因进行扩增,将扩增产物分别经ＢａｍＨＩ和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切后,回收的ＭＳＰ２基因分子定向克隆Ｍ１３ｍ１８和Ｍ１３ｍｐ１９载体,按Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法进行ＤＮＡ序列测定,     

Y染色体STR基因座DYS385等位基因分型标准物的制备及群体遗传学研究

目的 采用分子克隆技术大量制备优质标准STR基因座等位基因分型标准物,解决长期困扰STR分型上存在的准确性和标准化问题,方法 先用PCR扩增出Y染色体上DYS385基因座的9个等位基因片段,将其插入pUC重组质粒中,经DNA测序分析证实插入片段的结构及大小,按国际标准将插入的等位基因片段进行命名,最后经转染、扩大培养、扩增及再鉴定后制备出标准的DYS385等位基因标准物。结果 应用此法制备出大量的DYS385等位基因分型标准物,并将成功地应用于该基因座在中国成都地区汉族及德国美茵茨地区高加索人群体中的基因型分布频率调查。结论 该法制备的STR基因座等位基因分型标准物在法科学实践中应用价值极高,DYS385基因座是一个适合我国群体分析和法科学应用的遗传标记。     

基于R6G-ddATP/SNaPShot-凝胶荧光法的高危型人乳头瘤病毒基因型微量检测

  目的  使用R6G-ddATP作为双脱氧荧光底物建立单碱基末端延伸（SNaPShot）-凝胶荧光法快速检测3种高危型人乳头瘤病毒（high risk human papillomavirus,HR-HPV）（HPV18、HPV33、HPV35）基因型。  方法  使用HPV质控品作为样本,R6G-ddATP双脱氧荧光试剂作为底物,首先利用通用引物对HPV进行扩增,得到第一轮扩增产物,经纯化后作为后续SNaPShot反应的模板;然后利用特异性的一步延伸引物进行SNaPShot反应,生成带有R6G荧光标记的DNA延伸产物;产物经过琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像仪下观察电泳结果,通过不同的一步延伸引物对HPV进行分型。每个样本均重复检测3次,并与DNA测序结果进行比较。  结果  优选的SNaPShot反应的退火温度为55℃;仅需3 h即可对HPV进行分型;在该最适条件下使用R6G-ddATP/SNaPShot-凝胶荧光法检测3种HPV基因型,检测结果与测序结果一致。  结论  成功建立了3种HR-HPV基因型的微量检测方法——R6G-ddATP/SNaPShot-凝胶荧光法,可用于HPV基因型的快速检测。