人剪切修复基因XPD对肝癌细胞中p8/TTDA基因的调控作用

目的 探讨人剪切修复基因XPD对p8/TTDA基因的调控作用.方法 用pEGFP-N2/XPD重组质粒、pEGFP-N2空载质粒分别稳定转染人肝癌细胞SMMC-7721,并用具有相同遗传背景和代数的SMMC-7721细胞作为空白对照.用RT-PCR、Western blot法检测转染前后p8、XPD、p53、c-myc表达量的变化,四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察细胞增殖活力.结果 (1)RT-PCR检测示:p8 mRNA在人肝癌细胞SMMC-7721是低表达的,稳定转染野生型XPD后,p8 mRNA和XPD mRNA表达量明显增高(P<0.001).稳定转染重组质粒细胞组p53 mRNA表达量亦明显增高(P<0.05),c-myc mRNA表达量则明显下降(P<0.001).(2)Western blot法检测示:p8蛋白在人肝癌细胞SMMC-7721是低表达的.稳定转染野生型XPD后,p8蛋白、XPD蛋白、p53蛋白表达量明显增高(P<0.05),c-myc蛋白表达量则明显下降,差异有统计学意义(P<0.001).(3)MTT检测示:稳定转染重组质粒细胞组细胞增殖率明显减弱(P<0.001).结论 人剪切修复基因XPD可调控p8/TTDA基因的表达.野生型XPD转染后亦可上调p53表达,下调c-myc表达,从而在分子途径上抑制SMMC-7721细胞增殖,促进其凋亡.     

整合蛋白β1亚基过表达上调p27抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖

目的:研究整合蛋白β1亚基过表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响及机制。方法:采用MTT及细胞流式测定观察整合蛋白β1亚基过表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖及细胞周期的影响。蛋白质印迹及RT-PCR检测细胞中p27的蛋白及mRNA的表达,并构建p27的RNA干扰质粒,转染整合蛋白β1亚基过表达细胞,再观察p27的表达变化对细胞增殖的影响。结果:整合蛋白β1亚基过表达可以抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖,并将细胞阻滞在细胞周期的G1期。整合蛋白β1亚基过表达可以在蛋白水平上调p27的表达,但并不影响p27的mRNA水平。p27的RNA干扰质粒可明显抑制p27的表达,而且p27表达的下调可以阻止整合蛋白β1亚基过表达所引起的细胞增殖抑制。结论:整合蛋白β1亚基过表达通过上调p27抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖。     

甘草酸二铵对人肝癌细胞SMMC-7721增殖和p53表达的影响

目的探讨甘草酸二铵(DG)对人肝癌细胞SMMC-7721增殖的抑制作用及对p53表达的影响。方法实验分对照组及DG干预组,采用MTT比色法测定细胞的生长情况,检测DG对细胞增殖的抑制作用;RT-PCR检测DG对p53mRNA表达水平的影响;通过Western blot测定DG对p53蛋白表达的影响。结果 DG(0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00mg/L)呈浓度依赖性降低人肝癌细胞存活率,作用48h时IC50值为(4.31±0.21)mg/L;DG可明显抑制肝癌细胞增殖,剂量为4.00、8.00、16.00mg/L时,其抑制率分别为44.52%、66.78%、91.24%;低、中、高浓度组DG(2.0、4.0、8.0mg/L)可明显提高肝癌细胞中p53mRNA及其蛋白表达,并呈浓度依赖性增强。结论 DG对人肝癌细胞SMMC-7721具有明显细胞毒性和抑制增殖作用,其机制可能与上调p53表达有关。     

iASPP干扰RNA促进肝癌细胞凋亡发生的实验研究

目的：观察iASPP基因干扰RNA转染肝癌细胞SMMC-7721后的干扰效果及细胞凋亡的变化。方法：设计特异性siRNA序列,将序列克隆至PGCsilencerTMH1／Neo质粒中,用脂质体将重组子转染至SMMC-7721细胞中,用RT-PCR方法检测iASPP表达的变化,Westernblot检测蛋白表达的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果：iASPP干扰质粒转染SMMC-7721细胞后,iASPP表达下降,凋亡细胞增加。结论：抑制内源性的iASPP,能有效地恢复肝癌细胞SMMC-7721中p53的抑癌功能。     

siRNA靶向沉默fbxl20基因对肝癌SMMC-7721细胞生物学行为的影响

目的:通过沉默fbxl20基因,以观察基因沉默后对SMMC-7721细胞的增殖、迁移和周期分布的影响。方法:通过脂质体Lipofectamine2000介导转染SMMC-7721细胞,靶向fbxl20基因的siRNA片段阻低肝癌SMMC-7721细胞株fbxl20 mR-NA表达。结果:siRNA能有效沉默SMMC-7721细胞fbxl20 mRNA的表达,沉默效率为71.49%。MTT试验实验显示:siRNA转染SMMC-7721细胞后,细胞增殖能力显著降低。Transwell小室和划痕愈合实验表明,fbxl20基因被沉默后,SMMC-7721细胞在迁移能力明显减弱,迁移抑制率高达62.03%。流式细胞术检测细胞周期结果显示:转染48 h后,SMMC-7721实验组细胞G1/G0期比率(81.21%)显著高于阴性对照组(71.49%)和空白对照组(67.90%)。结论:本实验运用RNA干扰技术成功抑制了SMMC-7721细胞中fbxl20基因的表达,并且发现fbxl20基因可能与肝癌细胞的增值和迁移相关。     

Effect of siRNA targeted to fbxl20 on biological behavior of liver cancer SMMC-7721 cells

目的:通过沉默fbxl20基因,以观察基因沉默后对SMMC-7721细胞的增殖、迁移和周期分布的影响.方法:通过脂质体Lipofectamine2000介导转染SMMC-7721细胞,靶向fbxl20基因的siRNA片段阻低肝癌SMMC-7721细胞株fbx120 mR-NA表达.结果:siRNA能有效沉默SMMC-7721细胞fbx120 mRNA的表达,沉默效率为71.49％.MTT试验实验显示:siRNA转染SMMC-7721细胞后,细胞增殖能力显著降低.Transwell小室和划痕愈合实验表明,fbxl20基因被沉默后,SMMC-7721细胞在迁移能力明显减弱,迁移抑制率高达62.03％.流式细胞术检测细胞周期结果显示:转染48 h后,SMMC-7721实验组细胞G1/G0期比率(81.21％)显著高于阴性对照组(71.49％)和空白对照组(67.90％).结论:本实验运用RNA干扰技术成功抑制了SMMC-7721细胞中fbxl20基因的表达,并且发现fbxl20基因可能与肝癌细胞的增值和迁移相关.     

重组腺病毒载体转染p16基因对肝癌细胞的生长抑制作用

目的：通过腺病毒转染p16基因观察对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤作用。方法：克隆人p16基因全长cDNA序列，构建携带p16基因的增殖缺陷型重组腺病毒p16(AdV-p16)，以AdV-p16感染人肝癌SMMC-7721细胞，观察p16基因的表达及其对细胞的生长抑制或杀伤作用。结果：AdV．p16能介导外源基因p16在肝癌SMMC-7721细胞系中高效表达。在感染AdV-p16后随重复感染度(MOI)升高p16基因阳性表达率升高，四甲基偶氮唑蓝染色法(MTT)实验结果表明，SMMC-7721细胞的生长受抑制。结论：腺病毒能够介导p16基因在肝癌细胞中高效表达，促进细胞周期阻滞和诱导肿瘤细胞凋亡。     

miR-1-3p抑制肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移并诱导其凋亡

目的 探讨在肝癌细胞SMMC-7721中微小RNA(miR)-1-3 p的表达变化对其增殖、迁移和凋亡的影响及miR-1-3p的作用机制.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-1-3p和CAAP1的相对表达量;SMMC-7721细胞按miR-1-3p过表达载体(miR-1-3p组)、pcDNA3组、miR-1-3p inhib-itor组和NC inhibitor组(对照组)分别转染,采用qRT-PCR检测转染效果,CCK-8实验检测细胞增殖能力,克隆形成实验观察并比较组间克隆形成率,流式细胞术和Western blot检测细胞凋亡及CAAP1蛋白表达,划痕和Transwell实验观察SMMC-7721迁移和侵袭.利用miRDB、TargetScan、miRanda数据库预测miR-1-3 p靶基因,双荧光素酶报告验证miR-1-3和CAAP1靶向性.结果 miR-1-3p在SMMC-7721细胞中的表达明显低于正常肝细胞LO2,差异有统计学意义(P<0.05);miR-1-3p上调,SMMC-7721增殖、迁移和侵袭能力显著下降,凋亡显著增强,而下调miR-1-3p的表达则作用相反;miR-1-3p和CAAP1具有靶向性;miR-1-3p过表达明显抑制CAAP1表达.结论 miR-1-3p上调可能通过与CAAP1的3'-UTR结合抑制SMMC-7721细胞增殖、侵袭、迁移.     

稳定表达外源性p16基因肝癌SMMC-7721细胞株的建立及鉴定

目的构建稳定表达外源性p16基因的肝癌SMMC-7721细胞株。方法利用脂质体介导的基因转染方法，借助真核质粒表达载体pcDNA3．1( )，将外源性p16基因转染入此基因表达下调的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞中，经G418筛选，建立稳定表达的细胞株，用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)及免疫组织化学法鉴定p16基因的表达，同时对细胞株分泌蛋白进行活性检测。结果转染p16基因的SMMC-7721细胞中可以检测到p16mRNA及蛋白的表达。结论建立稳定表达P16抑癌蛋白的SMMC-7721细胞株有助于研究p16抑癌基因在肝癌发生中的作用。     

外源性p16基因导入对人原发性肝癌细胞迁移能力和VEGF及nm23表达的影响

目的 探讨外源性p16基因导入对人原发性肝癌细胞迁移能力和VEGF及nm23表达的影响。方法 细胞划痕法检测外源性p16基因导入对人肝癌细胞SMMC-7721迁移能力的影响；免疫细胞化学法分析外源性p16基因导入对VEGF表达的影响；Western blotting法分析外源性p16基因导入对nm23表达的影响。结果 外源性p16基因导入人肝癌细胞SMMC-7721后，转染组细胞迁移能力较空载体对照组和空白对照组SMMC-7721细胞明显下降。外源性p16基因导入人肝癌细胞SMMC-7721后，转染组VEGF表达较空载体对照组和空白对照组SMMC-7721细胞减弱。外源性p16基因导入人肝癌细胞SMMC-7721后，转染组nm23表达较空载体对照组和空白对照组SMMC-7721细胞增强。结论 外源性p16基因导入能降低人肝癌细胞SMMC-7721的侵袭和迁移能力。     

选择性阻断异常Wnt信号通路对肝癌细胞生长及侵袭的影响

 目的 构建T细胞转录因子（Tcf）反义RNA真核表达载体以阻断异常Wnt信号通路,探讨其对肝癌细胞生物学特性的影响。方法 利用GeneJammer将反义基因转染人肝癌细胞系SMMC-7721,应用RT-PCR及Western blot方法分别检测转染前后细胞mRNA及蛋白表达差异,通过生长曲线、Transwell小室实验比较转染细胞生长增殖及运动侵袭能力,并进一步用流式细胞仪检测细胞凋亡及生长周期的改变。结果 反义RNA转染降低了Tcf表达,减慢了肝癌细胞的生长速度并抑止其运动侵袭能力。转染反义RNA的肝癌细胞7721-pTas凋亡比例增加［（26.34±2.07）%］,明显高于空载体转染细胞7721-vector［（6.53±1.02）%］和亲本SMMC-7721细胞［（4.33±0.68）%］ （P<0.001）。同时,处于G0-G1期的反义转染细胞比相应亲本SMMC-7721细胞和转染空载体的细胞7721-vector分别高20.24%和20.95%,而S期细胞比亲本细胞SMMC-7721和7721-vector细胞分别低11.8%和11.38%。结论 反义Tcf RNA转染可通过诱导细胞凋亡和阻止细胞周期的进程而抑制肝癌细胞的恶性增殖,提示选择性阻断异常Wnt信号通路有望成为肝癌基因治疗的新途径。     

熊果酸对人肝癌SMMC-7721细胞周期的影响

目的探讨熊果酸（UA）对人肝癌SMMC-7721细胞周期的影响。方法用不同浓度的UA处理SMMC-7721细胞,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期的变化,RT-PCR检测细胞周期相关基因p21、p53及增殖细胞核抗原（PCNA）的表达。结果 UA对SMMC-7721细胞生长有显著的抑制作用,且此作用呈明显的时间、剂量依赖性;UA可以诱导SMMC-7721细胞阻滞在S期,RT-PCR结果显示其能够上调p21和p53基因,下调PCNA基因。结论 UA能明显抑制SMMC-7721细胞的生长,引起细胞周期阻滞;细胞周期阻滞的发生与p21、p53、PCNA基因变化相关。     

人血管内皮生长因子shRNA真核表达载体对肝癌细胞系SMMC-7721的增殖影响

目的:使用VEGF shRNA真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,观察对其增殖影响。方法:使用VEGF shRNA真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,ELISA法检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达量,检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的增殖及细胞的克隆形成能力的变化。结果:VEGF shRNA真核表达载体大部分阻断肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达,转染后细胞周期中,G1期细胞增多,S期细胞减少,细胞增殖能力降低;MTT法观察细胞生长速度变慢,单个细胞的克隆形成能力明显下降。结论:VEGF shRNA真核表达载体可明显抑制SMMC-7721细胞增殖能力,为将VEGF shRNA真核表达载体应用于肝癌的基因治疗提供依据。     

靶向STAT5的siRNA诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡

目的 采用RNA干扰技术阻断STAT5基因的表达,观察其对人肝癌SMMC-7721凋亡的影响.方法 构建3种靶向STAT5的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,采用LipofectamineTM2000转染肝癌细胞SMMC-7721;分别采用半定量RT-PCR、Western blot技术检测转染前后SMMC-7721细胞STAT5 mRNA和蛋白质表达的变化;采用透射电镜技术观察细胞形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 3条靶向STATS的序列特异性的siRNA可以有效地抑制SMMC-7721细胞STATS mRNA和蛋白质表达,STAT5 mRNA表达抑制率分别为70.43%、43.02%、45.07%,STAT5蛋白表达抑制率分别为67.45%、37.36%、41.86%;转染靶向STAT5的siRNA真核表达载体48 h后出现凋亡细胞的典型形态学变化,并诱导25.61%的SMMC-7721细胞发生凋亡.结论 靶向STAT5的siRNA真核表达载体可以有效、特异地阻断SMMC-7721细胞STAT5基因的表达,并能够诱导SMMC-7721细胞凋亡,STAT5 siRNA在人肝癌的基因治疗中可能具有潜在的应用价值.     

LncRNA PURPL调节miR-342-3p/PIK3R1轴对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

目的:探究长链非编码RNA(PURPL)调节微小RNA-342-3p(miR-342-3p)/磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基1(PIK3R1)轴对肝癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:细胞实验：将si-NC、si-PURPL、si-PURPL+inhibitor NC、si-PURPL+miR-342-3p inhibitor分别转染至肝癌细胞Huh-7细胞并命名为si-NC组、si-PURPL组、si-PURPL+inhibitor NC组、si-PURPL+miR-342-3p inhibitor组,未做任何处理的Huh-7细胞记为NC组。双荧光素酶报告基因实验验证LncRNA PURPL、miR-342-3p、PIK3R1的关系;qRT-PCR检测人正常肝细胞系L02和人肝癌细胞系Huh-7中LncRNA PURPL、miR-342-3p表达;Western blot检测L02细胞、Huh-7细胞PIK3R1蛋白水平;MTT法检测Huh-7细胞增殖情况;流式细胞术检测Huh-7细胞凋亡率;Transwell检测Huh-7细胞侵袭数量;划痕试验测定Huh-7细胞迁移。体内实验：构建裸鼠异...     

下调P55PIK基因表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞体外增殖和迁移能力的影响

目的通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制P55PIK基因表达,观察下调P55PIK对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231体外增殖和迁移能力的影响。方法利用脂质体将特异性针对P55PIK的siRNA瞬时转染P55PIK高表达细胞株MDA-MB-231,以转染无关序列siRNA(siRNA-NC)和未转染细胞作为对照。通过Western blot检测其对P55PIK表达的下调效果,MTT法和Transwell实验分别检测MDA-MB-231细胞的增殖和迁移能力。结果 siRNA-P55PIK明显下调MDA-MB-231细胞中P55PIK蛋白的表达;MTT检测显示下调P55PIK后,MDA-MB-231生长明显受到抑制;Transwell实验显示siRNA-P55PIK组穿膜细胞数为(5.2±1.3),显著低于siRNA-NC组(18.6±3.8)和空白对照组(18.4±4.3)(P<0.05)。结论应用RNAi抑制P55PIK基因的表达可抑制MDA-MB-231细胞体外增殖和迁移能力,为乳腺癌的靶向治疗提供了新思路。     

Livin基因特异性siRNA对肝癌细胞增殖、转移的影响

目的 应用PNA干扰技术抑制人肝癌细胞株SMMC-7721中凋亡抑制因子livin表达,研究livin基因对肝癌细胞生物学行为的影响.方法 构建针对hvin β基因的siRNA真核表达栽体pU-livinβ-siRNA,将其表达栽体经脂质体LipofectamineTM2000转染至肝癌细胞株SMMC-7721细胞,采用RT-PCR、Western blot方法检测转染后的SMMC-7721细胞中livin β基因的mRNA和蛋白质表达,了解转染效率.通过流式细胞仪分析细胞周期的分布,并应用Transwell侵袭小室模型观察转染后SMMC-7721细胞恶性生物学行为的变化.结果 在pU-livinβ-siRNA转染后的SMMC-7721细胞中,livinβ基因的mRNA和蛋白质表达显著下降(P＜0.05),细胞周期被阻滞在G1期,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降.结论 通过RNAi技术阻断livin的表达,可抑制SMMC-7721细胞的生长、增殖、迁徙,提示Livin基因在肝癌的发生、发展过程中起重要作用.     

珠子参体外诱导人肝癌细胞凋亡效应及机制研究

目的通过体外实验,观察珠子参诱导人肝癌细胞凋亡效应并初探其分子机制.方法体外细胞培养采用人肝癌细胞株SMMC-7721,分为对照(BL)组、珠子参(PJ)组、二甲基亚砜(DMSO)组及5-FU组,采用光镜及电镜观察肝癌细胞形态和超微结构的改变;流式细胞仪检测肝癌细胞周期和凋亡率;RT-PCR法检测癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、p21表达的变化.结果光镜下观察到珠子参组肿瘤细胞脱壁,有细胞出芽现象等凋亡形态改变;电镜下观察到珠子参组肿瘤细胞出现凋亡小体;珠子参组可见G0-G1期细胞聚积,阻止了细胞向S期的转换,从而干扰了SMMC-7721细胞在细胞周期中的进程,并引起细胞凋亡,DNA组方图上出现典型的凋亡峰(Apo峰),凋亡率达38.34%;RT-PCR半定量分析珠子参能降低癌基因c-myc表达(P＜0.05)和cfos表达(P＞0.05),增高抑癌基因p53、p21表达(P＜0.05).结论珠子参能诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡,部分作用机制可能与阻滞细胞停留在G0-G1,降低癌基因c-myc和c-fos表达,增高抑癌基因p53和p21表达有关.     

RNA干扰突变型p53基因对胃癌SGC7901细胞生物学行为的影响

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术稳定沉默人胃癌SGC7901细胞中的突变型p53基因,观察其对细胞生物学行为的影响。方法:p53小干扰RNA(siRNA)重组质粒用脂质体介导法转染SGC7901细胞,另设未转染组和对照组。RT-PCR和Western blot分别检测p53基因mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖情况及其对奥沙利铂药物敏感性的变化,流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡,平板克隆形成试验、裸鼠移植瘤成瘤实验分析细胞成瘤性变化。结果:p53 siRNA可显著下调SGC7901细胞中突变型p53基因mRNA和蛋白的表达,实验组较未转染组和对照组细胞生长曲线左移。实验组的G0/G1期细胞数较对照组和未转染组分别减少7.4%和6.7%,进入S期的细胞数增加17.2%,奥沙利铂诱导的细胞凋亡率明显降低,未转染组、对照组和实验组细胞的IC50分别为15.88μmol/L、14.32μmol/L和20.34μmol/L。与未转染组和对照组相比,实验组细胞平板克隆形成数量显著增多,裸鼠体内细胞成瘤性增加。结论:p53 siRNA可有效抑制突变型p53基因在胃癌SGC7901细胞中的表达,但利用RNA干扰技术靶向突变型p53基因在胃癌的治疗上尚存在不确定性。     

反义p55PIK慢病毒载体的构建及其对甲状腺癌细胞FTC236增殖的影响

目的:观察反义p55PIK慢病毒对甲状腺癌细胞FTC236的增殖是否有抑制作用?方法:构建含p55PIK反义RNA的慢病毒载体并包装成慢病毒,使之感染FTC236细胞,得到稳定的细胞系后用Western blot方法检测p55PIK蛋白的表达情况,用Real-time PCR检测p55PIK的mRNA的表达情况?同时用四甲基偶氮唑盐(MTT)法及BrdU掺入法检测各组细胞的增殖情况?结果:构建的慢病毒感染甲状腺癌细胞FTC236的效率约为95%; Western blot证明反义p55PIK病毒可以使该细胞的p55PIK蛋白水平降低,mRNA水平降为对照组的(47 ± 8)%(P < 0.01)?MTT法检测发现反义p55PIK慢病毒感染后的FTC236细胞增殖明显受到抑制,增殖率为未处理组的(59 ± 19)%(P < 0.05)?且反义p55PIK慢病毒组的平均BrdU掺入率比未处理组降低了10.64%(P < 0.02)?结论:反义p55PIK病毒可以通过抑制p55PIK蛋白的表达而抑制了FTC236细胞的增殖?