Brevican基因敲除小鼠的制备

目的制备brevican基因敲除小鼠。方法采用ET克隆方法,构建brevican打靶载体。线性化打靶载体,电转化胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),将正确同源重组的ES细胞注射入囊胚腔,生育嵌合体,再交配繁育杂合子及纯合子。PCR法鉴定小鼠的基因型。结果将PGK启动子指导的NEO表达框敲进Bcan第3外显子,敲除第3～8外显子序列,得到打靶载体,上游臂为2.4 kb,下游臂为4.8 kb。基因打靶后,得到双臂均发生正确同源重组的克隆数14个。利用阳性ES细胞克隆注射入囊胚,得到3只嵌合率大于50%的雄鼠,繁育得到6只Brevican-/-纯合子小鼠。结论利用同源重组方法,成功敲除干细胞靶基因,建立Brevican-/-建系小鼠。     

Rtn4-A/B基因敲除小鼠模型的制备

目的通过制备Rtn4-A/B基因敲除小鼠,探索Rtn4-B基因的生物学功能。方法用细菌人工染色体(BAC)载体构建Rtn4-A/B基因打靶载体并使其线性化,通过电转化法将其转入129SvEv品系雄性小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)。将正确同源重组的ES细胞注射入C57BL/6J小鼠囊胚腔,繁育出嵌合体小鼠后,进一步繁殖以获得杂合子小鼠。抽提小鼠尾尖组织DNA,采用PCR法鉴定小鼠的基因型。结果基因打靶后,得到14个发生双臂正确同源重组ES细胞克隆。利用阳性ES细胞克隆进行囊胚内显微注射,得到5只嵌合率大于50%的雄鼠,最终繁育得到4只Rtn4-A+/-B+/-杂合子小鼠。结论利用ES细胞基因打靶、同源重组等方法,成功获得Rtn4-A/B基因敲除杂合子小鼠。     

线粒体钾通道Kcna3基因敲除小鼠初步制备

目的为观察线粒体钾通道在缺血再灌注(I/R)心肌损伤中的作用,探讨其和心衰的关系,制备基因敲除小鼠模型以探讨钾通道单分子作用。方法用BAC载体制备同源重组载体,对129小鼠胚胎干细胞(ES)打靶筛选后,显微注射至C57BL/6J小鼠囊胚获得嵌合小鼠。经尾基因组DNA PCR鉴定和测序,鉴别杂合子小鼠。结果在40只灰色小鼠中初步鉴定出Kcna3+/-基因型F1小鼠8只。结论在国内首先用ES同源重组基因打靶方法,成功育成Kcna3基因敲除鼠杂合子,为下一步获得纯合子鼠奠定了基础。对进一步用钾离子通道病模型研究心肌保护病理生理机制和药物筛选具重要意义。     

瞬时性受体电位通道香草酸受体亚型6基因敲除小鼠模型的建立

目的 建立Trpv6基因剔除小鼠模型,为在体研究Trpv6的生物学功能及其与骨代谢关系创造条件。 方法 从Ensembl数据库中获得小鼠Trpv6基因组序列。设计基因剔除策略,构建基因剔除载体pBR322-MK-Trpv6。以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得双抗性克隆。PCR鉴定出正确同源重组的胚胎多能干细胞（ES细胞）克隆。将正确同源重组的ES细胞注射到C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合体小鼠。挑选嵌合率在50%的雄鼠与C57BL/6J小鼠交配,获得的灰鼠,PCR鉴定为杂合子小鼠。杂合子小鼠交配后获得纯合子小鼠。 结果 成功构建了打靶载体pBR322-MK-Trpv6。电穿孔后,共获得24个正确同源重组的克隆,同源重组效率为25%。同源重组的克隆经显微注射后,共获得4只嵌合率大于50%的雄鼠。嵌合鼠与野生型C57BL/6J交配,获得57只来源于ES细胞的灰鼠,PCR鉴定证实17只为杂合子小鼠,阳性率为33.3％。杂合子小鼠交配获得纯合子小鼠。经Western印迹证实纯合子小鼠无Trpv6蛋白的表达。 结论 已成功建立了Trpv6基因剔除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象。     

利钠肽受体-A基因敲除小鼠的繁育与鉴定

目的:繁殖和鉴定NPR-A基因敲除小鼠.方法:将所引进的雄性野生型和雌性NPR-A基因敲除杂合子小鼠进行交配繁殖,可以得到野生子、杂合子及纯合子3种基因型,提取每只小鼠尾部基因组DNA,用PCR法进行基因型鉴定.结果:NPR-A基因敲除小鼠的饲养和繁殖均获得成功,成功获得了较多的NPR-A基因敲除纯合子小鼠.结论:雌、雄性NPR-A基因敲除杂合子小鼠交配是繁育NPR-A基因敲除纯合子子鼠的较好方法;用PCR方法能够精确鉴定NPR-A基因敲除纯合子子鼠.     

HIF-1α条件性基因敲除嵌合体小鼠的获得

目的应用Cre/loxP系统建立HIF-1α条件性基因敲除小鼠模型。方法电击法将构建好的HIF-1α条件性基因敲除载体转染入小鼠ES细胞,用G418与Ganciclovir对转染的ES细胞进行正负筛选,经Southern杂交鉴定得到阳性ES细胞克隆后,将已发生正确重组的ES细胞显微注射入小鼠囊胚腔,对子代鼠进行基因型鉴定。结果经G418与Gan-ciclovir筛选培养得到490个阳性克隆,用5′端探针进行Southern杂交鉴定获得1株发生同源重组的ES细胞克隆,经显微注射,得到5只由基因敲除ES细胞和供体囊胚细胞共同发育而来的嵌合体小鼠。结论成功得到基于Cre/loxP系统的HIF-1α条件性基因敲除嵌合体小鼠模型。     

低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型的构建

目的构建低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型。方法将Cchl1a3-knock-in打靶载体电转染ES细胞,经过G418和Ganciclovoir筛选阳性ES细胞克隆并用PCR和DNA测序法鉴定。将阳性ES克隆注射到小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠。通过杂交获得的杂合子小鼠与FLP小鼠交配繁育获得去neo杂合子小鼠,并用PCR和DNA测序进行鉴定。将去neo杂合子小鼠交配得到纯合子后代,进行生长发育等方面的观察。结果打靶载体成功转染ES细胞,PCR和DNA测序法证实9个ES细胞克隆发生正确的同源重组。通过显微注射获得7只嵌合体小鼠。将嵌合体小鼠交配繁育的杂合子小鼠和FLP小鼠交配获得9只去neo杂合子小鼠,最终得到15只去neo纯合子小鼠。该小鼠在发育至性成熟阶段,精神、饮食及活动状态良好,但是在4个月龄时逐渐出现脱毛,皮肤破溃甚至死亡。结论成功构建Cchl1a3基因R528H突变的纯合子小鼠,为研究人类CACNA1S基因功能和阐明低钾型周期性麻痹发生的分子机制奠定了基础。     

Caveolin-1基因敲除小鼠子代基因型鉴定及繁育方法研究

目的 探讨小凹蛋白-1（Caveolin-1）基因敲除小鼠的鉴定方法与最优繁育方式，为深入研究Caveolin-1在脑缺血损伤修复中的作用提供理想的动物模型。方法 将引进的Caveolin-1基因敲除小鼠饲养于SPF级实验室，煮沸裂解法提取鼠尾组织基因组DNA，根据美国杰克逊实验室（Jackson Laboratory）提供的引物序列进行PCR反应检测其基因型，采用Caveolin-1+/-杂合子互交、杂合子与Caveolin-1-/-纯合子杂交（正交及反交）、纯合子互交4种不同的交配方式，观察亲代小鼠的受孕率、子代小鼠的外形特征及纯合率。结果 琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物分子量大小约200bp和661bp，与预期的目的基因片段分子量大小一致，成功鉴定了Caveolin-1基因敲除小鼠的不同基因型；不同交配方式的繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律，且雌性、雄性Caveolin-1-/-纯合鼠具有一定的繁殖能力，三种不同基因型小鼠的外形特征无明显差异。结论 煮沸裂解法提取基因组DNA、PCR法能够快速可靠鉴定Caveolin-1基因敲除小鼠的基因型；Caveolin-1杂合子小鼠互交与纯合子互交相结合的繁育方法可能是短期内获得足量纯合子子鼠与同源野生子鼠的较好方式。     

SRC-3基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定

目的繁殖和鉴定SRC-3基因敲除小鼠.方法将所引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功后其子代中将会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型,提取每只小鼠尾部基因组DNA,用PCR法进行鉴定,一旦获得雄性纯合子,就将其与雌性杂合子交配,依照孟德尔遗传定律就有可能获得较多的基因敲除纯合子小鼠.结果SRC-3杂合子小鼠的饲养和繁殖均获得成功,亦获得了较多的基因敲除纯合子小鼠.结论正确的饲养繁殖以及鉴定方法是从杂合子中获得SRC-3基因敲除纯合子小鼠的有效途径.     

水通道蛋白3基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定

目的: 繁殖和鉴定水通道蛋白3(AQP-3)基因敲除小鼠。方法: 将引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功后其子代中将会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型,提取每种基因型小鼠尾部基因组DNA,用PCR法进行鉴定,将其雄性纯合子与雌性杂合子交配,依照孟德尔遗传定律就有可能获得较多的基因敲除纯合子小鼠。结果: AQP-3杂合子小鼠的繁殖和饲养均获得成功,亦获得了较多的基因敲除纯合子小鼠。结论: 正确的饲养繁殖以及鉴定方法是从杂合子中获得AQP-3基因敲除纯合子小鼠的有效途径。     

Trp53基因剔除小鼠的制备及其在药物致癌性评价中的应用

目的建立Trp53基因剔除小鼠模型。方法本研究拟通过基因工程技术建立Trp53基因剔除小鼠模型,通过RT—PCR、Western—blot等技术检测野生型、杂合子、纯合子小鼠中Trp53基因的表达;观察三种基因型小鼠自发肿瘤情况并进行病理分析;以N．甲基亚硝基脲（MNU）为致癌剂,探索该模型用于药物致癌性评价的可行性。结果DNA、RNA及蛋白水平的研究证实,已成功获得Trp53基因剔除小鼠模型。初步的表型分析显示：Trp53基因纯合缺失小鼠自出生13周起陆续发生肿瘤,至36周时所有观察纯合小鼠均死于肿瘤,以恶性胸腺淋巴瘤为主（60％）。与野生型小鼠相比,基因杂合缺失小鼠对致癌剂的敏感性显著提升,杂合小鼠经75mg／kg体重的N一甲基亚硝基脲（MNU）诱导,90％的小鼠发生肿瘤,其中86％为恶性胸腺淋巴瘤,而野生小鼠经药物诱导后只有60％发生肿瘤。腹腔注射枸橼酸缓冲液的80只对照组小鼠均未观察到肿瘤的发生。结论这一模型的建立为Trp53基因功能研究和药物致癌性评价提供了理想的动物模型。     

Kir6.2构成的ATP敏感性钾通道在苯环己哌啶诱导的精神分裂症阴性症状中的作用（英文）

目的：ATP敏感性钾（K-ATP）通道对多巴胺和谷氨酸能传导具有重要的调节作用,而多巴胺和谷氨酸能传导之间相互作用是精神分裂症病理机制的重要神经化学基础。因此,我们应用Kir6.2（主要表达在神经元的K-ATP亚基）敲除小鼠,通过苯环己哌啶诱导强迫游泳不动时间的延长,模拟精神分裂症的阴性症状,从而研究K-ATP通道在其中的作用。方法：连续注射14d苯环己哌啶（10 mg.kg-1,i.p.）后,通过观察强迫游泳实验中小鼠不动时间的长短,评价Kir6.2敲除对精神分裂症阴性症状中抑郁样表现的影响;应用高效液相色谱联合电化学检测法观察纹状体多巴胺及其代谢产物、多巴胺更新率的改变;应用溴脱氧尿嘧啶核苷插入法观察海马齿状回颗粒下区神经干细胞增殖的改变;应用Western blot技术观察磷酸化Akt水平的变化。结果：Kir6.2敲除取消了苯环己哌啶引起的强迫游泳不动时间的延长。不仅如此,Kir6.2敲除还抑制了苯环己哌啶诱导的纹状体多巴胺更新率的增加、海马齿状回颗粒下区神经干细胞增殖的减弱,以及磷酸化Akt水平升高。结论：Kir6.2组成的K-ATP通道参与了苯环己哌啶诱导的精神分裂症阴性症状,阻断K-ATP通道有望成为治疗精神分裂症的新策略。     

动态MRI评价广泛性子宫切除术后肛提肌改变的临床价值研究

背景　已有报道显示广泛性子宫切除术后盆底支持结构改变与术后盆底功能障碍性疾病密切相关,但目前就术后盆底支持主要结构--肛提肌发生了何种改变尚无报道。目的　采用动态MRI及三维重建的方法观察广泛性子宫切除术前后肛提肌的形态变化特点,为临床了解术后盆底障碍性疾病（PFD）提供理论依据。方法　按照研究标准纳入2015年9月-2017年9月就诊于南方医科大学南方医院的ⅠA2~ⅡA2期宫颈鳞癌并行广泛性子宫切除术的患者33例,收集并对比其术前2周内和术后1年静态和最大屏气用力状态下MRI数据,三维重建出骨盆及肛提肌,利用二维MRI图像观察髂尾肌、耻骨直肠肌和肛提肌耻骨联合附着处形态的变化,利用三维模型检测肛提肌体积、肛提肌板角度、肛提肌裂孔横径和前后径、耻骨肌耻骨附着处距耻骨联合下缘距离。结果　术后11例（33.3%）髂尾肌发生“漏斗状”改变,10例（30.3%）耻骨直肠肌形态发生“U型”“O型”“不规则型”改变,19例（57.6%）肛提肌耻骨附着处发生“波浪形”和“缺损”改变。三维模型显示,术后肛提肌体积缩小了3.81 cm2,肛提肌板角度增大了4.13°,耻骨肌耻骨附着处距耻骨联合下缘距离增大0.94 mm,肛提肌裂孔横径、前后径无明显变化。结论　广泛性子宫切除术后部分与肛提肌支持力密切相关的形态和参数发生改变,术后肛提肌发生了趋向于盆底松弛改变的形态变化,可为临床早期盆底康复治疗提供理论依据。     

序言

目的 建立稳定的精原干细胞中Pten基因敲除的小鼠模型,对表型进行初步观察,为研究Pten在精原干细胞中的作用及相关的机制奠定基础.方法 采用Cre/Loxp系统建立Pten在精原干细胞中条件性敲除的小鼠模型,以同窝正常雄鼠作为对照,通过解剖、HE染色等方法对小鼠的表型进行观察,并通过免疫荧光检测精原干细胞标记分子早幼粒细胞白血病锌指蛋白（Plzf）的表达并对免疫荧光染色中的阳性细胞进行统计.结果 与对照组相比,Pten敲除鼠在出生后出现发育迟缓现象,13d左右个体死亡,睾丸大小未受影响,但进一步的细胞计数统计发现Pten敲除后Plzf阳性细胞数目和对照组相比明显减少（P＜0.01）.结论 成功建立精原干细胞中Pten基因敲除的小鼠模型,并且Pten可能通过下调Plzf的表达影响精原干细胞的发育,这为进一步探讨精原干细胞复杂的调控网络提供了一定的实验依据和思路.     

PLCε基因敲除小鼠移植性肝癌模型的建立与分析

目的利用PLCε基因敲除小鼠建立移植性肝癌动物模型,以探讨PLCε基因在肝肿瘤生长发育过程中的作用。方法选取PLCε+/+小鼠15只为对照组,选取PLCε+/+(野生型)和PLCε-/-(敲基因型)小鼠各15只为模型组I和II,沿腹中线开腹后将H22细胞接种到模型组小鼠肝脏实质内,对照组注射生理盐水。于注射后第15天行剖腹探查,观察各组成瘤率及肿瘤体积,并进行肿瘤病理学分析。结果各组小鼠的存活率均为100%。模型组I肿瘤移植成功率为100%,肿瘤体积平均为(65.21±5.25)mm3。模型组II的肿瘤移植成功率为53.3%,肿瘤体积平均为(23.46±3.47)mm3。模型组I的肿瘤平均体积明显大于模型组II(P0.05)。模型I组和II组病理检查均证实为原位肝细胞瘤。结论成功建立了PLCε敲基因小鼠移植性肝癌动物模型,验证了PLCε敲基因小鼠具有抑制肝肿瘤生长的特性。     

Pax-8基因敲除小鼠心肌细胞中差异表达的基因的研究

目的研究Pax-8基因敲除小鼠心肌细胞中差异表达的基因。方法利用基因芯片技术初筛在Pax-8基因敲除纯合子小鼠（Pax-8-/-）和杂合子小鼠（Pax-8＋/-）心肌组织中差异表达的基因,运用半定量RT- PCR检验初筛结果,并运用荧光实时定量PCR确定初筛所得的差异表达的基因在Pax-8基因敲除纯合子、杂合子以及野生型小鼠（Pax-8＋/＋）心肌组织中的表达情况。结果基因Bcl2l14、Fgf-6、Lck、Nr4a1以及Tcf7在Pax-8-/-中的表达分别是其在Pax-8＋/-中表达的2.07±0.08、1.13±0.01、1.30±0.01、1.53±0.08及0.75±0.03倍（均P＜0.01）。是在Pax-8＋/＋中表达的2.23±0.16、1.67±0.05、1.77±0.21、4.8±0.35及0.9±0.04倍（P＜0.01或0.05）。结论 Bcl2l14、Fgf-6、Lck、Nr4a1以及Tcf7上述5个基因在Pax-8基因敲除的心肌细胞中差异表达,参与Pax-8基因敲除小鼠的一系列心脏病理生理变化。     

髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠的构建及应用

目的:通过Cre-loxP 基因敲除系统特异性敲除髓系SOCS3 基因,构建早期髓系来源抑制细胞（eMDSCs）高浸润荷瘤鼠模 型。方法: 通过将SOCS3fl/-小鼠与Lyz2-Cre 小鼠杂交繁育, 获得髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠,PCR 法鉴定小鼠基因型, Western 印迹验证基因敲除效果, 流式细胞术检测髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠骨髓中eMDSCs 比例及其对T 细胞的抑制 作用, 并在该小鼠基础上分别构建乳腺癌、肺癌和黑色素瘤3 种eMDSCs 高浸润荷瘤鼠模型, 流式细胞术检测肿瘤组织中 eMDSCs 浸润情况。结果:PCR 鉴定和Western印迹检测证实髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠构建成功,流式细胞术结果表明 髓系SOCS3 基因敲除小鼠骨髓中eMDSCs 比例显著升高（t=17.94,P＜0.001）,且该群eMDSCs 抑制T 细胞增殖（t=14.21, P＜0.001）、促进T 细胞凋亡（t=13.53,P＜0.001）。在黑色素瘤、乳腺癌、肺癌3 种髓系特异性SOCS3 基因敲除荷瘤鼠的肿瘤组织 中eMDSCs 数量显著增加（t=24.14、24.56、14.93,均P＜0.001）。结论:通过髓系特异性SOCS3敲除可成功构建eMDSCs 高浸润荷 瘤鼠模型。     

利用基因打靶技术构建血管内皮特异性Stk24/25双基因敲除小鼠

目的:构建Stk24/Stk25双基因敲除小鼠模型,并对其基因型及敲除效率进行测定。方法:使用基因打靶技术构建基因敲除小鼠,利用PCR及凝胶电泳技术对亲代及子代小鼠进行基因型鉴定;并利用ＲT-qPCＲ测定目的基因在小脑血管内皮细胞中mＲNA转录水平的表达情况。结果:通过PCR技术成功检测出小鼠子代基因型Cdh5cre+/Stk24fl/fl/Stk25fl/fl纯合子小鼠,经鉴定血管内皮基因敲除Stk24、Stk25后表达量分别下降了27%（t=2.874,P=0.0207）和30%（t=17.21,P<0.001）。结论:采用基因打靶技术成功构建了Stk24/Stk25双基因敲除小鼠。     

一种新的皮肤黑色素细胞及肥大细胞缺乏的小鼠模型

目的分析Kit基因突变的W-4Bao白斑小鼠的表型特征。方法遗传试验观察突变小鼠的大体表型,多巴染色法观察黑色素细胞,甲苯胺蓝染色法观察肥大细胞。结果突变基因杂合子小鼠腹部三角形白斑,肢端、尾端白化;皮肤组织内黑色素细胞及肥大细胞无明显差异。突变纯合子小鼠全身被毛白色,眼周、耳廓、背部局部被毛末端灰黑色,黑眼;皮肤组织内多巴阳性黑色素细胞、肥大细胞较对照组明显减少几近完全缺失。结论Kit基因错义突变不仅导致了W-4Bao杂合子及纯合子小鼠黑色素细胞缺乏,同时影响了肥大细胞的发育。     

腰椎间盘突出症术中神经根鞘内及其周围用药疗效研究

背景　传统的骶管注射或术中使用神经阻滞药物是治疗腰椎间盘突出症（LDH）或术后早期炎性水肿引起的神经根性疼痛的有效方法。然而,用于神经根鞘内及其周围的神经阻滞药物作用时间短,疗效有限,仍有进一步研究的必要性。目的　观察LDH术中神经根鞘内及其周围用药的临床疗效。方法　根据纳入与排除标准,选取2015年3月-2018年3月于广西中医药大学第一附属医院行椎板开窗髓核摘除、神经根管扩大术治疗的LDH患者90例。采用随机数字表法将患者分为A组（n=30,给予神经根鞘内及其周围用药）、B组（n=30,给予神经根鞘内用药）、C组（n=30,不做特殊处理）。收集患者一般资料、术后卧床时间、术后住院时间、术后神经根性疼痛情况;记录术前及术后第1、3、6、10天视觉模拟评分法（VAS）评分,第3、6、10天日本骨科学会治疗评估评分法（JOA）评分;观察不良反应发生情况。结果　B组、C组术后卧床时间、术后住院时间长于A组,术后神经根性疼痛发生率高于A组（P<0.05）;C组术后卧床时间、术后住院时间长于B组,术后神经根性疼痛发生率高于B组（P<0.05）。干预方式与时间在VAS评分上存在交互作用（P<0.05）;干预方式、时间在VAS评分上主效应显著（P<0.05）。B组、C组术后第1、3、6、10天VAS评分高于A组（P<0.05）;C组术后第1、3、6、10天VAS评分高于B组（P<0.05）。A组、B组、C组术后第1、3、6、10天VAS评分均低于本组术前（P<0.05）。干预方式与时间在JOA评分上存在交互作用（P<0.05）;干预方式、时间在患者JOA评分上主效应显著（P<0.05）。B组、C组术后第6、10天JOA评分低于A组（P<0.05）;C组术后第6、10天JOA评分低于B组（P<0.05）。A组、B组、C组术后第3、6、10天JOA评分均高于本组术前（P<0.05）。3组患者均无明显不良反应。结论　LDH术中神经根鞘内及其周围用药可能通过提高药物的作用时间来延长镇痛时间,促进LDH术后早期恢复,减轻术后神经根性疼痛,减少卧床时间及住院时间,提高术后疗效。