强力霉素对糖尿病小鼠肌肉转染人胰岛素因的调控作用

[目的]研究强力霉素对糖尿病小鼠肌肉转染人胰岛素基因表达的调控作用.[方法]构建prTA - tet4 -rhINS质粒;以链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导昆明小鼠成糖尿病模型.采用电穿孔法转移质粒prTA - tet4 -rhINS,通过强力霉素(doxcycline,Dox)水给药/撤除以评价...     

内脂素基因过表达对胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性的影响

目的 探讨内脂素基因过表达对高脂诱导胰岛素抵抗(IR)大鼠胰岛素敏感性的影响.方法 构建大鼠内脂素基因真核表达质粒,并用该质粒转染高脂喂养诱导的IR大鼠模型.在转染前后采用两次高胰岛素-正糖钳夹技术评价大鼠胰岛素敏感性的变化.结果 成功构建了内脂素真核表达载体pcDNA3.1内脂素.实验组大鼠在pcDNA3.1内脂素质粒注射后3 d血浆内脂素水平较注射前明显升高(2.19 ±0.36 vs 0.98±0.27,P＜0.01);在两次胰岛素钳夹中,pcDNA3.1内脂素质粒注射后葡萄糖输注率较注射前明显升高[(32.6 ±1.2)mg·kg-1·min-1 vs(24.0±1.2)mg·kg-1·min-1,P＜0.01];总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇则较质粒注射前明显降低[(2.36±0.22)mmol/Lvs(1.60±0.21)mmol/L和(1.41±0.24)mmol/L vs(0.88±0.11)mmol/L,均P＜0.05];在转染前后基础血糖和胰岛素水平无明显变化.结论 内脂素质粒转染使IR大鼠血浆内脂素水平升高,胰岛素敏感性增强.     

雷帕霉素逆转胰岛素抵抗的动物实验

目的探讨新型免疫抑制剂雷帕霉素对胰岛素抵抗的作用及可能机制。方法利用肥胖胰岛素抵抗动物模型(obob小鼠),观察雷帕霉素对小鼠空腹血糖和胰岛素水平的影响,研究雷帕霉素对小鼠胰岛素抵抗的治疗作用及对循环细胞因子IL-1β,IL-6和TNF-α水平的影响,探讨雷帕霉素的可能作用机制。结果雷帕霉素治疗后小鼠的空腹血糖水平明显下降,与对照组比较有统计学意义,空腹胰岛素水平也下降,曲线下面积的比较差异有显著(8.90±0.95vs5.27±0.73,P<0.05);循环中TNF-α[(31.7±3.4)vs(37.7±1.1)pg/ml]和IL-1β[(18.0±3.2)vs(29.5±1.1)pg/ml]水平虽也下降,但差异无显著性,与之对应,IL-6[(46.2±9.8)vs(85.6±5.3)pg/ml]的水平明显降低(P<0.05)。结论雷帕霉素能提高obob小鼠胰岛素敏感性,有治疗改善肥胖诱导的胰岛素抵抗的作用。     

壳聚糖介导人胰岛素基因在糖尿病鼠体内外表达的研究

目的研究壳聚糖介导人胰岛素基因在糖尿病鼠体内外转染及表达。方法采用壳聚糖体外转染鼠成纤维细胞,对转染后72h的细胞应用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达。27只糖尿病大鼠随机分为3组(pCMV.INS组、pCMV组、生理盐水组),体内转染通过尾静脉注射糖尿病大鼠,检测空腹血糖和胰岛素。结果pCMV转染细胞无胰岛素表达,pCMV.INS转染大约10%的细胞有胰岛素表达;pCMV.INS转染大鼠血浆胰岛素显著高于生理盐水对照组(P<0.01)和pCMV对照组(P<0.01)。结论人胰岛素基因可通过壳聚糖直接转染至糖尿病大鼠体内发挥治疗作用及壳聚糖可能是一种很有前途的基因载体。     

持续皮下胰岛素输注在糖尿病患者围手术期应用价值的评估

目的:评估持续皮下输注胰岛素(CSII)在围手术期糖尿病患者中的降糖效果和医疗经济学指标.方法:胰岛素治疗的围手术期糖尿病患者87例,随机分为CSII组(46例,T1 DM 2例,T2 DM 44例)和胰岛素分次皮下注射(MSII)组(41例,T1 DM 3例,T2 DM 38例);2组靶血糖值为3.9～7.9 mmol/L.观察2组的血糖达标时间、术前准备时间、住院日、术前血糖达标率、治疗3d时血糖水平以及术前降糖费用和住院总费用.结果:CSII和MSII 2组间的血糖达标时间(d,2.2±1.6 vs 8.5±4.8, P＜0.01),术前准备时间(d,4.6±3.2 vs 11.8±6.8, P＜0.01),住院日(d, 19.6±9.4 vs 26.2±10.0, P＜0.01),术前血糖达标率(85.4% vs 53.2%, P＜0.01)、治疗3d时空腹血糖水平[(7.5±1.8) mmol/L vs (10.5±2.6) mmol/L, P＜0.01],CSII组在降糖方面明显优于MSII组,CSII组的术前降糖费用高于MSII组(元,867.9±574.4 vs 497.9±283.6, P＜0.01),但2组间的住院总费用(元,25007±18048 vs 24919±21617, P＞0.05)无差异.结论:糖尿病患者围手术期进行持续皮下胰岛素输注,在不增加住院总费用的基础上可带来更好的血糖控制,并缩短住院时间.     

有氧运动对2型糖尿病小鼠血糖及血清胰岛素影响的研究

目的 探讨不同有氧运动方式对2型糖尿病小鼠血糖和血清胰岛素的影响.方法 将40只C57BL/6J小鼠分为4组:正常组(A组),糖尿病游泳1组(B组),糖尿病游泳2组(C组),糖尿病非运动组(D组),每组10只.高脂饲料饲养小鼠4周,B组、C组和D组小鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ),获得糖尿病模型小鼠.B组每日游泳1次,连续游泳90min;C组每日游泳2次,每次45min;B组、C组游泳时间为6周,A组和D组不做游泳运动.血糖仪检测血糖浓度,碘[125I]胰岛素放射免疫分析血清胰岛素的变化.结果 C组血糖浓度明显低于B组和D组[(14.64±2.69)mmol/L,(19.22±3.28)mmol/L,(27.35±2.88)mmol/L,P<0.05];C组血清胰岛素明显低于D组[(36.95±14.66)mU/L,(55.24±18.42) mU/L,P<0.05].结论 每日2次各45 min的有氧运动对改善2型糖尿病小鼠血糖及胰岛素水平具有一定疗效.     

转染绿色荧光蛋白-胰岛素融合基因的小鼠骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病小鼠

目的:构建含增强绿色荧光蛋白(EGFP)及胰岛素融合基因的重组质粒,转染小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察转染融合基因后BMSCs移植治疗糖尿病模型小鼠的治疗效果。方法:应用重叠延伸PCR技术合成insulin-IRES-EGFP和IRES-EGFP两段序列,分别克隆至逆转录病毒载体pMSCV中,经过包装细胞PT67的包装后转染小鼠BMSCs。荧光显微镜观察转染后EGFP的表达；RT-PCR法检测转染后胰岛素基因的表达。将转染了两种质粒的BMSCs培养后分别植入两组糖尿病模型小鼠体内,观察各组受体鼠血糖及体质量等指标的变化,并以正常对照组小鼠作对照。结果:成功构建重组质粒pMSCV-insulin-IRES-EGFP、pMSCV-IRES-EGFP;倒置荧光显微镜下观察到转染后的BMSCs发出稳定的绿色荧光信号。转染了pMSCV-insulin-IRES-EGFP的BMSCs能稳定表达外源性胰岛素基因,转染后小鼠血糖明显低于转染pMSCV-IRES-EGFP组(P<0.05),但仍高于正常对照组(P<0.05)；转染后35 d体质量明显高于转染pMSCV-IRES-EGFP组(P<0.05)。结论:重构的insulin-EGFP载体能够起到良好的示踪作用,且EGFP的表达不影响胰岛素基因的表达；转染融合基因的小鼠BMSCs移植治疗糖尿病小鼠可以部分缓解小鼠糖尿病症状。     

Transfection of HBV X gene into human liver cell line L02 and its effect on CⅡTAand HLA-DR expression

目的 探讨脂质体和电穿孔法在HBV X基因转染L02细胞中的差别及X基因蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响.方法 构建HBV X基因重组表达质粒,通过电穿孔和脂质体法转染人正常肝细胞L02细胞,以绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)表达水平评价转染效率,流式细胞技术检测L02细胞HBV X蛋白的表达水平.RT-PCR、流式细胞技术及western-blot分析L02细胞、转染空载体以及转染HBV X基因重组表达质粒的L02细胞CⅡTA和HLA-DR的表达差别.结果 采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000的转染效率为(6.4±3.5)％,显著低于电穿孔法(41.46±5.8)％,P＜0.01.脂质体法转染的L02细胞HBV X蛋白表达水平为(5.1±3.9)％,显著低于电穿孔方法(37.5±4.1)％表达,P＜0.01.转染了HBV X基因重组表达质粒的L02细胞检测到CⅡTA和HLA-DR mRNA和蛋白表达,而L02细胞本身及转染空载体的L02细胞未检测到CⅡTA和HLA-DR的表达.结论 HBV X基因真核表达载体pHBx-IRES2 -EGFP通过电穿孔法转染L02细胞较脂质体法有明显较高的转染效率和更高的目的基因的表达,HBV X基因诱导了L02细胞中CⅡTA和HLA-DR的表达.     

双链腺相关病毒介导表达Exendin-4治疗糖尿病大鼠的研究

目的 构建、鉴定自身互补双链DNA的腺相关病毒(scAAV)重组载体,使其分泌表达Exendin-4,检测其转导效率并观察在糖尿病大鼠模型中的治疗作用.方法 应用基因工程方法改建穿梭质粒pSSHG-CMV,插入外源性基因Exendin-4,构建重组scAAV载体,感染HEK293细胞,ELISA检测转染NIH3T3细胞上清Exendin-4滴度,链佐霉素诱导20只6周龄体质量180 ～220 g SD成年雄性大鼠为糖尿病鼠模型,逆向注射重组scAAV于糖尿病大鼠颌下腺,检测其血糖及胰岛素分泌水平.结果 重组scpSSHG/exn4可有效包装和复制,病毒滴度为2.5×1011 pfu/mL,转染细胞上清分泌Exendin-4浓度可达到4.53 ng/mL,scAAV治疗组血糖浓度在2、4周及8周均低于对照组[分别为(639.17±27.89) vs(396.00±34.00),(657.02 ±39.87) vs (315.62±42.56),(215.6±24.7) vs (458.6±19.7) mg/dL],胰岛素浓度均高于对照组[分别为(156.8 ±24.5)vs(535.9±35.6),(236.5±12.3) vs (495.3 ±18.6),(620.43 ±46.90) vs (381.56±21.78) pg/mL],二者比较有显著统计学差异(P＜0.05).结论 成功构建重组双链腺伴病毒scAAV-Ex-4,具有高效转导能力,对糖尿病大鼠模型具有控制血糖及增加胰岛素分泌作用.     

转染adiponectin基因对C2C12肌细胞糖原合成和葡萄糖氧化的影响

[目的]研究adiponectin对C2C12肌细胞糖原合成和葡萄糖氧化的影响.[方法]用阳离子脂质体介导转染和随后G418筛选建立稳定转染小鼠adiponectin cDNA真核表达质粒(pcDNA3.0-mad)及空载pcD-NA3.0的C2C12细胞株并鉴定.C2C12肌细胞糖代谢实验分对照组、载体组和pcDNA3.0-mad(mad)组共3组进行,每组又分0,0.5 nmol/L,5 nmol/L,100 nmol/L胰岛素刺激4个亚组.通过液闪测定细胞合成的糖原中14C的放射活性和氧化产生的14CO2分别检测肌细胞的糖原合成和葡萄糖氧化情况.[结果]Western blot和免疫组化检测证实mad组细胞表达adiponectin蛋白.Mad组葡萄糖氧化量随胰岛素浓度增加的速率较其他两组快,对照,载体和mad组线性回归系数分别为23.34,23.23和26.06.mad组C2C12肌细胞基础状态下和胰岛素刺激下的葡萄糖氧化和糖原合成与其它两组无显著性差异(P＞0.05).[结论]转染adiponectin基因对C2C12肌细胞葡萄糖氧化和糖原合成无显著性影响.     

不同转移倾向肿瘤亚株细胞内的微核观察

为了探讨恶性肿瘤转移与微核现象间的关系,本实验首次运用微核试验(MT)检测了小鼠腹水型肝癌(N_(22))及其肺转移倾向亚株(H_(22)SP_(10))、淋巴结转移倾向亚株(N_(22)SL_(10))。小鼠子宫颈癌(U_(14))及其肺转移倾向亚株(U_(14)AP_(11))瘤细胞内的微核。比较了经活体筛选的上述亚株与未经筛选的原瘤株的微核细胞率(MNF)、总微核率,结果上述两项指标H_(22)SP_(10)及H_(22)SL_(10)均显著高于H_(22)(P值分别为<0.002、<0.005;<0.005、<0.001);U_(14)AP_(11)也显著高于U_(14)(P分别为<0.001、<0.001),而H_(22)SL_(10)与H_(22)SP_(10)(P>0.05、>0.05)。它表明在异质性N_(22)及U_(14)细胞群体中具有器官倾向性转移的细胞染色体畸变较重,可能为肿瘤演进的结果。     

双胸蚯蚓溶栓酶对沙鼠缺血额叶皮质超微结构及离子的影响

采用结扎沙土鼠双颈总动脉20分钟后恢复血流制做脑缺血再灌注模型。应用透射电镜对额叶皮质超微结构进行观察,并采用电镜能谱技术对神经元随机检测Na~十Ca~卄等离子含量。结果表明,缺血的对照组神经元Na~十明显增高达16.43,而缺血后腹腔注入双胸蚯蚓溶栓酶的实验组显著下降为13.02,接近正常组的11.47;Ca~卄正常组为1.03,对照组增高达3.81,而实验组下降为2.44。同时实验组超微结构的损伤性改变明显轻于对照组。     

大豆皂甙和人参茎叶皂甙对糖尿病大鼠血SOD和LPO的影响

本实验取雄性Wistar大鼠,分四组,即正常组,糖尿病组(DM组),人参茎叶皂甙(GS)+DM组(简称GS组),大豆皂甙(SS)+DM组(简称SS组)。观察其血糖、SOD、LPO的变化,结果,DM组血糖明显升高,GS组和SS组,血糖明显下降。DM组SOD含量明显减少,GS和SS使DM大鼠的SOD含量明显增加。DM组LPO含量增高,而GS组和SS组的LPO含量均明显降低。提示了GS和SS能通过自身调节增加DM大鼠SOD的含量,降低LPO,清除自由基,减轻了自由基的损伤作用,对DM大鼠有一定的防治作用。     

高效液相 (HPLC) 荧光法同时测定人血浆中4种硫醇物的浓度

 目的  建立同时测定人血浆中半胱氨酸(cysteine,Cys)、同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)、半胱氨酰甘氨酸(cysteinylglycine,CysGly)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)等4种硫醇物的高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)。方法  血浆经磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)稀释后,用三(2-羧乙基)膦盐酸盐［tris-(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride,TCEP］还原,用三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液进行蛋白沉淀,再用7-氟苯呋咱-4-硫酸铵盐(7-fluorobenzofurazan-4-sulfonic acid ammonium salt,SBD-F)进行衍生化反应,荧光检测器检测。色谱条件:色谱柱为Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm),柱温29 ℃;流动相为甲醇:0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH=4.5,3.5∶96.5,V/V),流速为0.8 mL/min,等度洗脱。激发波长385 nm,发射波长515 nm。采用外标法定量。结果  Cys、Hcy、CysGly和GSH的线性范围分别为50~800 μmol/L、4~64 μmol/L、10~160 μmol/L和2.5~40 μmol/L。Cys、Hcy、CysGly和GSH的最低检测浓度分别为2.5 μmol/L、1.0 μmol/L、1.0 μmol/L和1.0 μmol/L。各组分日内、日间精密度RSD均<12 %。平均回收率为95.01 %~116.17 %。结论  该方法具有检测时间短、灵敏性高、精密度和准确度好的特点,适用于临床人血浆中硫醇物浓度的常规检测。     

高效液相色谱法检测人血浆中咖啡因及其3种去甲基代谢产物

以８－氯茶碱作为内标，利用高效液相色谱同时测定人血浆中咖啡及其３种去甲基代谢产物－－副黄嘌呤、可可碱和茶碱的方法。这４种物质可以在一个固定相柱子上被同时分离；流动相为甲；０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钠（３０：７０）（Ｖ／Ｖ）；流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ；紫外检测器，波长２７４ｎｍ。实验表明这４种物质的最小检出量均在７５ｎｇ／ｍｌ，并具有较好的线性、重复性及较高回收率。     

5种生物碱胃癌多药耐药逆转剂的筛选及机制研究

目的 研究骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、贝母素甲、贝母素乙和氧化苦参碱对肿瘤细胞多药耐药性（MDR）的逆转作用及机制。方法 以胃癌亲本细胞系SGC-7901和MDR细胞系SGC-7901/VCR为细胞模型,采用MTT法检测上述5种生物碱的细胞毒活性及对MDR的逆转效果;用流式细胞仪检测MDR逆转效果最好的贝母素乙对肿瘤细胞内阿霉素（ADR）蓄积的影响;Western blotting法检测P-糖蛋白（P-gp）的表达;Hoechst荧光染色和细胞免疫荧光法检测贝母素乙诱导SGC-7901/VCR细胞凋亡情况。结果 骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、贝母素甲、贝母素乙和氧化苦参碱均能不同程度地抑制SGC-7901和SGC-7901/VCR细胞的增殖,在非毒剂量下贝母素乙能够显著提高SGC-7901/VCR细胞对ADR的敏感性及细胞内ADR的浓度,降低P-gp表达。贝母素乙联合5-氟尿嘧啶（5-FU）给药可诱导SGC-7901/VCR细胞凋亡,凋亡细胞cleaved caspase-3呈高表达。结论 贝母素乙具有作为胃癌MDR逆转剂的潜力,其逆转耐药的机制可能与下调P-gp表达和诱导细胞凋亡有关。     

不同转移倾向小鼠肝癌瘤株与冰切组织体外作用的实验研究

本实验利用小鼠腹水型肝癌(H_(22))的肺转移倾向亚株(H_(22)SP_(10))与淋巴结转移倾向亚株(H_(22)SL_(10))和小鼠的心、肺、肝、肾、淋巴结冰切组织于体外混合培养,观察了不同转移能力的肿瘤细胞与正常组织间的相互作用。于混合培养24、48h后,计数冰切组织上粘附的肿瘤细胞,肝、肾、淋巴结上粘附的H_(22)细胞多于其它脏器。H_(22)SP_(10)主要粘附于肝、肾、肺,而H_(22)SL_(10)则主要粘附于淋巴结,几乎不粘附于肺组织。混合培养后的生长曲线表明加入的正常组织对三种瘤细胞生长具有不同作用,加入的五种组织对H_(22)生长均有促进作用,加入心、肝、肾组织使H_(22)SP_(10)细胞于培养48h之前呈递增趋势,而加入肺、淋巴结组织使H_(22)SP_(10)细胞生长数低于对照组,加入心脏组织96h后H_(22)SL_(10)细胞数开始高于对照组,而加入其它组织均使H_(22)SL_(10)细胞数低于对照组。该结果表明在活体中呈器官倾向性转移的瘤细胞在体外具有与相应组织特异性粘附的能力,而且这些细胞与不同宿主组织间存在不同相互作用。     

胰岛素降糖反应延迟机理的初步探讨

本文对10例IDDM病人皮下注射胰岛素后作了7.5小时动态观察,测定了BG、FI、G、F和GH。基础BG高者,胰岛素最大降糖作用延迟,降糖过程中,GH的升糖效应最敏感,G和F升高与血糖回升时间相一致,在BG高者,呈延迟反应。这种延迟反应可能是由于血糖高,使到达刺激后二种升糖激素分泌阈值所需的时间延长有关。     

反相高压液相色谱与荧光分光光度计朕机检测儿茶酚胺类物质

本文就高效液相与荧光分光光度计联机检测多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素的方法加以论述。     

孕周与母儿血甲状腺激素含量的关系

目的：观察不同孕周与母儿血甲状腺激素的关系。方法：应用放射免疫分析法对67例中、晚期妊娠要求引产患者，10例早产及78例孕足月自然分娩患者进行了母血及胎儿脐静脉、脐动脉血中TSH、T3、T4的测定。结果：TSH值在母血及胎儿血中随着孕周的增加而增加．T3值在胎儿血中与母血中比较，显示低T3血症，T4值接近正常母体水平。结论：测定母血中的甲状腺激素，可动态观察不同孕周甲状腺激素变化，可及时发现胎儿低甲血症。