神经生长因子受体阳性的人食管鳞癌细胞的分选及其干细胞特性

 目的 应用免疫磁珠分选(magnetic activated cell sorting,MACS)人食管鳞癌细胞(esophageal squamous carcinoma cell,ESCC)中的神经生长因子受体(nerve growth factor receptor,NGFR)阳性细胞,并对其肿瘤干细胞样特征进行研究。方法 采用免疫磁珠分选技术分选人食管鳞癌细胞系中的NGFR阳性细胞,然后通过流式细胞仪法测定分选细胞的纯度及细胞周期分布,并计算细胞回收率;MTT法测定细胞数,绘制生长曲线并计算细胞群体倍增时间;平板克隆实验测定平板克隆形成率;裸鼠接种成瘤实验测定体内致瘤性,从而鉴定NGFR阳性ESCC的干细胞特性。结果 NGFR阳性细胞约占肿瘤细胞的1.89%,经过磁珠分选后,其纯度显著提高,达89.94%,细胞回收率为19.83%。与未分选细胞相比,NGFR阳性细胞的增殖速度明显提高,生长曲线左移,细胞倍增时间缩短［(25.22±8.15)h vs. (47.41±12.69)h,P<0.05］,平板克隆形成率显著增加(16.27%±8.31% vs. 1.22%±0.35%,P<0.05),处于活跃增殖期S、G2、M期的细胞显著增加(72.7% vs. 18.8%,P=?);裸鼠皮下接种的转移瘤形成率增加(8/10 vs. 1/10,P=?),转移瘤重量显著增加［0.72±0.53)g vs. (0.16±0.26)g,P<0.05］。结论 应用免疫磁珠分选技术能有效分选出人食管鳞癌细胞中的NGFR阳性细胞,NGFR阳性细胞具有肿瘤干细胞特性。     

MACC1基因干涉对食管癌细胞Eca109体外和体内增殖的影响

目的:探讨MACC1对食管癌细胞Eca109增殖的影响。方法:利用慢病毒载体介导的小发卡RNA(shRNA)干涉食管癌细胞Eca109中MACC1的表达。利用MTT法和平板克隆试验检测MACC1对食管癌细胞增殖的影响,利用流式细胞仪检测细胞周期的变化,最后利用裸鼠成瘤试验检测MACC1对食管癌细胞体内增值的影响。结果:成功建立MACC1干涉的食管癌细胞,MTT和平板克隆结果显示MACC1基因干涉后抑制食管癌细胞的增殖,并使食管癌细胞发生G1期阻滞。体内试验进一步证实MACC1干涉后抑制食管癌细胞在体内的增值。结论:干涉MACC1基因可抑制食管癌细胞的增殖。     

体外hEGF对食管癌EC9706细胞增殖影响的研究

目的:研究人表皮生长因子(hEGF)对食管癌EC9706细胞增殖的影响作用,探讨hEGF不同浓度、不同时间对食管癌细胞生长的影响。方法:体外正常条件培养EC9706食管鳞癌细胞株,无血清饥饿细胞,加入hEGF,通过镜下形态观察、MTT染色、流式细胞技术等观察细胞增殖变化情况。结果:hEGF在200ng/ml浓度、24h作用时间点,对EC9706细胞有明显刺激增殖作用;倒置显微镜下观察,hEGF刺激细胞呈长梭形改变,细胞连接紧密;细胞周期分析,hEGF刺激细胞30.03%处于增殖活跃的S期,较之对照组15.52%,有极显著性差异。结论:hEGF能够刺激食管癌EC9706细胞增殖,其对细胞增殖的刺激作用呈量效、时效关系。     

上调stathmin基因表达对食管鳞癌EC9706细胞的作用

目的 构建stathmin基因真核表达载体,研究上调stathmin基因表达对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用RT-PCR扩增stathmin cDNA,克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体.重组载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染细胞株.显微镜观察转染细胞形态学变化,Western印迹法检测转染细胞stathmin蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖活性,平板克隆形成实验观察细胞克隆形成,流式细胞仪分析细胞周期,裸鼠移植瘤实验研究转染细胞的成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pcDNA3.1(+)载体,获得pcDNA3.1-stathmin重组表达载体.Western印迹法证实重组载体上调EC9706细胞stathmin蛋白表达,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组细胞比较,pcDNA3.1-stathmin转染细胞形态变大、多核、有丝分裂障碍;pcDNA3.1-stathmin转染细胞倍增时间延长(25～28 h)、增殖活性降低、细胞克隆形成率下降(34.5%±6.9%),细胞分裂阻滞于G2/M期(21.7%±3.4%),裸鼠体内致瘤性降低,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 重组质粒pcDNA3.1-stathmin上调stathmin基因表达能够抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖和致瘤性,stathmin可能成为食管鳞癌患者治疗的理想靶点.     

丹皮酚对食管癌细胞放射增敏作用及其机制

目的通过研究丹皮酚对食管鳞癌细胞株KYSE450、TE10放射敏感性的影响及探讨该作用的分子机制,为丹皮酚作为放射治疗增敏药物应用于食管鳞癌的综合治疗提供根据。方法稳定培养食管癌细胞株,经不同浓度的丹皮酚作用后,CCK8法检测细胞增殖。克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡相关蛋白的表达。Western blotting实验检测凋亡相关蛋白的表达情况。结果丹皮酚剂量依赖性地抑制食管癌细胞的增殖（P < 0.05~P < 0.01）,并且抑制放射治疗后的肿瘤细胞克隆形成能力,增加肿瘤细胞的凋亡率（P < 0.01）;Western blotting实验表示放疗与丹皮酚联合处理可降低Bcl-2的表达,增加Bax、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP的表达。结论丹皮酚联合放疗可通过下调Bcl-2表达,上调Bax、caspase-3、PARP、cleaved caspase-3表达,从而抑制体外食管癌细胞的生长,实现放疗增敏。     

雌二醇对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖的影响

目的　观察雌二醇 (estradiol,E2 )对培养的人舌鳞状细胞癌 Tca8113细胞系细胞增殖的影响 .方法　将 E2 作用于体外培养的人舌鳞癌细胞 ,采用四唑盐 (MTT)比色试验及 3H- Td R掺入试验 ,测定 MTT反应 A4 90 nm值和 3H- Td R掺入量 ,并用流式细胞仪测定细胞周期 .结果　不同浓度的 E2(10 - 8～ 10 - 6 mol· L- 1 )可明显增加人舌鳞状细胞癌 Tca8113细胞的增殖 ,MTT 的 A4 90 nm值变化率分别为 (10 7.5±2 .6 ) % ,(113.1± 3.1) %和 (12 0 .0± 3.7) % (P<0 .0 1) ,cpm值的变化率分别为 (10 8.2± 4 .0 ) % ,(116 .7± 4 .2 ) %和(12 4 .8± 3.2 ) % (P<0 .0 1) ,并存在着剂量效应 .10 - 6mol· L- 1的 β- E2 能使人舌鳞癌细胞进入 S期和 G2期的细胞比例从 16 .3%和 7.2 %上升到 2 1.1%和 16 .6 % ,而使处于 G1期的细胞比例从 76 .5 %下降到 6 2 .3% (P<0 .0 1) ,从而细胞的 DNA合成增加 ,促进其增殖 .E2 对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞的促增殖作用可被 Tamoxifen阻断 .结论　 E2在体外能明显促进培养的人舌鳞癌细胞的增殖     

miR-195在食管癌中的表达及其对食管癌细胞株增殖的影响

目的:探讨microRNA-195 (miR-195) 在食管癌中的表达及其对食管鳞癌细胞Eca109增殖的影响?方法: 采用Taqman 探针实时定量PCR方法检测10对外科手术食管鳞癌标本miR-195的表达,用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将miR-195类似物转染入Eca109细胞,Cell Counting Kit-8 (CCK-8)法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot检测蛋白表达水平?结果:与正常食管上皮相比,食管鳞癌组织miR-195表达明显降低(P < 0.05)?在48?72?96 h,miR-195转染组细胞吸光值明显低于对照组(P < 0.05),且miR-195转染组处于G0/G1期细胞的百分数明显高于对照组(P < 0.05)?Western blot结果显示miR-195转染组Cdc42蛋白水平明显低于对照组(P < 0.05)?结论:miR-195可阻滞Eca109细胞从G1期进入S期,抑制其增殖?     

氟硝丁酰胺对喉鳞癌细胞株增殖调控的研究

目的观察氟硝丁酰胺对喉鳞癌细胞株HEP-2的生长调控作用.方法应用MTT比色法、平板集落形成法、流式细胞术检测氟硝丁酰胺对喉鳞癌细胞生长及增殖周期的影响.同时,用电子显微镜检查细胞形态学的改变.结果经氟硝丁酰胺作用后,喉鳞癌细胞株HEP-2增殖明显受到影响.与对照组比较,P<0.05.细胞抑制率达到92.08%,且有明显时间和剂量依赖性;流式细胞仪检测细胞增殖周期有滞于G0/G1期的趋势.并可见凋亡小体形成.结论氟硝丁酰胺对喉鳞癌细胞具有抑制生长和诱导凋亡的作用,为喉癌的性激素临床治疗提供了理论依据.     

黏蛋白1C亚基对食管癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨黏蛋白1 C亚基(MUC1-C)在食管鳞癌中的表达定位及在肿瘤细胞恶性生物学行为中的作用。 方法 Western blotting检测MUC1-C在食管鳞癌组织及正常组织细胞核内的表达;运用穿膜肽Go-201抑制MUC1-C入核后,集落实验及CCK-8实验检测食管鳞癌细胞的活性、生长和增殖能力;划痕实验及Transwell小室实验检测食管鳞癌细胞迁移及侵袭能力;流式细胞术检测食管鳞癌细胞凋亡率。 结果 MUC1-C在食管鳞癌组织细胞核内的表达高于正常组织,抑制MUC1-C入核后食管鳞癌细胞活性、生长、增殖、迁移、侵袭能力均降低,凋亡率增高。 结论 MUC1-C通过入核发挥作用,能诱导和促进食管鳞癌细胞的恶性生长、增殖、迁移、侵袭,抑制肿瘤细胞的凋亡。     

HERG通道阻断剂对胃癌细胞增殖能力的影响

目的探讨HERG通道阻断剂对胃癌细胞增殖能力的影响。方法应用HERG通道阻断剂干预胃癌细胞的HERG电流后,采用MTT法对胃癌细胞进行生长曲线的描绘;采用平板克隆形成实验检测胃癌细胞的克隆形成能力;采用流式细胞计数检测胃癌细胞细胞周期分布的变化。结果HERG通道阻断剂对胃癌细胞的增殖有抑制作用,而对GES细胞的增殖则无明显抑制作用;随着药物剂量的增加及作用时间延长,其抑制作用显著增强。HERG通道阻断剂降低了胃癌细胞的克隆形成能力（P〈0．05）,阻止胃癌细胞由G1期进入S期。结论HERG通道阻断剂可抑制胃癌细胞的增殖和克隆形成能力,并抑制胃癌细胞G1／S期转化,说明HERG电流在胃癌细胞的增殖中发挥作用,HERG蛋白是一个潜在的胃癌生物治疗的靶分子。     

基因芯片在筛选食管鳞癌相关基因中的应用

目的研究人食管鳞状细胞癌与癌旁正常组织的基因表达谱,通过对比基因表达的差异,寻找与人食管鳞癌发展相关的基因。方法提取人食管鳞癌与正常食管鳞状上皮的mRNA,逆转录成cDNA,并用Cy3-dUTP标记正常食管组织,用Cy5-dUTP标记食管鳞癌组织,制成探针,与基因芯片进行杂交,经扫描仪扫描后,对获取的信号数据进行软件分析、对比。筛选出差异表达的基因。结果在4例新鲜标本的芯片杂交检测中,共发现4329条基因发生差异表达,其中2293条上调,2036条下调,将这些基因按GO（gene ontology）分子功能（function term）进行分类,发现与细胞分化、成熟,分子定位、连接,信号传导,酶活性调节,以及基因转录、翻译调节有关的基因最多。结论①食管鳞癌的发生发展与多条基因的异常表达有关。②应用基因芯片技术可以对食管鳞癌的基因表达谱进行分析,以筛选食管鳞癌相关基因。     

食管鳞状细胞癌p16基因变异及其与肿瘤病理的关系

目的 探讨p16基因与原发性食管鳞状细胞癌发生、发展的关系。方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态分析方法检测53例食管鳞状细胞癌组织中p16基因的缺失和突变，分析p16基因变异与食管鳞状细胞癌的临床病理关系。结果 53例食管癌患者中，14例为p16基因纯合性缺失，12例存在突变。p16基因变异在淋巴结转移、远处转移及临床分期方面差异有显著性(P＜0．05)；在性别、年龄、肿瘤长度及肿瘤浸润深度方面差异无显著性(P＞0．05)。结论 p16基因的缺失与突变可能是食管鳞状细胞癌的晚期事件，它在食管癌的发生、发展中起重要作用。p16基因缺失与突变的检测可作为判断食管鳞状细胞癌恶性程度、发展及预后的一个重要指标。     

Survivin在不同分化状态的食管鳞癌组织及体外食管鳞癌细胞中的表达

目的:探讨survivin蛋白在不同分化状态下的食管鳞癌组织及体外细胞中的表达,同时观察其一致性。方法:应用免疫组化方法(SP法)检测了40例食管鳞癌组织、20例癌旁正常组织中survivin蛋白的表达情况;应用细胞的免疫化学方法分别检测食管正常上皮细胞,高分化食管鳞状上皮细胞(KYSE-70),低分化鳞状细胞上皮细胞(KYSE-450)中survivin的表达情况。结果:食管癌患者survivin蛋白的阳性表达水平分别为72.5%(29/40),明显区别于对照组(食管癌旁组织和正常组织)5.0%(P<0.01)。3系细胞中sur-vivin蛋白的阳性表达率分别为86%,69%和1%。结论:survivin蛋白的表达与食管鳞癌组织的分化程度有关,其在食管鳞癌组织与体外食管鳞癌细胞中的表达一致。     

食管鳞癌中pRb2/p130、Cdk4和c-myc的表达及意义

目的:探讨pRb2/p130、Cdk4和c-myc在食管鳞癌中的表达及意义。方法:应用Immuno-Bridge+免疫组化法检测了pRb2/p130、Cdk4和c-myc在60例食管鳞癌中的表达水平,用χ2检验分析它们与临床病理指标及它们三者之间相互关系,用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线并进行生存分析,Cox比例风险模型作预后分析。结果:食管鳞癌中pRb2/p130的低表达与癌组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度有关;Cdk4的高表达与癌组织的分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关;c-myc的高表达与淋巴结转移相关;Kaplan-Meier生存分析表明pRb2/p130高表达组(+)的各期的生存率均高于低表达组(-);Cox比例风险模型分析显示pRb2/p130、淋巴结转移、癌组织分化程度是食管鳞癌的独立预后指标。结论:食管鳞癌中存在pRb2/p130的低表达以及Cdk4和c-myc的高表达,促进了细胞的生长和肿瘤的发展,是食管癌发生发展中的重要事件。     

激光捕获显微切割技术在食管鳞癌蛋白质组学研究中的应用

目的:探讨激光捕获显微切割技术(1aser capture microdissection system,LCM)在获得较单一食管鳞癌细胞中的价值,为食管癌组织蛋白质组学的研究奠定基础.方法:通过激光捕获显微切割技术获取食管鳞癌和正常食管上皮细胞,采用双向凝胶电泳方法分离蛋白质,采用计算机辅助的图像分析技术比较分析凝胶图像.结果:激光捕获了较纯的目的细胞,获得到了分辨率和重复性较好的双向凝胶电泳图谱,比较分析发现38个蛋白点的表达量存在明显差异,其中新增蛋白点3个,缺失5个,20个蛋白点明显上调,10个蛋白点发生明显下调.结论:本研究结果提示LCM技术能较好地获取较为均一的目的细胞,并发现食管鳞癌与正常食管上皮细胞蛋白质表达存在明显差异,可能与食管鳞癌发生机制有关.     

运用激光捕获显微切割对食管鳞状上皮癌蛋白质组的分析

目的分析食管鳞癌与正常食管上皮细胞蛋白质的表达差异,获取鉴别两者的分子标志物。方法激光捕获显微切割技术分离食管鳞癌和正常食管上皮细胞的纯细胞,双向电泳和质谱的方法检测两者表达的差异蛋白。结果48个差异蛋白点,通过质谱鉴定出20种有意义的蛋白,其中11种蛋白如galectin7、14-3-3proteinε等在食管鳞癌细胞表达明显增高,9种蛋白如MTCBP-1等表达下调。结论激光捕获显微切割可以有效地解决组织异质性的问题;食管鳞癌和正常食管上皮细胞的2-DE蛋白质图谱具有明显的差异表达,提示食管鳞癌的发生是多种蛋白质功能共同作用的结果。     

RIP1增强顺铂诱导食管癌细胞的凋亡

目的：探讨受体相互作用蛋白1( RIP1)增强顺铂( DDP)诱导食管癌细胞凋亡的敏感性。方法单溶液细胞增殖分析( MTS )法检测不同浓度 DDP 对食管癌细胞株KYSE510、KYSE410的增殖抑制作用;Annexin V/PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法检测RIP1、半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、PARP的蛋白表达。结果 DDP诱导食管癌细胞凋亡具有剂量和时间相关性。凋亡率随剂量增加和时间延长升高, RIP1蛋白的表达升高, DDP 联合RIP1特异性抑制剂处理食管癌细胞后,较敏感的KYSE510凋亡率明显减少。结论 RIP1可能参与了DDP诱导食管癌细胞凋亡的作用。     

食管癌组织中微血管密度及其临床病理意义

目的　探讨微血管密度与食管癌生物学行为的关系及其意义。方法　应用免疫组织化学SP法 ,对6 0例食管鳞状细胞癌患者手术切除标本进行血管内皮细胞CD34标记 ,计数 2 0 0×视野下 5个最高密度区的微血管数 ,取及均数即为MVD值 ,分析MVD与不同临床病理因素之间的关系。结果　MVD平均值为 31.8± 10 .3,与癌组织的浸润深度、淋巴结转移明显相关。结论　MVD是预测食管鳞状细胞癌生物学行为的一个有用指标。     

转录因子Yin Yang 1(YY1)在食管癌中的表达及其对食管癌细胞功能的影响

目的:探讨转录因子Yin Yang 1(YY1)在正常食管组织和食管鳞癌组织中的表达及其在食管癌发生发展中的作用?方法:免疫组化染色检测15例正常食管组织,39例食管癌旁组织和88例食管癌组织样品中YY1蛋白表达水平;噻唑蓝(MTT)和克隆实验检测食管鳞癌细胞(TE-1细胞)增殖和生长变化;蛋白质印迹(Western blot)技术检测转染后转录因子YY1和p21表达水平;细胞划痕实验和Transwell实验检测TE-1细胞迁移?侵袭能力的变化?结果:与正常食管组织和食管癌旁组织相比,YY1 蛋白在食管鳞癌组织样品中的表达显著提高?此外,转染了YY1过表达载体后明显抑制TE-1细胞生长,而干扰YY1表达则可促进细胞的生长;同时伴随着YY1靶基因p21(也称p21WAF1/Cip1)的变化?TE-1细胞转染YY1过表达载体后,细胞的侵袭?迁移能力增强?结论:食管鳞癌组织中YY1表达显著上调,YY1可调节细胞的生长和转移侵袭能力?因此,YY1有望成为食管癌诊断和发展的分子标志物,也有可能是食管癌基因治疗的一个潜在靶点?     

循环肿瘤细胞在晚期食管鳞癌患者疗效评估中的临床价值*

目的 探究循环肿瘤细胞（CTC）在评估晚期食管鳞癌患者同步放化疗疗效的临床应用。方法 选取2015年12月31日—2016年12月31日安徽医科大学第一附属医院肿瘤放疗科的食管鳞癌晚期患者（Ⅲ、Ⅳ期）38例,予以50?Gy的三维适行放疗联合TP方案（紫杉醇135?mg/m2;顺铂25?mg/m2）化疗,在放化疗前采集患者的外周血检测CTC,并对患者进行2年密切随访,运用t检验,Z检验分析CTC值变化,Kaplan-Meier方法及Log-rank χ2检验分析患者CTC值与生存率的关系,并运用Cox回归模型进行多因素分析。结果 食管鳞癌患者同步放化疗后肿瘤直径较治疗前明显减小,同步放化疗前后CTC差值（dCTC）、CEA的差值（dCEA）、CA199的差值（dCA199）、放疗前CA125值对患者预后有影响,dCTC和放疗前CA125值是评估入组患者预后的独立影响因素。结论 对食管癌同步放化疗的患者,放疗前后CTC的差值,放疗前CA125值相比较放疗前CTC、CEA及CA199值,能更好地评估患者的预后。