培养心肌细胞缺氧时胞红蛋白表达变化特点

目的 探讨心肌细胞缺氧后胞红蛋白表达变化的特点与规律.方法 利用酶消化法及差速贴壁法分离培养新生2～3 d大鼠的心肌细胞,分为4组:对照组,缺氧4、12、24 h组.对照组置常规培养箱(5%CO2、95%空气,37℃)中培养,缺氧组置缺氧培养箱中培养(2%O2,5%CO2,93%N2,37℃),于不同时间(4、12、24 h)后,取心肌细胞进行免疫组化染色和免疫印迹分析蛋白水平的分布与表达的变化,用逆转录PCR法分析胞红蛋白mRNA水平的变化.结果 免疫组织化学染色显示胞红蛋白主要分布于细胞质,缺氧各组胞红蛋白染色强度均高于常氧组(对照组).免疫印迹灰度分析结果显示,缺氧4 h组胞红蛋白表达量高于常氧组,但差异无统计学意义(P＞0.05),而缺氧12、24 h组胞红蛋白表达高于常氧组,差异有统计学意义(P＜0.05).缺氧4、12、24 h组胞红蛋白mRNA水平均高于常氧组(P＜0.05),缺氧12、24 h组较缺氧4 h组更进一步增高(P＜0.05).结论 胞红蛋白分布于心肌细胞的细胞质.培养心肌细胞缺氧4 h后胞红蛋白转录增强,缺氧12 h后蛋白水平增强.胞红蛋白表达增加可能是心肌细胞对缺氧的一种代偿反应.     

缺氧状态下人颞下颌关节滑膜成纤维细胞环氧合酶2的表达及意义

目的研究缺氧对人颞下颌关节滑膜成纤维细胞环氧合酶2(COX2)表达的影响,并探讨其在颞下颌关节紊乱病(TMD)中的生物学作用。方法应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和Western印迹检测缺氧不同时间段滑膜成纤维细胞COX2基因与蛋白质表达水平。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)以及明胶酶谱法分别测定缺氧组、缺氧与COX2特异性抑制剂塞来昔布二者联合作用组前列腺素E2(PGE2),金属基质蛋白酶2、9(MMP2、MMP9)分泌量的变化,以常氧组为对照。结果(1)RTPCR测定细胞缺氧4、8hCOX2mRNA分别为1.51±0.34和1.39±0.57,与常氧组0.65±0.24和0.71±0.15比较,差异有统计学意义(均P<0.05)。(2)Western印迹测定细胞COX2蛋白表达,缺氧6h为0.29±0.06,12h为0.51±0.09,24h为0.68±0.11,而常氧组检测不出COX2蛋白(均P<0.01),表明缺氧条件下,细胞COX2蛋白表达呈时间依赖性增加。(3)ELISA测定细胞缺氧12h,释放的PGE2(7.6ng/ml±0.8ng/ml)显著高于常氧组(2.5ng/ml±0.4ng/ml,P<0.01);联合药物处理组(4.3ng/ml±0.4ng/ml)也显著低于缺氧组(P<0.05),表明细胞PGE2释放受抑制。(4)明胶酶谱法测定细胞缺氧12h,分泌的MMP2、MMP9高于常氧组,但在药物联合作用下,分泌能力减弱。结论组织缺氧是导致TMD的一个重要因素;缺氧状况下,人滑膜成纤维细胞可能通过增加COX2的表达来影响缺氧所致颞下颌关节病变进程。     

TRPC_3参与缺氧诱导人脐静脉血管内皮细胞凋亡

目的:探讨瞬时受体电位通道蛋白3(TRPC3)在缺氧诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)凋亡中的作用。方法:采用HUVECs细胞株,复苏传代后计数稀释,接种于6孔培养板中,实验组分为常氧对照组(5%CO2+95%空气)和缺氧组(1%O2+5%CO2+94%N2),处理24h后,应用实时荧光定量RT-PCR法及WesternBlot法检测TRPC3mRNA和蛋白水平的表达变化。构建靶向TRPC3基因的siRNA和无关序列质粒表达载体,分别转染至HUVECs,缺氧处理后再用四甲基偶氮唑盐比色法(Methods the tetrazolium,MTT)检测各组细胞存活率,Hoechest33342荧光染色观察细胞凋亡。结果:缺氧处理24h,HUVECs中TRPC3mRNA和蛋白表达明显升高,细胞存活率为67.4%,与常氧对照组有显著性差异(P<0.05);缺氧+TRPC3干扰组细胞存活率为92.7%,与缺氧组有显著性差异(P<0.05);缺氧+TRPC3假干扰组与缺氧组无显著性差异(P>0.05)。荧光显微镜下观察,常氧对照组胞核均匀蓝染;缺氧处理组和缺氧+TRPC3假干扰组胞核明显固缩、凝聚,可见凋亡小体;而缺氧+TRPC3干扰组胞核均匀蓝染。结论:TRPC3参与缺氧诱导HUVECs凋亡。     

缺氧应激对人肝癌细胞黏附、侵袭和迁移能力的影响

目的 探讨缺氧应激对人肝癌细胞HepG2黏附、侵袭和迁移能力的影响.方法 缺氧(5%O2、5%CO2、90%N2)和常氧培养HepG2细胞.细胞.基质黏附实验测定常氧组和缺氧4、12、24h组HepG2细胞黏附能力;细胞侵袭和迁移实验测定缺氧和常氧24 h组HepG2细胞侵袭和迁移能力;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定常氧组和缺氧4、12、24 h组HepG2细胞缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)-1α mRNA的表达量.结果 随着缺氧时间的延长HepG2细胞的黏附能力明显增强(P＜0.01),缺氧24 h组HepG2细胞侵袭和迁移能力明显高于常氧组(P＜0.01).常氧下HepG2细胞不表达HIF-1α mRNA,缺氧4 h时HIF-1α mRNA表达量最高,随后下降(P＜0.01),但仍高于常氧组.结论 缺氧应激上调HepG2细胞HIF-1α mRNA的表达,促进HepG2细胞黏附、侵袭和迁移.     

缺氧应激对HepG-2增殖活性和HIF-1α、MMP-2表达的影响

目的研究缺氧应激对人肝癌细胞HepG-2增殖和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、基质金属蛋白-2(MMP-2)表达的影响。方法将缺氧(5%O2、5%CO2、90%N2)和常氧环境中培养的HepG-2细胞,在相差显微镜下观察细胞形态变化;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖活性;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定常氧组和缺氧4、12、24h组HepG-2细胞HIF-1αmRNA和MMP-2mRNA的表达量;用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定常氧和缺氧12、24h组细胞培养上清MMP-2蛋白含量。结果同时相缺氧组HepG-2细胞增殖活性与常氧组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。常氧下HepG-2细胞不表达HIF-1αmRNA,缺氧4h时HIF-1αmRNA表达量最高,随后下降(P<0.01),但仍高于常氧组;缺氧4h时MMP-2mRNA表达量最高,随后下降,但仍高于常氧组(P<0.01);缺氧组HIF-1αmRNA和MMP-2mRNA呈高度正相关关系。缺氧24h组HepG-2细胞培养上清液中的MMP-2蛋白含量与常氧24h组含量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论缺氧应激(5%O2)促进人肝癌细胞HepG-2的增殖作用并上调HIF-1α和MMP-2的表达量。     

二氯化钴所致缺氧对A549细胞增殖抑制和凋亡的影响

目的:探讨CoCl2作用不同时间所致缺氧对体外培养的人肺腺癌A549细胞株增殖、凋亡和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的影响。方法:对肺腺癌细胞A549分别进行常氧和氯化钴模拟缺氧培养,采用MTT法检测CoCl2作用不同时间所致缺氧对A549细胞增殖的影响;半定量RT-PCR法测定缺氧不同时间HIF-1αmRNA表达水平的变化。AnnexinV-FITC/PI双标记染色,流式细胞术检测CoCl2作用不同时间缺氧肿瘤细胞凋亡情况。结果:CoCl2对A549细胞增殖抑制作用表现出时间依赖性抑制作用。常氧条件下的A549细胞即有一定水平的HIF-1αmRNA的表达,随着CoCl2作用时间的延长,HIF-1αmRNA水平呈升高趋势,与正常对照组比较,各缺氧组差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,正常对照组、CoCl2作用4、12、24、48 h组细胞凋亡率分别为(0.60±0.10)%、(1.10±0.10)%、(8.63±0.75)%、(12.80±0.85)%和(19.33±0.80)%。结论:CoCl2对A549细胞具有上调HIF-1αmRNA表达作用,可抑制细胞的增殖和一定的凋亡诱导作用,这些说明HIF-1α可能在肺癌的发展中扮演着重要的作用。     

肺腺癌细胞缺氧后移植瘤生长特性及微血管密度变化

目的探讨肺腺癌细胞经过缺氧刺激后,对肿瘤生长及血管形成的影响.方法将人肺腺癌细胞株A549暴露于常氧(空气,5%CO2)、缺氧(5%O2,5%CO2,90%N2)、无氧(95%N2,5%CO2)环境48 h后,将细胞接种于裸鼠皮下,观察其生长情况,通过CD34免疫组化染色计数微血管密度(M工D),通过ELISA测定移植瘤组织中血管内皮细胞生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达水平.结果移植10 d之后,缺氧组肿瘤体积显著大于常氧组.移植25 d之后缺氧组肿瘤体积、重量、微血管密度以及瘤组织中VEGF、bFGF水平均显著高于常氧组,而无氧组相反,显著低于常氧组.结论适度缺氧可以刺激肺腺癌VEGF、bFGF等生长因子的表达,促进移植瘤血管形成,使肿瘤的生长能力提高.但是严重缺氧可损伤癌细胞,影响生长因子的合成表达,阻碍血管形成,抑制肿瘤的生长.     

不同时间持续缺氧对3T3-L1脂肪细胞脂肪因子基因表达的影响

目的:探讨不同时间持续缺氧孵育后脂肪细胞脂联素和瘦素表达的变化。方法:将分化成熟的3T3-L1脂肪细胞随机分为6组,即常氧(21%O2)组和缺氧(1%O2)4、12、24、48、72 h组,实时定量PCR(q RT-PCR)法测定各时间点脂肪细胞中缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、葡萄糖转运子1(GLUT-1)、脂联素和瘦素基因表达。结果:与常氧组相比,缺氧12、24、48 h组HIF-1α、GLUT-1 m RNA表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。缺氧24 h时HIF-1α、GLUT-1 m RNA达到最高。各缺氧组脂联素m RNA在12、24、48、72 h缺氧组的表达下降,较常氧组有统计学差异(P<0.05)。各缺氧组瘦素m RNA的表达高于常氧组,并在24 h时达到最高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:缺氧使脂肪细胞HIF-1α、GLUT-1、瘦素m RNA表达升高,脂联素m RNA表达下降,各反应在缺氧24 h时达到最大水平。     

睾酮对胰岛素敏感细胞胰岛素受体底物1和葡萄糖转运载体4表达的影响

目的探讨雄激素对胰岛素敏感性影响的可能的分子机制。方法诱导3T3-L1前脂肪细胞系和C2C12成肌细胞系分别分化为3T3-L1脂肪细胞和C2C12骨骼肌细胞,然后对这两种细胞分别以10-9mol/L睾酮处理4、8、12、24及48h,并以不同浓度(10-12~10-5mol/L)的睾酮处理24h,用Western印迹的方法检测两种细胞在以两种方法处理后胰岛素受体底物1(IRS-1)和葡萄糖转运载体4(GLUT4)表达的变化。结果随着10-9mol/L浓度的睾酮处理时间的延长,IRS-1和GLUT4在两种细胞的表达逐渐增加,IRS-1于12h达峰后下降。3T3-L1脂肪细胞及C2C12骨骼肌细胞中12h峰值分别是0h对照的(1·42±0·42)倍和(1·53±0·14)倍,均P<0·05;GLUT4于24h达峰后表达下降[3T3-L1脂肪细胞及C2C12骨骼肌细胞中24h峰值分别是0h的(3·22±0·10)倍和(5·17±1·06)倍,均P<0·05]。当睾酮处理浓度从10-12mol/L逐渐增加时,IRS-1在两种细胞的表达逐渐增加,于10-9mol/L达峰值后表达逐渐下降[在3T3-L1脂肪细胞和C2C12骨骼肌细胞,10-9mol/L睾酮处理后的峰值较空白对照分别增加(4·23±0·27)倍和(3·16±0·15)倍,均P<0·05]。GLUT4在C2C12骨骼肌细胞的表达随着睾酮浓度的升高有增加的趋势[经10-7mol/L睾酮处理后的表达量是空白对照的(2·99±0·15)倍,P<0·05,于10-7mol/L后增加趋势不明显。在3T3-L1脂肪细胞中,GLUT4的表达于10-11mol/L达峰值[较空白对照增加(2·58±0·02)倍,P<0·05],然后随着睾酮浓度的升高表达下降。结论睾酮影响胰岛素信号转导分子的表达存在剂量和时间上的双向作用。     

AQP4在新生大鼠实验性星形胶质细胞缺氧损伤模型中的表达变化及意义

目的 探讨水通道蛋白4（AQP4）在原代培养新生大鼠星形胶质细胞（AC）缺氧和缺氧后再复氧损伤模型中的表达改变及其意义。方法 原代培养成熟的AC随机分成常氧培养组（对照组）、缺氧组和复氧组。缺氧组AC在缺氧条件下分别培养3h、6h、12h和24h,复氧组AC缺氧培养12h后更换为常氧培养,分别培养3h、6h、12h和24h。各组样品采用Real Time PCR和免疫荧光染色分别测定AQP4 mRNA和蛋白表达水平。结果 随着缺氧时间延长,AQP4 mRNA和蛋白表达水平进行性降低,复氧时则先降低,后回升。结论 AQP4表达下降可能与脑水肿的发生有关,AQP4可能对脑内渗透平衡重建起重要作用。     

γ分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路对肺腺癌细胞A549增殖的影响

目的观察γ分泌酶抑制剂MW167阻断Notch信号对肺腺癌细胞A549增殖的影响。方法正常氧条件下培养肺腺癌细胞A549,通过Western blotting及RT-PCR方法检测Notch受体各亚型的表达。在正常氧条件下,不同浓度(5、10、20μmol/L)MW167处理肺腺癌细胞A549(加药组),48 h后采用Western blotting方法检测Notch1蛋白表达的变化,采用RT-PCR方法检测Notch信号通路下游基因HES1mRNA表达的变化,应用MTT法检测MW167对细胞增殖的影响;每个浓度设二甲基亚砜对照组。结果 Notch1～4各亚型在A549细胞均有表达。5、10、20μmol/L MW167处理肺腺癌A549细胞48 h后,各加药组与对照组相比,Notch1蛋白表达升高(P<0.05),而HES1 mRNA表达下降(P<0.05),随MW167浓度升高,对HES1 mRNA表达的抑制率逐渐升高(r=0.927,P<0.01)。MTT法检测结果显示各加药组吸光度高于对照组(P<0.05),且随MW167浓度升高,细胞增殖率相应升高(r=0.904,P<0.01)。结论在正常氧条件下,MW167可阻断Notch信号通路,对A549细胞起促增殖作用;Notch1信号通路可能在A549细胞中起一定抑癌作用。     

沉默lncRNA-UCA1对乏氧诱导NSCLC细胞A549放射抵抗的作用机制

目的探究沉默长链非编码RNA尿路上皮癌相关基因1(lncRNA-UCA1)对乏氧诱导的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞A549放射抵抗的作用机制。 方法选取NSCLC细胞A549及人正常支气管上皮细胞HBE,平板克隆实验、qRT-PCR分别检测不同NSCLC细胞在常氧和乏氧状态下对放射的敏感性及lncRNA-UCA1的表达水平。将A549细胞实验分为si-NC组(未干预)及si-RNA组(转染lncRNA-UCA1)。流式细胞术检测乏氧状态下两组细胞放射敏感性、细胞分期和凋亡率。裸鼠成瘤实验检测乏氧状态下两组裸鼠成瘤能力。Western blotting检测两组B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(BAX)、磷酸化蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(p-Akt)及磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)含量。 结果A549细胞放射敏感性显著高于HBE;乏氧状态下A549细胞lncRNA-UCA1表达水平显著高于常氧状态。沉默lncRNA-UCA1可以逆转放射诱导的周期阻滞,诱导细胞凋亡。与si-NC组比较,si-RNA组肿瘤增殖变慢,肿瘤体积变小,p-Akt、p-mTOR和Bcl-2蛋白含量显著下调,BAX蛋白含量显著上调。 结论沉默lncRNA-UCA1能激活Akt/mTOR通路抑制NSCLC A549细胞的放射抵抗,增加其放射治疗敏感性。     

RNA干扰HIF-1α对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的VEGF表达及增殖的影响

目的 探讨shRNA特异性干扰沉默缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对类风湿关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞（FLS）的血管内皮生长因子（VEGF）表达及其增殖的影响.方法 获取9例RA患者滑膜组织进行RA-FLS的分离培养及传代.将FLS分为4组：常氧组、缺氧组、阴性质粒组（转染阴性质粒）和阳性质粒组（转染HIF-1α阳性质粒）,常氧组进行常规培养,后3组进行缺氧培养12h;采用Western blot和qRT-PCR法分别检测各组FLS中HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGFmRNA表达情况.将缺氧组、阴性质粒组和阳性质粒组的FLS分别于缺氧条件下培养6、12、24、48h,应用MTT比色法检测各组细胞增殖情况.结果 与常氧组相比,缺氧组FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGFmRNA表达明显升高,差异均有统计学意义（均P＜0.05）,而阴性质粒组和缺氧组FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGFmRNA表达水平无明显差异（P＞0.05）;阳性质粒组FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA较缺氧组下调,差异均有统计学意义（均P＜ 0.05）.4组FLS的HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGF mRNA表达呈正相关（P＜0.01）.缺氧培养12h后阳性质粒组的FLS生长较缺氧对照组及阴性质粒组减慢,差异有统计学意义（P＜0.05）,而后两组FLS生长无统计学差异（P＞0.05）.结论 RNA干扰HIF-1α表达能有效下调RA-FLS中HIF-1α和VEGF以及HIF-1α和VEGFmRNA水平,并且能抑制FLS的异常增殖.     

低氧促进肌成纤维细胞表达和分泌结缔组织生长因子及纤维连接蛋白

目的:观察低氧对肾肌成纤维细胞合成和分泌结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)和细胞外基质纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的影响,以了解肌成纤维细胞在肾间质纤维化过程中的作用.方法:(1)采用原代培养正常大鼠肾皮质肌成纤维细胞,以密闭的细胞培养罐造成低氧环境(1%O2 ,体积分数),应用Western blot方法检测低氧和正常氧(21%O2 ,体积分数)条件下低氧诱导因子-1α( hypoxia induced factor-1α,HIF-1α)蛋白的表达,验证所营造的低氧条件是可靠的.(2)用Western blot方法检测在低氧和正常氧条件下,各时间点上细胞及上清液中CTGF和FN蛋白水平.(3) 用RT-PCR方法检测低氧和正常氧条件下,各时间点FN mRNA表达的变化.(4)用明胶酶谱法检测细胞上清液中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloprotei- nase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP -9)的活性.结果:正常氧组HIF-1α蛋白表达微弱,低氧组有较高水平HIF-1α蛋白表达.低氧作用于原代培养的肌成纤维细胞6 h,12 h和24 h后细胞内的CTGF蛋白均比正常氧组增高,分别为175%±52%,347%±67%和143%±27%,以12 h最明显(P＜0.05);低氧刺激24 h时上清液中CTGF蛋白显著增加,是正常氧组的348%±99%(P＜0.05);低氧刺激肌成纤维细胞6 h,12 h和24 h后上清液中FN蛋白水平增加,分别是正常氧组的187%±42%,199%±51%和210%±29%,以24 h 最明显(P＜0.05),而对应时间点上清液中MMP-9和MMP-2活性无明显变化,但细胞内FN蛋白减少,低氧剌激6 h为正常氧组的64%±13%.低氧刺激肌成纤维细胞3 h,FN的mRNA水平开始上升,6 h达到正常氧组的135%±13%(P＜0.05),12 h 下降接近正常氧水平.结论 :低氧可通过促进肌成纤维细胞表达CTGF和FN参与肾间质纤维化的进展.     

慢性缺氧诱导小鼠心肌细胞自噬及其机制

目的 观察慢性缺氧对小鼠心肌细胞自噬水平的影响,并初步探讨AMPKα2敲除对该过程的作用.方法 采用野生型与AMPKα2-/-雄性C57小鼠均分为野生型常氧组、野生型缺氧组、敲除型常氧组和敲除型缺氧组(n=10).常氧组于空气环境中饲养,缺氧组于10％ O2的低氧舱内饲养.4周后野生型小鼠取静脉血标本,测红细胞及血红蛋白水平;取心脏标本用Western blot检测AMPKα2及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值与p62的变化,用免疫荧光染色法检测心肌冰冻切片LC3变化.敲除型小鼠取心脏标本用Western blot检测心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值变化.结果 ①野生型小鼠中,与常氧组比较,缺氧组红细胞与血红蛋白水平显著增加[红细胞:(9.33 ±0.15)×1012/L vs(12.78±0.66)×1012/L,P ＜0.05;血红蛋白:(135 ±3)g/L vs (192 ±4)g/L,P＜0.05];②野生型小鼠中,与常氧组相比,缺氧组心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著增加[(0.49 ±0.29) vs(1.70 ±0.24),P＜0.05];p62表达明显降低[(1.32±0.57) vs (0.71 ±0.19),P＜0.05];免疫荧光结果显示,缺氧组心肌组织LC3荧光较常氧组增多;③在常氧条件下,与野生型小鼠比较,AMPKα2-/-小鼠心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低,但差异无统计学意义[(0.78 ±0.08) vs (0.73 ±0.34),P＞0.05];在缺氧条件下,与野生型小鼠比较,AMPKα2-/-小鼠心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低[(2.08±0.72) vs (1.01 ±0.21),P＜0.05];④野生型小鼠中,与常氧组比较,缺氧组AMPKα2蛋白表达水平并无显著增加[(1.14±0.13) vs(1.25±0.19),P＞0.05].结论 慢性缺氧可能通过AMPKα2依赖的途径增强心肌细胞自噬,该自噬可能是心肌细胞对慢性缺氧的适应机制.     

RNA干扰沉默乏氧诱导因子1α对乏氧条件下食管鳞癌细胞化疗敏感性的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默乏氧诱导因子（HIF）-1α对食管鳞癌EC9706细胞乏氧条件下化疗敏感性的影响及其机制。方法应用化学乏氧法[氯化钴（CoCl2）加入培养液的终浓度为75μmol／L]体外模拟肿瘤乏氧微环境。采用MTS比色法检测常氧培养组和乏氧培养组EC9706细胞在顺铂／紫杉醇作用下细胞的抑制率,以及RNA干扰后乏氧培养细胞在顺铂／紫杉醇作用下细胞的抑制率。应用Western印迹方法检测HIF-1α基因沉默后乏氧诱导HIF-1α蛋白表达变化。用流式细胞仪检测RNA干扰前后乏氧条件下EC9706细胞的细胞周期。结果针对HIF-1α基因的siRNA干扰技术,有效抑制乏氧诱导的HIF-1α蛋白表达。同一药物浓度常氧培养组细胞抑制率均明显高于乏氧培养组（均P〈0．05）。相同药物浓度及相同的乏氧条件下RNA干扰组抑制率均明显高于未转染组及转染control siRNA组（均P〈0.05）。相同的乏氧条件下转染HIF-1α siRNA与未转染组／转染无关对照siRNA组相比,S期显著增加（P〈0．05）、G1期细胞减少（P〈0．05）。结论乏氧条件下HIF-1α诱导EC9706细胞周期停止,可能是乏氧条件下细胞耐药的机制之一。RNA干扰可逆转食管癌细胞EC9706乏氧环境中化疗耐药。     

乏氧对人口腔鳞状细胞癌细胞中叉头蛋白P3表达的影响及其机制

目的：观察乏氧对人口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞中叉头蛋白P3（FOXP3）表达的影响,阐明乏氧调控FOXP3表达的表观遗传学机制。方法：选取人OSCC细胞株FaDu和OECM-1细胞,常氧和乏氧条件下培养18h。采用实时定量PCR方法检测细胞中FOXP3 mRNA的相对表达水平,Western blotting 法检测FaDu和OECM-1细胞中FoxP3蛋白表达水平,染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）法检测FOXP3基因启动子上组蛋白修饰H3K4乙酰化（H3K4ac）、H3K4三甲基化（H3K4me3）和H3K27三甲基化（H3K27me3）水平。采用组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）基因沉默的FaDu细胞,以实时定量PCR和ChIP-qPCR法检测FaDu细胞中HDA3 mRNA相对表达水平和FOXP3mTNA表达抑制率。结果：与常氧条件比较,乏氧条件下FaDu和OECM-1细胞中FOXP3 mRNA相对表达水平均明显降低,分别下降65.6%（P<0.01）和75.7%（P<0.01）;Western blotting检测,乏氧条件下FaDu和OECM-1细胞中FOXP3蛋白表达水平明显低于常氧条件下;染色质免疫沉淀实验,与常氧条件比较,乏氧条件下FaDu细胞中FOXP3基因启动子上的H3K4ac和H3K4me3水平明显降低（P<0.01）,而H3K27me3水平无明显差异。与无HDAC3基因沉默的FaDu细胞比较,HDAC3基因沉默的FaDu细胞中缺氧诱导的FOXP3启动子上H3K4ac和H3K4me3表达抑制率明显降低（P<0.05）,缺氧诱导的FOXP3mRNA相对表达抑制率降低（P<0.05）。结论：乏氧可通过HDAC3介导的FOXP3基因启动子上H3K4ac水平下调而抑制OSCC细胞中FOXP3的表达。     

pEgr1-hsTRAIL质粒对肺腺癌A549细胞放射敏感性及DR4和DR5表达水平的影响

目的:检测转染pEgr1-hsTRAIL质粒的人肺腺癌A549细胞放射敏感性变化及其对死亡受体（DR）4和DR 5 mRNA和蛋白表达的影响,探讨pEgr1-hsTRAIL质粒的辐射增敏效应和诱导细胞凋亡的可能机制。方法:实验分为正常对照（Normal control）组、pEgr1-hsTRAIL组、6 Gy X线照射组和pEgr1-hsTRAIL + 6 Gy X线照射组。A549细胞经过阳离子脂质体转染、X线深部治疗机照射后,利用平板克隆形成试验检测细胞放射敏感性,反转录RCR（RT-PCR）法检测DR4和DR5 mRNA表达变化,Western blotting法检测DR4和DR5蛋白表达的变化。结果：正常对照组和pEgr1-hsTRAIL组A549细胞的平均致死剂量（D0值）分别为3.26和1.91 Gy,说明pEgr1-hsTRAIL质粒能够增强A549细胞的放射敏感性。RT-PCR显示,转染pEgr1-hsTRAIL质粒对DR4和DR5 mRNA和蛋白表达水平无明显影响,而6 Gy X线照射后DR4和DR5 mRNA表达均显著高于正常对照组（P<0.05）,转染pEgr1-hsTRAIL质粒后再进行6 Gy X线照射,DR4和DR5 mRNA表达水平均显著高于正常对照组（P<0.05）,但只有DR5 mRNA表达水平显著高于6 Gy X线照射组（P<0.05）。Western blotting结果显示,与正常对照组比较,DR4和DR5蛋白在pEgr1-hsTRAIL组无明显变化,而在6 Gy X线照射和pEgr1-hsTRAIL + 6 Gy X线照射组表达增加,其中DR5蛋白在pEgr1-hsTRAIL + 6 Gy X线照射组增加更明显。结论:重组表达质粒pEgr1-shTRAIL能够增强A549细胞放射敏感性,且能增强DR5辐射诱导表达,而对DR4的辐射诱导表达无明显增强作用。     

张力蛋白1抑制非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭

目的: 探讨张力蛋白1(tensin1,TNS1)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达水平、与NSCLC患者预后的关系及其对NSCLC细胞生物学功能的影响。方法: 收集56例NSCLC患者的临床病理资料,通过电话方式进行随访,了解患者生存情况。荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测56例NSCLC标本和对应癌旁组织中TNS1 mRNA表达水平,分析其与NSCLC患者临床病理特征的关系。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析TNS1 mRNA与NSCLC患者预后的关系。采用qRT-PCR和蛋白质印迹法分别检测NSCLC细胞A549、H1299与正常肺支气管上皮16HBE细胞中TNS1 mRNA和蛋白表达水平;将A549、H1299细胞各分为2组,分别转染TNS1过表达质粒(pcDNA3.1/TNS1组)和相应的空载质粒(阴性对照pcDNA3.1组);MTT实验、克隆形成实验、细胞划痕、Transwell实验分别检测细胞增殖、迁移、侵袭能力;蛋白质印迹法检测细胞上皮间质转化相关分子蛋白水平。结果： 与癌旁组织相比,NSCLC组织中TNS1 mRNA表达明显降低(P<0.05)。TNS1 mRNA表达量与NSCLC患者淋巴结转移及术后肿瘤转移相关(P<0.05),与年龄、性别、吸烟、病理分型、肿瘤大小、TNM分期无明显相关性(P>0.05)。TNS1 mRNA高表达患者的3年累积无病生存率和累积总体生存率均高于TNS1 mRNA低表达患者(P均<0.05)。A549和H1299细胞中TNS1 mRNA和蛋白表达量均明显低于16HBE 细胞(P均<0.01)。与对照组相比,pcDNA3.1/TNS1组A549和H1299细胞增殖、迁移、侵袭能力降低,E-钙黏蛋白表达明显上调(P<0.01),波形蛋白表达明显下调(P<0.01)。结论： TNS1在NSCLC组织及细胞中表达下调,与NSCLC患者预后相关,可抑制NSCLC细胞增殖和迁移。