核酸外切酶-压电石英DNA传感器检测金黄色葡萄球菌的实验研究

目的 构建一种用于检测金黄色葡萄球菌的核酸外切酶-压电石英DNA传感器新方法,同时对其重要影响因素进行探讨.方法 采用λ核酸外切酶处理金黄色葡萄球菌PCR产物,EB染色、电泳后于紫外灯下进行观察,对杂交温度、杂交时间和杂交响应性能等因素进行实验研究,进一步将构建的核酸外切酶-压电石英DNA传感器法用于金黄色葡萄球菌检测,并对其灵敏度和特异性进行研究.结果 λ核酸外切酶-压电石英DNA传感器法最适杂交温度为35℃,最适杂交时间为60 min,响应性能显著大于普通压电DNA传感器(P＜0.01),可以检测到1.0×104CFU/ml的金黄色葡萄球菌,特异性好.结论 利用核酸外切酶-压电石英DNA传感器检测金黄色葡萄球菌,具有杂交效率高、技术难度低、频率响应性能高等优点,有较好的应用前景.     

金黄色葡萄球菌nuc基因特异性核酸探针的制备及应用

目的　建立核酸探针检测实验动物金黄色葡萄球菌的方法。方法　将重组质粒pGEM NUC中金黄色葡萄球菌nuc基因特异性片段酶切回收 ,经生物素标记后作为核酸斑点杂交试验探针 ,对细菌菌株及临床样品进行了检测。结果　核酸探针与金黄色葡萄球菌DNA呈杂交阳性 ,而与表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌等其他细菌DNA呈杂交阴性 ,斑点杂交检测的灵敏度为 1pg基因组DNA。用斑点杂交试验和PCR对 32 2份SPF小鼠的临床样品进行了检测 ,检出率为 3 1% (10 /32 2 ) ,符合率为 10 0 % ,与细菌学检查的结果相一致。结论　建立的DNA探针检测金黄色葡萄球菌方法具有高度的特异性和敏感性 ,且较快速 ,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的监测。     

装载微RNA-132的间充质干细胞来源外泌体在缺氧条件下对人脐静脉内皮细胞功能的影响

目的 探讨装载miRNA-132的间充质干细胞外泌体在缺氧环境中对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的保护作用及其机制.方法 通过电转法分别将miRNA-132阴性对照(NC)和miRNA-132 mimics转入间充质干细胞来源的外泌体中,即为对照外泌体(Exo)和装载miRNA-132的外泌体(miRNA-132 Ex...     

弓形虫病基因诊断的动物实验研究

目的：建立敏感、特异、稳定的PCR法，用于弓形虫病诊断。方法：选择与合成引物并确立最佳扩增条件，用PCR法检测实验感染鼠血液中弓形虫DNA，并与ELISA法检测循环抗原(CAg)作比较。结果：该PCR检测弓形虫DNA法特异性强，对其他7种寄生虫DNA均不扩增；敏感性高，可检测到0．2pg DNA；检测急性感染弓形虫小鼠血液最早于感染后第2天出现用性，与ELISA法查CAg比较。PCK检测弓形虫DNA法阳性出现时间早、检出率高。结论：该PCR法可应用于弓形虫感染的早期诊断。     

CircRNA_005647通过结合miR-27b-3p抑制小鼠心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达

目的 研究环形RNA circRNA_005647对小鼠心肌成纤维细胞（CFs）纤维化表型的影响及分子机制。方法 利用血管紧张素Ⅱ 缓释泵[1.46 mg/ （kg·d）,2周]诱导建立小鼠高血压心肌纤维化模型,采用Masson染色观察心肌纤维化程度。实时荧光定量PCR检测发生纤维化的小鼠心肌及血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠CFs中circRNA_005647的表达。利用放线菌素D和RNase R实验检测circRNA_005647的稳定性。利用重组circRNA_005647 腺病毒（rAd-circRNA_005647）感染小鼠CFs,检测CFs中纤维化相关基因Col1a1、Col3a1、Acta2 的mRNA和蛋白表达变化。双荧光素酶报告基因实验、RNA反义纯化实验及RNA Pulldown实验验证circRNA_005647与微小RNA miR-27b-3p的结合作用。结果 RT-qPCR结果显示,circRNA_005647在高血压诱导纤维化的小鼠心肌和Ang-II处理的小鼠CFs中表达增强（P<0.01）。放线菌素D和RNase R实验证实circRNA_005647比其宿主基因 Myo9a mRNA具有更好的稳定性（P<0.01）和抵抗 RNase R的降解作用。过表达 circRNA_005647可显著抑制小鼠CFs中纤维化相关基因 Col1a1、Col3a1和 Acta2表达（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验、RNA反义纯化实验及 RNA Pull down实验一致性地证实了circRNA_005647与miR-27b-3p之间存在特异结合作用,miR-27b-3p具有促进小鼠CFs的纤维化表型作用（P<0.05）,并可减弱circRNA_005647对小鼠CFs中纤维化相关基因表达的抑制作用。结论 CircRNA_005647在心肌纤维化中表达增强,并通过结合miR-27b-3p发挥抑制心肌纤维化作用。     

聚合酶链反应检测泌尿系结核患者尿中结核杆菌

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对３４例泌尿系结核病人的２４小时尿液标本进行结核杆菌染色体中３３６－ｂｐ重复序列ＤＮＡ片段的扩增检测，阳性率为９４．１％。ＰＣＲ检测２４小时尿样中结核杆菌比尿沉淀物涂片法找抗酸杆菌（阳性率５６％）及结核杆菌快速培养法Ｂａｃｔｅｃ培养结核杆菌（阳性率７０．６％）更敏感。我们还用ＰＣＲ、涂片法、Ｂａｃｔｅｃ培养法检测了１０例非泌尿系结核者中结核杆菌，阳性结果分别为０、０、３     

Synergistic Effects of 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and N-nitrosodiethylamine tion Cell Malignant Transformatition

Objective The present paper aims to investigate the effect of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) and N-nitrosodiethylamine (DEN) on tumorigenesis and its potential mechanism. Methods The potentials of TCDD and DEN in separation or in combination to induce malignant transformation were tested in Balb/c 3T3 cells by using a cell transformation assay method. The possible mechanism of observed effects was studied further by adding α-naphthoflavone (α-NF), a competitive binding agent of TCDD, to the Aryl hydrocarbon receptor (AhR) pathway. The mRNA expressions of Cyp1a1 and Cyp2a5 gene in Balb/c 3T3 cells treated by DEN and TCDD in separation or in combination with or without presence of α-NF were measured with fluorescence quantification RT-PCR technique. Results The cell transformation frequency (TF) was significantly higher in case of induction with TCDD in combination with DEN, as compared to that with either TCDD or DEN alone. These effects were not inhibited via α-NF. The mRNA expression levels of both Cyp1a1 and Cyp2a5 were enhanced by TCDD treatment alone, but this inducible effect was blocked in cells treated by TCDD and DEN in combination. Conclusion TCDD and DEN had a significant synergistic effect on tumorigenesis when they were used in combination. AhR pathway may not be the key mechanism of this synergistic effect. Thus, it is necessary to further test the potential mechanism involved in cancer development.     

大鼠谷胱甘肽S-转移酶P1基因顺式调控元件的搜寻

目的搜寻大鼠谷胱甘肽Ｓ－转移酶Ｐ１基因（ｒａｔｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓ－ｆｅｒａｓｅＰ１，ｒＧＳＴＰ１）上游３．０ｋｂ区域内顺式调控元件。方法采用高灵敏度的荧光素酶报告基因载体，以外切酶Ⅲ（ＥｘｏⅢ）、Ｓ１核酸酶对上述３．０ｋｂ片段进行删切后造成缺失，将所获得的一系列缺失质粒分别转染ＨｅＬａ细胞，测定转染细胞裂解液荧光素酶活性。结果当删切从－２．９ｋｂ进展至－２．３ｋｂ时，荧光素酶活性降低６７％（Ｐ＜０．０５），－２．５ｋｂ～－２．２ｋｂ区域能以不依赖于位置、方向性的方式增强基因表达强度，从－１．８ｋｂ缺失到－１．３ｋｂ时，荧光素酶活性升高４倍（Ｐ＜０．０５）。结论ｒＧＳＴＰ１基因上游在－２．５ｋｂ～－２．２ｋｂ及－１．８ｋｂ～－１．３ｋｂ区域内分别存在增强子元件和负调控序列。     

芳香烃受体通过介导Th17/Treg分化调控蟑螂过敏原诱导的哮喘

探讨芳香烃受体（AhR）是否能够通过介导肺内Th17/Treg细胞的分化来调控蟑螂过敏原（CRE）诱导的哮喘。方法 通过蟑螂过敏原激发和致敏,建立哮喘小鼠模型。部分哮喘小鼠给予 AhR 激动剂（TCDD）(10 μg/kg)或 AhR 拮抗剂（CH223191）（10 mg/kg）刺激。实验小鼠分为4组：对照组、哮喘组（CRE）、AhR激活组（CRE+TCDD）及AhR拮抗组（CRE+TCDD+CH223191）。通过RT-PCR检测哮喘小鼠肺内AhR及其下游Cyp1a1和Cyp1b1基因的表达;免疫组化染色观察哮喘小鼠肺内炎症变化;酶联免疫吸附试验（ELISA）监测炎症细胞因子的表达;采用流式细胞术检测肺及纵膈淋巴结中Treg的表达。结果 TCDD和CH223191能够调控哮喘小鼠肺内AhR及其下游基因Cyp1a1和Cyp1b1的表达（P<0.002）;AhR激活后肺内炎症细胞及粘液分泌较CRE组减少,促炎因子IL-4、IL-13和Th17A表达减少（P<0.001）,而抑炎因子IL-10、IL-22和TGFβ1表达增加（P<0.001）,而拮抗AhR后逆转了这一现象,且与CRE组无统计学差异（P>0.05）;AhR激活后肺及纵膈淋巴结中Treg细胞及其转录因子FOXP3表达明显增加（P<0.001）,Th17细胞转录因子RORγt基因表达水平明显降低（P<0.001）,而拮抗AhR后,与激活组相比,肺及纵膈淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞及其转录因子FOXP3表达减少（P<0.001）,RORγt基因表达水平增加（P<0.001）;与CRE组相比,差别无统计学意义（P>0.05）。结论 AhR通过介导Th17/Treg细胞分化来调控哮喘小鼠肺部炎症。     

天然的人源性核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定

目的构建库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体（ScFv）库,为进一步筛选ScFv奠定基础。方法从健康自愿者的外周血淋巴细胞提取mRNA,经RT-PCR分别扩增抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）DNA,进而连接形成ScFvDNA。将其连接T-Vector转化E．coliJM109大肠埃希菌,经蓝白筛选,挑取9个阳性克隆测序以鉴定ScFv组装。通过体外转录和翻译对抗体文库进行初步鉴定。结果VH、VL和ScFvDNA分别约为350、650和1100bp。本试验成功构建ScFv核糖体展示模板。结论成功构建天然的大容量核糖体展示人源性ScFv文库,为下一步利用亲和富集筛选技术获得各类ScFv奠定基础。     

用聚合酶链反应技术诊断结核病

用聚合酶链反应技术对结核杆菌特异性重复序列ＩＳ６１１０部分基因１２３ｂＰ的片段进行扩增。该法检测人型结核杆菌灵敏度可达到１０ｆｇＤＮＡ，对１４９份结核患者临床标本检测结果显示ＰＣＲ总阳性率（６９．１％）明显高于直接涂片荧光镜检（１５．４％）与细菌培养（１０．１％）的阳性率（Ｐ＜０．０１）。研究表明ＰＣＲ是一种特异、敏感、快速诊断结核病的好方法，值得推广。     

应用竞争聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

目的探讨竞争聚合酶链反应(C-PCR)在乙型肝炎病毒(HBV)临床检测中的意义。方法根据中国人群最常见的HBV病毒adr亚型基因组序列合成一对HBV特异的引物，并制备内对照DNA，将适量的内对照DNA加入到常规HBV DNA PCR检测反应体系中，使其与HBV靶序列共扩增。结果在20μl C-PCR反应体系中，加入约100～500拷贝内对照DNA能够有效的获得共扩增信号；在120个临床血清标本的C-PCR扩增中识别出5个不能有效扩增的标本。结论C-PCR能够有效地指示临床标本HBV DNA体外扩增的假阴性。     

苯引起鼠胸腺细胞DNA的损伤及其机制的研究

目的研究苯对小鼠胸腺细胞DNA的损伤及其机制. 方法运用单细胞凝胶电泳技术,将苯分为3个浓度组染毒胸腺细胞,测定胸腺细胞DNA的彗星尾长.结果在有代谢活化系统存在下,苯对小鼠胸腺细胞DNA产生损伤,且呈浓度依赖.但加入抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸后,可抑制苯对胸腺细胞DNA的损伤.结论苯能引起胸腺细胞DNA损伤,可能与其代谢物有关.     

环介导等温扩增法对乙肝病毒的快速检测和分型

目的针对乙肝病毒(HBV)不同亚型,建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,实现对HBV的快速检测及基因分型。方法分别设计HBV B、C、D三亚型基因组特征序列的LAMP引物,优化反应条件,建立特异灵敏的HBV亚型LAMP检测方法,并与Real-time PCR方法进行临床样本检测结果比对。结果 LAMP法在数十分钟内有效地检测出HBV的B、C、D三亚型;其中,HBV-B亚型的检出限为17拷贝;C亚型的检出限为25拷贝;D亚型的检出限为10拷贝。与Real-time PCR法相比,灵敏度提高1 000倍左右。结论 LAMP法可实现HBV的快速检测及分型,具有高特异度和高灵敏度,可用于临床检测诊断。     

鸭疱疹病毒1型实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立检测鸭疱疹病毒1型(鸭瘟病毒)的实时荧光定量PCR方法,为快速诊断、致病机理研究及抗病毒药物筛选等奠定基础。方法根据病毒DNA聚合酶基因的序列,设计引物和探针,采用TaqMan探针技术进行实时荧光定量PCR,用含有125bp扩增产物的pMD18-T载体质粒为阳性对照,构建标准曲线,对该方法的特异性、可重复性、敏感性进行评价,同时与传统PCR方法进行比较研究。结果标准曲线表明在2.3×105~2.3×10拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到23个阳性质粒,说明有很好的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为1.22~6.69以及2.09~8.84,说明有较好的重复性;对非鸭瘟病毒DNA无扩增,说明有很好的特异性;在对病毒DNA的检测方面,比传统PCR的敏感性高出104倍。结论成功建立了针对鸭瘟病毒的特异、敏感、重复性强且可准确定量的实时荧光定量PCR方法。     

非小细胞肺癌的随机扩增多态DNA分析

目的：用ＲＡＰＤ技术检测非小细胞肺癌组织的遗传改变。方法：选用４０条含１０个碱基的随机引物对１６例非小细胞肺癌进行ＲＡＰＤ扩增,扩增产物在含溴化乙锭的１．５％琼脂糖凝胶中电泳,紫外透视仪上观察照相。结果：４０条引物都能扩增出清晰的条带,其中２２条引物产生的条带在肿瘤与其相应正常组织间无差异,表现为单态性;１８条引物扩增出的ＤＮＡ序列在肿瘤与其相应正常组间存在差异,表现为带的缺失、增加、移动和带强弱     

套式聚合酶链反应扩增尿素酶A基因检测幽门螺杆菌

应用互补于幽门螺杆菌(HP)尿素酶A基因片段的两对引物进行套式聚合酶链反应(N-PCR),外引物的扩增片段为552bp,内引物扩增片段为310bp,用该方法检测1株HP标准菌株(N-CTC14126)和20个HP临床分离株均阳性,而其他12种肠道菌均为阴性,特异性100％,敏感性可检测到0.1fg细菌DNA的水平,优于目前国外的报道。取胃粘膜活检标本30例,用细菌培养、尿素酶试验、组织学染色作为参照方法检测,20例为阳性,10例阴性,N-PCR检测结果与之完全一致。     

脆性X综合征的PCR筛查与诊断

采用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术结合变性序列胶银染方法对１６９例智力低下（简称智低）疑诊病例及６个脆性Ｘ综合征家系中３３名成员的ＦＭＲ１基因（ＣＧＧ）ｎ重复序列进行了分析,结果发现：（１）智低疑诊病例中３例男性未检出ＰＣＲ阳性产物;（２）脆性Ｘ综合征家系内,５例男性先证者亦未检出ＰＣＲ扩增带;（３）对上述ＰＣＲ结果为阴性的８例男性智低患者（此８例均经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证实为全突变患者）,设立ＦＲＡＸＥ位点引物作内对照,结果仅获得ＦＲＡＸＥ位点的正常扩增产物,故而可排除ＦＲＡＸＡ位点ＰＣＲ产物为假阴性的可能。结果表明,ＰＣＲ分析ＦＭＲ１基因（ＣＧＧ）ｎ重复序列可有效检出前突变携带者,若男性智低患者的ＰＣＲ结果为阴性,在设立内对照基本排除假阴性的前提下,对本病也有提示作用。该方法快速、简便、稳定、可靠,适合于脆性Ｘ综合征的大量群体筛查。     

聚合酶链反应检测175例早期钩端螺旋体病患者...

We have developed a sensitive assay for leptospira, using the polymerase chain reaction (PCR). On the basis of the published nucleotides sequence of 23S rRNA gene from Leptospira interrogans serovar canicola strain Moulton, primers were chosen to produce an amplified fragment of 123 bp. Primer A: 5'GAT CTA ATT CGC TGT AGC AGG3' and primer B: 5'ACT TTC ACC CTC TAT GGT CGG3' Eight different svs. of Leptospira interrogans could all be detected by PCR, but the DNAs from L. biflexa. Leptonema bacteria, virus and human could not produce the specific amplified fragment. The assay detected approximately 10 fg of purified leptospiral DNA and 1 microliter serum of experimental animal. Positive results were obtained from simulated positive samples containing a single organism leptospiral DNA. The diagnostic test (proved by "gold standards": Clinical diagnosis; blood culture and MAT) showed that the sensitivity was 92.00%; the specificity 94.35%; the accuracy 92.54%; the positive predictive value 98.17%; the negative predictive value 78.13%; the positive likelihood ratio 16.25; and the negative likelihood ratio 0.0848. The diagnosis of early leptospirosis by using PCR may become a significant addition to diagnostic means.     

缺口连接酶链反应检测沙眼衣原体DNA的实验研究

目的:建立缺口连接酶链反应方法检测沙眼衣原体.方法:根据编码CT主要外膜蛋白的基因(ompl)的稳定区设计2对互补的寡核苷酸探针.采用G-LCR和常规PCR扩增CT标准株DNA,并对二者检测CT的敏感性进行比较.结果:对5种CT标准株进行G-LCR扩增,均出现54bp长度的DNA片段.敏感性实验可检测出2个CT原体,而PCR可检测出20EBs.G-LCR较PCR敏感10倍;在特异性方面,不扩增肺炎衣愿体及其他细菌DNA,具有很高的特异性.结论:G-LCR用于检测沙眼衣原体特异、敏感、快速、准确,可为CT感染的临床诊断提供依据.