热带假丝酵母菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用初步评价

目的建立、优化快速检测临床标本中热带假丝酵母菌的实时荧光定量PCR方法 ,并对其临床应用进行初步评价。方法用自行设计的高效引物、探针检测5种临床标本中的热带假丝酵母菌,对该方法的敏感性、特异性进行评价,并与真菌培养法进行比较。结果检测临床标本中热带假丝酵母菌的灵敏度可达10 copies/ml,与人类基因组、细菌及其他真菌无交叉阳性反应。与真菌培养法的检测一致性好(Kappa值为0.916,P<0.01)。结论实时荧光定量PCR检测热带假丝酵母菌灵敏度高、特异性强,可直接用于各种临床标本中热带假丝酵母菌的检测,而且可大大缩短报告时间,为临床诊断提供可靠依据。     

PCR检测技术在常见细菌中的运用

目的评价PCR检测技术在临床血流感染细菌中的应用价值。方法为了探索PCR检测技术在细菌中的特异性,在2013年5月至2015年5月期间收集100例血流感染患者为研究对象,对所有患者进行PCR检测技术和血培养检测。结果 PCR检测技术在血流感染患者中常见细菌中特异性为96.25%、敏感性为90.00%,而血培养检测技术在血流感染患者常见细菌中特异性为52.50%、敏感性为30.00%,PCR检测技术敏感性、特异性明显高于血培养(P0.05)。结论 PCR检测技术在血流感染患者常见细菌中具有较高的应用价值。     

定量PCR检测对侵袭性真菌感染肺组织标本病原真菌的诊断价值

目的探讨应用定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测技术诊断侵袭性真菌感染(invasive fungal infection,IFI)肺组织标本病原真菌的临床意义。方法收集2010年6月至2016年6月间我院行手术切除且病理诊断为真菌感染的肺组织标本33例和同期非真菌感染的正常肺组织标本10例为研究对象,设计针对真菌的通用引物和针对隐球菌属和曲霉菌的特异性引物,采用PCR技术和双脱氧链终止法(Sanger法测序)检测石蜡包埋肺切除组织中的真菌。结果实验组33例真菌感染的肺组织标本PCR检测结果均为阳性,与病理诊断相符,Sanger测序可以鉴定真菌到种别。PCR检测与Sanger测序敏感性差异无统计学意义(P>0.05),PCR检测与Sanger测序特异性差异无统计学意义(P>0.05);PCR检测与镜检的种属鉴定率差异有统计学意义(P<0.05),PCR检测与Sanger测序的种属鉴定率差异无统计学意义(P>0.05)。结论定量PCR检测用于诊断侵袭性真菌感染肺组织标本敏感性高、特异性好,具有一定参考意义。     

用PCR技术直接检测白色念珠菌DNA的实验研究

目的建立和评价直接用PCR从血标本中检测白色念珠菌核酸的方法。方法用红、白细胞裂解液、破壁酶和真菌DNA提取盒直接处理血标本,得到的微量靶DNA用白色念珠菌种特异性引物进行扩增。结果在白色念珠菌制备的人血标本中检测出靶DNA,其敏感性达10个孢子/ml以下,从处理标本到报告结果仅需6h。结论用PCR法可特异、敏感地从血标本中直接检测白色念珠菌核酸,有助于临床快速诊断深部白色念珠菌感染。     

真菌通用引物结合高分辨熔解曲线分析检测鉴定常见曲霉菌

目的探索一种能够快速检测鉴定临床常见侵袭性曲霉菌病原的新型分子生物学方法。方法以真菌核糖体RNA基因的内转录间隔区2为靶基因,在5.8S、28S rRNA基因上设计泛真菌通用引物,扩增临床常见曲霉菌。同时用新生隐球菌基因组DNA、人基因组DNA及临床常见细菌基因组DNA进行引物特异性检测。将通用真菌引物扩增产物进行高分辨熔解曲线分析。以新鲜提取的烟曲霉基因组DNA为模板按照1∶10的比例梯度稀释,进行敏感性检测。检测7个浓度梯度的烟曲霉基因组DNA。结果设计的真菌通用引物可以扩增临床常见的4种曲霉菌及新生隐球菌,但与人基因组DNA和临床常见细菌基因组DNA无扩增反应,检测限可低至1.5 pg/μl,且4种曲霉菌及新生隐球菌扩增产物的熔解曲线不同。该方法敏感性和特异性均较好。结论利用真菌通用引物的扩增产物结合高分辨熔解曲线分析可以达到检测鉴定临床常见4种曲霉菌的目的,此方法对侵袭性曲霉菌的快速检测鉴定具有重要意义。     

PCR与RFLP相结合检测全血中真菌感染的研究

目的 建立从临床可疑真菌感染的全血标本中检测常见真菌基因的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测方法.方法 采用PCR-RFLP检测方法检测临床可疑真菌感染的全血标本.提取DNA,用真菌的通用引物ITS1-ITS4扩增真菌ITS1-5.8SrDNA-ITS2区域,并对扩增产物进行MspI酶切分析鉴定,检测是否有真菌感染,并将真菌定位到种.应用此方法鉴定了100例临床可疑真菌感染全血标本,并与传统血培养方法进行对比.结果 100例疑似标本的真菌培养阳性率为26%,而经PCR扩增阳性率为31%.结论 PCR-RFLP检测全血中真菌基因具有快速、敏感性、特异性,有助于临床真菌感染的快速诊断,有一定的临床应用前景.     

实时定量PCR检测白色念珠菌方法学的建立

目的 采用Taq Man MGB探针技术, 建立白色念珠菌实时荧光定量PCR (RQ-PCR) 检测方法, 为临床白色念珠菌的检测提供快捷的方法.方法 以真菌D1/D2区基因的一段高度保守序列为扩增靶序列, 合成白色念珠菌特异性引物和探针, 提取白色念珠菌标准菌株的DNA, 构建含有靶基因片段的重建质粒, 扩增后DNA作为标准品, 建立白色念珠菌RQ-PCR的标准曲线, 并对其重复性、敏感性及特异性等方面进行方法学评价.结果 对构建好的克隆质粒测序, 插入片段与预期片段序列一致, 相似性达100%.白色念珠菌标准曲线为Y=-3.824x+41.36, R2=0.990, 该扩增曲线形态良好.结论 成功建立了实时荧光定量PCR检测白色念珠菌的方法, 其敏感性和特异性较好.     

常见曲霉菌的反向斑点杂交技术的研究

目的 建立常见曲霉菌的反向斑点杂交诊断技术.方法 针对曲霉菌内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)保守基因设计引物和杂交探针,对探针标记、固定在尼龙膜,形成一种杂交膜与PCR产物进行斑点杂交,显色.结果 真菌通用引物扩增常见曲霉菌ITS2基因DNA片段,大小为350bp左右.构建了常见曲霉菌的反向斑点杂交膜,与其PCR产物反应特异性好,灵敏度高.结论 利用PCR技术和反向斑点杂交技术鉴定常见的曲霉菌,方法特异性好、灵敏度高,符合临床需要,能为侵袭性真菌感染提供新的选择.     

Real time PCR与常规血培养在血流感染未知病原体鉴定中的比较研究

目的：观察real time PCR在血流感染病原体检测中的敏感性和特异性,并与常规血培养对比,探讨其临床应用价值。方法以该院各临床科室收集的108份脓毒血症患者血液标本进行real time PCR检测,同时进行常规血培养,比较两种方法的特异性和敏感性。结果108份标本当中,两种方法检测出12种病原微生物。 Real time PCR共检测出阳性标本25份,阴性标本83份。其中与血培养共同阳性标本9份,共同阴性标本78份。两方法的一致性为80.6%。Real time PCR的阴性预测值是0.94,敏感性64%,特异性83%。16例标本real time PCR阳性而血培养阴性,5例标本血培养阳性而real time PCR阴性。同时,有2病标超出real time PCR的检测范围,而血培养阳性。此外,real time PCR无法检测光滑念珠菌。结论real time PCR虽然能快速检测血液感染中病原微生物,但依然不能完全替代血培养。     

实时荧光定量PCR检测泌尿生殖道患者尿液解脲脲原体

目的 应用实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)检测泌尿生殖道患者尿液解脲脲原体(UU),并评价其敏感性和特异性.方法 对140例疑似泌尿生殖道感染患者的拭子和尿液样本,分别采用培养法、SAT进行解脲脲原体检测,检测结果有差异的标本用实时荧光定量PCR法对拭子进行复测,根据实验结果评估SAT检测尿液UU的敏感性和特异性.结果 140例疑似患者试子培养和尿液SAT检测阳性率均为60％,两者比较差异无统计学意义(P＞0.05),其中16例培养结果与SAT检测结果不一致,8例培养法阳性、SAT阴性的拭子PCR结果复测阳性;8例培养法阴性、SAT阳性的拭子标本PCR结果4例阴性、4例阳性,结合培养法结果和PCR结果作为“扩大金标准”,得出SAT对尿液检测的敏感性为95.5％、特异性为100％.结论 SAT检测泌尿生殖道患者尿液UU具有取样方便,检测快速、准确等优点,适用于临床实验室泌尿生殖道UU的检测.     

PCR结合反向斑点杂交在侵袭性肺曲霉病早期诊断中的价值

目的评价和比较血清半乳甘露聚糖(GM)浓度测定和PCR结合反向斑点杂交实验在侵袭性肺曲霉病(IPA)早期诊断中的临床价值。方法用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中GM的浓度;PCR结合反向斑点杂交法检测各组小鼠血清、肺泡灌洗液、肺组织中的曲霉菌DNA。结果 ELISA法测定GM浓度中,实验组血清、BALF的GM实验敏感性、特异性与对照组间差异有统计学意义(P0.05);反向斑点杂交检测血清、肺泡灌洗液、肺组织中曲霉菌DNA含量,实验组阳性率明显高于对照组(P0.05)。用血清标本的反向斑点杂交实验与GM实验、组织病理阳性率进行比较,组织病理的阳性率最高,其次是反向斑点杂交。三种方法的差别均有统计学意义(P0.05)。结论 GM-ELI-SA检测是一项较灵敏、快速的诊断方法,反向斑点杂交实验在IPA早期诊断上的作用优于GM实验。     

辣椒中常见产毒性真菌的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR检测方法

目的将多重实时荧光定量PCR技术与裸磁珠富集技术联用,建立辣椒样品中常见3类（曲霉属、青霉属、镰刀菌属）产毒
性真菌的快速定量检测方法。方法根据真菌核糖体RNA（rDNA）基因序列选择真菌广谱引物及属特异性探针,联用裸磁珠富
集技术,建立多重实时荧光定量PCR体系,并评价所建方法的灵敏度、特异性、重复性和一致性。结果裸磁珠-多重实时荧光定
量PCR方法灵敏度高,与本研究优化后的普通实时荧光定量PCR相比提高了10倍,是原报道的100倍,直接检测辣椒样品中3
类产毒性真菌的检出限均可达103 CFU/ml,即104 CFU/g,且特异性良好（与非目标菌无交叉反应）、重复性良好（CV<1.5%）,该
方法模拟检测辣椒样品中3 类产毒性真菌的计数结果与标准培养法的计数结果相比均无统计学差异（P>0.05）,实验过程仅
需7 h（标准培养鉴定法耗时7~14 d）。结论构建的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法能大大缩短产毒性真菌的检测时间,并
成功应用于模拟辣椒样品中常见3类产毒性真菌的定量检测,值得进一步研究和推广。
     

PCR与RFLP相结合检测全血中真菌感染的研究

目的建立从临床可疑真菌感染的全血标本中检测常见真菌基因的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测方法。方法采用PCR-RFLP检测方法检测临床可疑真菌感染的全血标本。提取DNA,用真菌的通用引物ITS1-ITS4扩增真菌ITS1-5.8SrDNA-ITS2区域,并对扩增产物进行MspI酶切分析鉴定,检测是否有真菌感染,并将真菌定位到种。应用此方法鉴定了100例临床可疑真菌感染全血标本,并与传统血培养方法进行对比。结果 100例疑似标本的真菌培养阳性率为26%,而经PCR扩增阳性率为31%。结论 PCR-RFLP检测全血中真菌基因具有快速、敏感性、特异性,有助于临床真菌感染的快速诊断,有一定的临床应用前景。     

实时荧光PCR方法快速检测空肠弯曲菌方法的建立

目的建立实时荧光PCR快速检测空肠弯曲菌的方法。方法以空肠弯曲杆菌HipO基因的保守序列为模板设计特异性引物探针,建立一种能快速检测样本中空肠弯曲杆菌的实时荧光PCR方法;对方法的特异性和敏感性进行评价,并以正常人粪便为空白样本,添加一定量空肠弯曲菌标准株菌液进行检测,以对方法的检测效果进行初步评价。结果该实时荧光PCR方法只对空肠弯曲杆菌进行特异扩增,同种属的结肠弯曲菌及其他常见食源性病原菌均不能扩增;整个检测过程只需要80min,对空肠弯曲菌菌悬液可检测至5个细菌,对加标粪便样本可检测至10～100个细菌。结论本研究建立的实时荧光PCR检测空肠弯曲菌方法不仅能实现对空弯菌的快速检测,而且还为空弯菌的快速诊断及其引起的食源性疾病的监控溯源提供有意义的参考。     

鸭疱疹病毒1型实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立检测鸭疱疹病毒1型(鸭瘟病毒)的实时荧光定量PCR方法,为快速诊断、致病机理研究及抗病毒药物筛选等奠定基础。方法根据病毒DNA聚合酶基因的序列,设计引物和探针,采用TaqMan探针技术进行实时荧光定量PCR,用含有125bp扩增产物的pMD18-T载体质粒为阳性对照,构建标准曲线,对该方法的特异性、可重复性、敏感性进行评价,同时与传统PCR方法进行比较研究。结果标准曲线表明在2.3×105~2.3×10拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到23个阳性质粒,说明有很好的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为1.22~6.69以及2.09~8.84,说明有较好的重复性;对非鸭瘟病毒DNA无扩增,说明有很好的特异性;在对病毒DNA的检测方面,比传统PCR的敏感性高出104倍。结论成功建立了针对鸭瘟病毒的特异、敏感、重复性强且可准确定量的实时荧光定量PCR方法。     

PCR法和TP-ELISA法检测梅毒的结果分析

目的:探讨巢式PCR法在血液样本梅毒检测中适用性.方法:运用常规及巢式PCR 扩增了梅毒螺旋体(Treponema pallidum,TP)的DNA多聚酶I基因(DNA polymerase I,polA) 的特异性片段,与血清学方法比较,评价了两方法在诊断梅毒中的意义.结果:用PCR法和TP-ELISA检测89份拟诊为梅毒的血液标本,TP-ELISA方法与巢式polA(DNA polymerase I)PCR结果差异有统计学意义;巢式PCR敏感性高于常规PCR.结论:巢式polA(DNA polymerase I )PCR虽然具有高度敏感、特异等优点,但对全血、血清等标本要求较高,是否适合用于血液样本的检测有待进一步研究.     

PCR方法检测实验动物皮肤病原真菌

目的对用于实验动物皮肤病原真菌检测的分子生物学方法即皮肤病原真菌通用引物PCR与AP-PCR（任意引物聚合酶链式反应）相结合技术的特异性及敏感性进行评价,并通过建立动物模型及实际的皮肤真菌检测来验证此方法的可行性。方法特异性测定：用皮肤病原真菌通用引物进行PCR,扩增大肠杆菌DNA、犬肝炎病毒DNA及小鼠肝癌H22细胞DNA。敏感性测定：以紫外分光光度法测定DNA质量浓度,根据测定值将DNA进行10倍系列质量浓度稀释,得到100 ng~10 fg的8个质量浓度,然后对其进行PCR扩增。建立实验动物皮肤病原真菌感染的动物模型。用皮肤病原真菌通用引物PCR与AP-PCR相结合技术检测从动物模型及河北省各地的实验动物单位采集的动物皮肤标本。结果用皮肤病原真菌通用引物扩增实验动物三种皮肤病原真菌标准菌株,均扩增出大小为440 bp的条带,而大肠杆菌、犬肝炎病毒、小鼠肝癌H22细胞均未扩增出条带。皮肤病原真菌通用引物PCR敏感性测定,模板DNA 100 ng~100 fg的7个系列浓度均扩增出了阳性条带,10 fg为阴性。建立了实验动物皮肤病原真菌感染的动物模型。对河北省各地的实验动物皮肤真菌检测过程中出现一例通用引物阳性标本。结论皮肤病原真菌通用引物（CHS1 1S,CHS1 1R）具有较强的特异性,敏感度为100 fg;将皮肤病原真菌通用引物PCR与AP-PCR技术相结合可用于检测实验动物皮肤病原真菌。     

耐甲氧西林葡萄球菌荧光定量PCR检测方法的实验研究

目的建立一种简便、特异的mecA基因荧光定量PCR检测方法,用于耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的快速鉴定。方法以煮沸法快速制备DNA模板,采用SYBR GreenI随机参入法,建立mecA基因的实时荧光定量PCR检测体系。并对检测体系的敏感性、特异性和灵敏度进行评价。结果本法对纯菌落的检测敏感性和特异性分别为98.5%和96.9%,检测灵敏度可达101CFU/ml,最小检菌量约为3个菌/反应体系。结论本实验所设计的荧光定量PCR方法用于MRS的检测具有快捷、高敏感性、高特异性和高灵敏度的特点。适用于MRS的快速检测。     

校正PCR在性别鉴定中的应用

目的 研究校正PCR在性别鉴定中的可应用性.方法 采用突变敏感性"分子开关"介导的PCR针对Y染色体特定序列进行识别.实验包括三个方面:采用普通PCR,针对Y染色体M45(n2032631)位点设计特异性引物结合突变敏感性分子开关,对已知性别的样本进行检测;采用实时定量PCK和突变敏感性"分子开关",以及Y染色体特异性引物YO2对已知性别的样本进行检测;采用Y染色体特异性引物YO2对未知性别的男女模板进行检测.结果 本实验对所采用的小数量样本,在已知性别组与未知性别组的性别鉴定上均达到检测性别与实际性别完全相符,预示着该方法在性别鉴定上的巨大潜在应用价值.     

应用实时荧光PCR技术快速检测B群链球菌

目的 建立一种能够快速、准确、特异的检测B群链球菌的实时荧光PCR检测技术。方法 以B群链球菌cfb基因的保守区为靶区域设计特异引物和TaqMan荧光探针,然后优化反应条件和反应体系,建立检测B群链球菌的实时荧光PCR方法,通过检测实验菌株,对照菌株以及模拟血液,尿液标本对该方法的特异性、敏感性以及灵敏度进行评价。结果 实验结果表明实时荧光PCR方法检测7株B群链球菌均为阳性,其他对照实验菌株均为阴性,且当菌液浓度为 20cfu//ml时,也能获得阳性结果,说明荧光定量PCR法敏感性、特异性以及灵敏度均较高。对模拟尿液标本进行检测时,其敏感性为90%,特异性为100%,检测下限约为2cfu/反应体系。由于标本类型和处理方式的不同,对模拟血液标本进行检测时,其检测灵敏度约为100cfu/mL,低于模拟尿液标本的检测灵敏度。结论 建立的荧光定量PCR技术方法为GBS的快速诊断以及更加准确有效的进行抗生素预防提供了依据,也为在新生儿中进行早发型GBS感染的快速准确诊断提供了新的思路。