数字PCR在几种常见人类传染病研究中的应用

聚合酶链式反应(polymerasechain reaction,PCR)是现代分子生物学的基础,被广泛应用于核酸的定性及定量分析,是人类传染病病毒核酸分析的核心技术.数字PCR(digital polymerase chain reaction,dPCR)作为一种新兴的核酸定量分析技术,具有高精确度、高精密度等优点.它打破了传统实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)技术的局限,不依赖于标准曲线,直接检测样本中靶片段的拷贝数,是一种更为简单且实用的核酸绝对定量分析技术.本文就近几年该技术在人类传染病病毒核酸定量分析方面的研究进行概述.     

幼儿气质的早期干预

目的 通过早期干预使幼儿气质发生良性改变,塑造健全人格,减少行为问题的发生。方法 应用气质问卷对干预组和对照组共计284名幼儿进行气质测评,并将两组中的S型、D型和I－D型作为重点监测对象于两年后再次进行气质测评。在此期间干预组除接受早期教育外,还实施早期行为干预,而对照组则不加任何干预。结果 首次问卷两组儿童的气质类型分布没有差异。干预组经过两年的干预后,S型、D型和I－D型儿童明显减少;同时干预组与对照组比较发现,对照组气质变化不大,两组差异明显。结论 气质不是一成不变的,应尽早抓住时机实施干预,干预越早效果越好。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌实时荧光PCR检测方法的建立和评价

目的建立实时荧光PCR快速筛查耐甲氧西林葡萄球菌株和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株的方法。方法以耐甲氧西林mecA基因的保守序列为模板设计特异性引物探针,建立一种能快速检测样本中耐甲氧西林葡萄球菌的实时荧光PCR方法,结合对金黄色葡萄球菌的特异性NUC基因进行实时荧光检测,可鉴定是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株。以纸片扩散法作为对照方法,对所建立的实时荧光PCR检测方法检测效果进行初步评价。结果该实时荧光PCR方法的整个检测过程只需要1.5h;对22例临床样本进行检测,所建立的荧光PCR方法比纸片法多检出2例耐甲氧西林菌株;对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测结果一致。结论本研究建立的实时荧光PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法不仅能实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的快速检测,更可能为指导临床用药提供有价值的参考。     

H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价

目的应用Taq Man探针实时荧光RT-PCR技术,建立一种快速检测H7N9禽流感病毒的方法。方法针对H7N9禽流感病毒的HA和NA基因分别设计特异性引物和Taq Man-LNA探针,建立H7N9禽流感病毒特异性实时荧光RT-PCR快速检测方法。结果本研究建立的方法对检测H7N9禽流感病毒株的灵敏度达到10 PFU/ml。该方法特异性强,与其他亚型流感病毒株及呼吸道病原体无交叉反应。与对照方法相比,本研究方法的检测阳性符合率为99.07%,阴性符合率为100%,Kappa值为0.993。结论建立的检测试剂盒具有快速灵敏、结果准确可靠等优点,适用于H7N9禽流感病毒的分子生物学检测和监测。     

实时荧光PCR方法快速检测空肠弯曲菌方法的建立

目的建立实时荧光PCR快速检测空肠弯曲菌的方法。方法以空肠弯曲杆菌HipO基因的保守序列为模板设计特异性引物探针,建立一种能快速检测样本中空肠弯曲杆菌的实时荧光PCR方法;对方法的特异性和敏感性进行评价,并以正常人粪便为空白样本,添加一定量空肠弯曲菌标准株菌液进行检测,以对方法的检测效果进行初步评价。结果该实时荧光PCR方法只对空肠弯曲杆菌进行特异扩增,同种属的结肠弯曲菌及其他常见食源性病原菌均不能扩增;整个检测过程只需要80min,对空肠弯曲菌菌悬液可检测至5个细菌,对加标粪便样本可检测至10～100个细菌。结论本研究建立的实时荧光PCR检测空肠弯曲菌方法不仅能实现对空弯菌的快速检测,而且还为空弯菌的快速诊断及其引起的食源性疾病的监控溯源提供有意义的参考。     

高致病性禽流感通用和H5亚型荧光定量PCR方法的建立

目的:建立高致病性禽流感H5亚型荧光定量PCR方法.方法:根据禽流感病毒(AIV)M基因和H5-HA基因分别设计AIV通用和H5亚型特异荧光定量PCR引物和探针,优化反应体系和反应条件,分析该试剂的敏感性、特异性、重复性等.结果:经优化反应体系和反应条件后,AIV通用试剂和AIV-H5试剂的敏感性达到1×101.25EID50水平;与细胞培养比较,AIV-H5试剂Kappa吻合系数κ为0.991(P<0.01),统计学显示两种检测结果的吻合度很强;批内和批间精密度CT值的CV值均远小于10%,可重复性良好.结论:本项目研制的AIV通用试剂和AIV-H5试剂的敏感性、特异性、重复性均好,适合在禽流感疫情和疑似H5禽流感病例中检测使用.     

建立禽流感H7和H9亚型荧光定量PCR检测方法

目的建立高致病性禽流感H7和H9亚型荧光定量PCR方法。方法根据禽流感病毒(avian influenzavirus,AIV)HA-H7基因和HA-H9基因分别设计特异AIV H7和H9亚型特异荧光定量PCR引物和探针,优化反应体系和反应条件,分析该试剂的敏感性、特异性、重复性等。结果经优化反应体系和反应条件后,AIV H7试剂和AIV H9试剂的敏感性达到1×104.67EID50和1×103.80EID50水平,特异性与细胞培养敏感性类似;批内和批间精密度Ct值的CV值均远小于10%,可重复性良好。结论本项目研制的AIV H7和H9亚型的敏感性、特异性、重复性均好,适合在禽流感H7和H9亚型疫情和人类疑似禽流感病例中检测使用。     

黄曲霉毒素B1快速检测方法的研究进展

黄曲霉毒素B1是黄曲霉毒素系列中毒性、危害性、污染性最大的一种,且分布广,对世界范围内的大多数食品原料及成品均有不同程度的污染,严重威胁人类健康。目前,国内外对于黄曲霉毒素B1的检测要求越来越高,新发展起来的快速分析技术也逐渐应用于黄曲霉毒素B1的检测,除了常规的液相色谱法、薄层层析法、胶体金法、酶联免疫吸附法得到更充分的研究和应用外,时间分辨荧光免疫法等新兴免疫学快速检测方法以及具有创新意义的ELISA-TLC组合分析法也已初步建立,这些为实现快速筛查、现场快检,提高检测效率、降低检测成本提供了很好的思路;同时也为更好地维护人民群众饮食安全提供重要支撑。本文就黄曲霉毒素B1的快速检测方法做一综述,以期为进一步提高对黄曲霉毒素B1的监控水平和效率提供参考。     

基于Taqman探针双重实时荧光PCR检测单增李斯特菌

目的:建立双重荧光PCR对单增李斯特菌(LMO)特异性检测同时检测其毒力基因的方法。方法:根据LMO溶血素基因hlyA和內华素基因InlA的保守序列分别设计特异性引物和Taqman探针,优化多重荧光PCR反应体系,进行特异性、敏感性试验。结果:用建立的方法检测LMO标准菌株和24株分离株均出现hlyA和InlA扩增曲线,而沙门菌等其他菌株未见扩增曲线;敏感性试验结果方法的敏感性达到2.5×102 cfu/ml。结论:本研究建立的LMO实时荧光PCR检测方法特异性好、灵敏度高,是快速检测LMO及其毒力基因的有效手段,可用于食品中LMO检测。     

实时荧光PCR方法快速检测空肠弯曲菌方法的建立

目的建立实时荧光PCR快速检测空肠弯曲菌的方法。方法以空肠弯曲杆菌HipO基因的保守序列为模板设计特异性引物探针,建立一种能快速检测样本中空肠弯曲杆菌的实时荧光PCR方法;对方法的特异性和敏感性进行评价,并以正常人粪便为空白样本,添加一定量空肠弯曲菌标准株菌液进行检测,以对方法的检测效果进行初步评价。结果该实时荧光PCR方法只对空肠弯曲杆菌进行特异扩增,同种属的结肠弯曲菌及其他常见食源性病原菌均不能扩增;整个检测过程只需要80min,对空肠弯曲菌菌悬液可检测至5个细菌,对加标粪便样本可检测至10-100个细菌。结论本研究建立的实时荧光PCR检测空肠弯曲菌方法不仅能实现对空弯菌的快速检测,而且还为空弯菌的快速诊断及其引起的食源性疾病的监控溯源提供有意义的参考。