β-1,4半乳糖基转移酶-Ⅰ在大鼠坐骨神经髓鞘中的表达

目的 :分析β -1,4半乳糖基转移酶 -Ⅰ(β -1,4-galactosyltransferaseⅠ ,β -1,4-GalT -Ⅰ)mRNA在正常和损伤坐骨神经髓鞘上的定位及其表达变化。方法 :首先采用RT -PCR方法 ,分析 β -1,4-GalT -Ⅰ在小鼠坐骨神经中的表达存在。以RT -PCR扩增的DNA片断 ,将其克隆到pGEM -T载体中。采用体外转录的方法合成地高辛标记的正、反义 β -1,4-GalT -ⅠRNA探针。最后通过原位杂交及图像分析的方法 ,分析 β -1,4-GalT -ⅠmRNA在正常和损伤大鼠坐骨神经的定位及其表达变化。 结果 :首先通过RT -PCR方法 ,检测到 β -1,4-GalT -Ⅰ在小鼠坐骨神经中的表达存在。应用地高辛标记的正、反义β -1,4-GalT -ⅠRNA探针 ,通过原位杂交发现 β -1,4-GalT -Ⅰ在大鼠坐骨神经的髓鞘中表达 ,并发现其在坐骨神经损伤后 2～ 3天内表达最高 ,随后表达下降。结论 :本实验发现 β -1,4-GalT -Ⅰ在坐骨神经主要表达在髓鞘中 ,并在坐骨神经损伤后发生表达变化。这样把 β -1,4-GalT -Ⅰ的修饰调控功能和雪旺氏细胞的功能相联系在一起 ,为进一步分析β -1,4-GalT -Ⅰ在周围神经再生中的调控机制奠定基础     

β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅱ、Ⅴ表达的亚细胞结构定位研究

目的 :研究 β1,4-半乳糖基转移酶II和V(β1,4-galactosyltransferaseⅡandⅤ ,β -1,4-GalT -ⅡandⅤ )蛋白表达的亚细胞结构定位。方法 :构建 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ融合绿色荧光蛋白 (greenfluorescenceprotein ,GFP)表达质粒 ,分别将构建的质粒转染到PC12细胞和肝癌 772 1细胞中 ,荧光显微镜下观察 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ在其中表达的亚细胞结构定位。 结果 :β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ主要表达在这两种细胞细胞核旁的高尔基复合体。结论 :β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ主要分布在高尔基复合体上 ,提示它们可能是在高尔基复合体参与蛋白质的糖链修饰     

β-1,4-GalT V在体内外施万细胞病理生理过程中的表达及意义

【目的】 观察β-1,4-半乳糖基转移酶V(β1,4 galactosyltransferase V,β-1,4-GalT V)在生理病理状态下体内外施万细胞中的表达情况,探讨β-1,4-GalT V在体内外施万细胞中可能存在的生物学作用。 【方法】 (1)制备大鼠坐骨神经夹伤和切断模型,利用足迹试验观察坐骨神经功能指数(sciatic functional index, SFI);应用腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)建立炎症模型。通过real-time PCR方法,分析β-1,4-GalT V mRNA在损伤及炎症性大鼠坐骨神经中的表达。利用RT-PCR扩增β-1,4-GalT V基因,克隆至pGEM-T载体,经体外转录法合成地高辛标记的正、反义β-1,4-GalT V RNA探针。通过原位杂交及图像分析,观察β-1,4-GalT V mRNA在大鼠正常、损伤及炎症坐骨神经中的表达变化。采用原位杂交与免疫组化相结合的方法检测β-1,4-GalT V的具体细胞定位。(2)利用RNAi和细胞转染等技术干扰β-1,4-GalT V在施万细胞中的表达,运用Lectin Blot检测施万细胞在生理和病理状态N寡糖链合成情况。 【结果】 (1)β-1,4-GalT V mRNA在坐骨神经夹伤后2 周与切断1 周时表达水平明显增高,与正常对照组及其他各组相比,差异有统计学意义(P<0.05),原位杂交结果显示β-1,4-GalT V主要表达于S100阳性的施万细胞中。β-1,4-GalT V mRNA的表达水平与体内炎症模型中LPS作用的浓度和作用时间有关,具有剂量和时间依赖性。(2)体外细胞培养时β-1,4-GalT V mRNA的表达水平及N糖链的合成也与LPS的作用时间和作用浓度有关。干扰β-1,4-GalT V的表达后可明显抑制N糖链的合成。 【结论】 β-1,4-GalT V主要定位于施万细胞中,与正常生理状态下的施万细胞相比,无论是坐骨神经损伤或炎症等病理状态下体内的施万细胞,还是LPS处理的体外培养的施万细胞,其β-1,4-GalT V的表达均有不同程度的变化,提示β-1,4-GalT V在施万细胞的生理病理过程均发挥重要的作用。干扰了施万细胞中β-1,4-GalT V表达后其N糖链的合成也显著减少,证实了β-1,4-GalT V与N糖链的合成密切相关。     

正、反义β1,4半乳糖基转移酶-V表达质粒的构建

目的 :探讨不同 β1,4半乳糖基转移酶 -V (β -1,4-GalTV)表达水平的生物学意义 ,构建正、反义 β -1,4-GalTV表达质粒。方法 :设计 β -1,4-GalTV全长引物 ;提取小鼠脑总RNA ,通过RT -PCR方法 ,得到全长 β -1,4-GalTV基因片段 ,将其克隆到 pGEM -T载体。再通过多克隆酶切位点 ,将 β -1,4-GalTV全长序列克隆到 pcD NA 3 .1表达载体中。设计反义引物 ,以pGEM -β -1,4-GalTV质粒为模板 ,将PCR产物克隆到 pcDNA 3 .1表达载体中。通过酶切和测序鉴定构建的质粒。结果 :通过酶切和测序证实 ,得到了正、反义 β -1,4-GalTV表达质粒。 结论 :正、反义 β -1,4-GalTV表达质粒的构建 ,为进一步研究不同 β -1,4-GalTV表达水平的生物学意义奠定基础。     

正、反义β1,4半乳糖基转移酶-Ⅴ表达质粒的构建

目的探讨不同β1,4半乳糖基转移酶-Ⅴ(β-1,4-GalTV)表达水平的生物学意义,构建正、反义β-1,4-GalTV表达质粒.方法设计β-1,4-GalTV全长引物;提取小鼠脑总RNA,通过RT-PCR方法,得到全长β-1,4-GalTV基因片段,将其克隆到pGEM-T载体.再通过多克隆酶切位点,将β-1,4-GalTV全长序列克隆到pcD-NA 3.1表达载体中.设计反义引物,以pGEM-β-1,4-GalTV质粒为模板,将PCR产物克隆到pcDA3.1表达载体中.通过酶切和测序鉴定构建的质粒.结果通过酶切和测序证实,得到了正、反义β-1,4-GalTV表达质粒.结论正、反义β-1,4-GalTV表达质粒的构建,为进一步研究不同β-1,4-GalTV表达水平的生物学意义奠定基础.     

β-1,4-半乳糖基转移酶的研究进展

β -1,4-半乳糖基转移酶在高尔基体上通过合成 β -1,4糖苷键进行重要的蛋白质糖链修饰作用。同时 β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ在细胞膜上 ,参与多种细胞的增殖、迁移、粘附等信号识别。随着许多编码蛋白具有 β -1,4-GalT活性的新基因被克隆出来 ,有关它们的结构、底物、功能等成为研究热点     

正、反义β1，4半乳糖基转移酶—I表达质粒的构建

目的：为了探讨不同β1,4半乳糖基转移酶-1（β1,4-galactosyltransferase I, β-1,4-GalT-1）表达水平的生物学意义。方法；通过分子生物学手段，构建正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒。设计β-1,4-GalT-I全长引物；提取小鼠脑总RNA，通过RT-PCR方法，得到全长β1,4-GalT-I基因片段，将其克隆到pGEM-T载体。再通过多克隆酶切位点，将β-1,4-GalT-I全长序列克隆到pcDNA3.1表达载体中。设计反义引物，以pGEM-β1,4-GalT-I质粒为模板，将P CR产物克隆到pcDNA3.1表达载体中。通过酶切和测序鉴定构建的质粒。结果：通过酶切和测序证实，实验得到了正义、反义β-1,4-GalT-I表达质粒。结论：正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒的构建，为进一步研究不同β-1,4-GalT-I表达水平的生物学意义奠定基础。     

正、反义β1,4半乳糖基转移酶-Ⅰ表达质粒的构建

目的:为了探讨不同β1,4半乳糖基转移酶-I(β1,4-galactosyltransferase I,β-1,4-GalT-1)表达水平的生物学意义.方法:通过分子生物学手段,构建正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒.:设计β-1,4-GalT-I全长引物;提取小鼠脑总RNA,通过RT-PCR方法,得到全长β-1,4-GalT-I基因片段,将其克隆到pGEM-T载体.再通过多克隆酶切位点,将β-1,4-GalT-I全长序列克隆到pcDNA3.1表达载体中.设计反义引物,以pGEM-β-1,4-GalT-I质粒为模板,将PCR产物克隆到pcDNA3.1表达载体中.通过酶切和测序鉴定构建的质粒.结果:通过酶切和测序证实,实验得到了正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒.结论:正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒的构建,为进一步研究不同β-1,4-GalT-I表达水平的生物学意义奠定基础.     

地高辛标记斑马鱼cd99l2基因RNA探针的制备

目的 制备用于斑马鱼胚胎早期cd99l2基因时空表达检测的地高辛标记RNA探针.方法 设计引物,构建cd99l2/pGM-T重组质粒,用SacII和SalI分别进行酶切得到线性化DNA片段,以Sp6 RNA聚合酶和T7RNA聚合酶转录合成地反义和正义地高辛标记的RNA探针,用整体原位杂交法检测斑马鱼胚胎早期cd99l2基因的表达.结果 成功构建了cd99l2/pGM-T重组质粒,体外转录获得反义和正义RNA探针,反义探针杂交检测证实cd99l2基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中中枢神经系统呈现高表达,正义探针未检测到表达信号.结论 本研究制备的反义cd99l2 RNA探针,兼顾了特异性和敏感性,能有效检测斑马鱼胚胎早期cd99l2基因的定位表达,而正义探针可以作为阴性对照,为进一步探究cd99l2基因在斑马鱼发育过程中的作用机制奠定了基础.     

鸡整胚原位杂交RNA探针的制备

目的：：建立一种快速、简便、高效的鸡胚整胚原位杂交地高辛标记的RNA探针的制备方法。方法：应用RT-PCR方法从鸡胚总RNA中扩增目的片段,连接到PGM-T克隆载体上,分别利用PGM-T载体中的SP6和T7 RNA 聚合酶上的启动子,以线性化的DNA为模板体外转录成地高辛标记的正反义 RNA探针。结果：成功得到地高辛标记的 RNA 探针,探针在鸡整胚原位杂交中有杂交信号。结论：成功转录得到地高辛标记的正反义探针,为后续的以鸡胚为模型整胚原位杂交试验做好了探针的准备。     

雪旺氏细胞表达β-1,4半乳糖基转移酶-I对神经元轴突生长的影响

为了探讨周围神经雪旺氏细胞中不同 β -1,4半乳糖基转移酶 -I(β -1,4-galactosyltransferaseI ,β -1,4-GalT -I)表达水平对神经元轴突生长的影响 ,本实验首先构建了正、反义 β -1,4-GalT -I表达质粒 ;然后将构建的不同浓度的正、反义表达质粒超表达于分离、纯化的大鼠雪旺氏细胞 ;最后将转染的雪旺氏细胞与分离的大鼠背根神经节共培养 ,根据共培养神经元轴突延伸的数目和面积 ,分析雪旺氏细胞中不同 β -1,4-GalT -I表达水平对神经元轴突生长的影响。结果发现 :转染正义 β -1,4-GalT -I的雪旺氏细胞能促进共培养神经节轴突的长出和延伸。在一定的转染浓度内 ,这种促神经生长作用随转染浓度增大而增强 ,而转染反义 β-1,4-GalT -I却有相反的作用。提示周围神经雪旺氏细胞中表达 β -1,4-GalT -I可能在维持正常神经的功能和促进损伤神经的修复发挥重要作用     

HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的 探讨HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用机制,从而为进一步研究其在造血发育中的功能奠定基础.方法 提取斑马鱼总RNA,利用RT-PCR克隆得到HOXC4基因片段,将克隆得到的基因片段和载体pCS2+用限制性内切酶BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切后,把基因片段插入pCS2+中,重组质粒经双酶切及测序鉴定后,采用T3 RNA聚合酶体外转录体系制备地高辛标记的HOXC4基因反义mRNA探针,然后行全胚胎原位杂交.结果 构建HOXC4-pCS2+重组质粒,获得地高辛标记的反义mRNA探针并且完成其在野生型斑马鱼中的全胚胎原位杂交,显示HOXC4基因在Tuebingen野生型斑马鱼神经系统高表达.结论 得到HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的基本表达情况,为进一步研究该基因在造血发育过程中的功能奠定了基础.     

经典H-2分子mRNA探针的制备及在C57小鼠中枢神经系统原位杂交中的应用

目的:研究经典H-2基因在C57小鼠中枢神经系统中的表达谱,设计合成地高辛标记的经典H-2 mRNA探针.方法:利用PCR扩增出针对经典H-2分子的特异性保守片段,然后将PCR产物纯化后与pGEM-T Easy载体连接,转化到大肠杆菌DH5α中.测序后获得目的基因的单克隆,扩增并提取质粒,采用体外转录的方法合成地高辛标记的经典H-2 mRNA的正、反义RNA探针.运用原位杂交方法分析经典H-2基因在C57小鼠中枢神经系统中的表达情况.结果:成功构建了321 bp经典H-2 mRNA的正、反义探针,原位杂交方法检测到经典H-2 mRNA在出生后15 d小鼠中枢神经系统中反义探针有杂交信号,正义探针无杂交信号.结论:正义探针无杂交信号表明合成的321 bp经典H-2 mRNA反义探针具有特异性.     

腺苷酸活化的蛋白激酶在食管鳞癌中的表达及其临床意义

【摘要】 目的探讨HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用机制,从而为进一步研究其在造血发育中的功能奠定基础。方法提取斑马鱼总RNA,利用RT-PCR克隆得到HOXC4基因片段,将克隆得到的基因片段和载体pCS2+用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,把基因片段插入pCS2+中,重组质粒经双酶切及测序鉴定后,采用T3RNA聚合酶体外转录体系制备地高辛标记的HOXC4基因反义mRNA探针,然后行全胚胎原位杂交。结果构建HOXC4-pCS2+重组质粒,获得地高辛标记的反义mRNA探针并且完成其在野生型斑马鱼中的全胚胎原位杂交,显示HOXC4基因在Tuebingen野生型斑马鱼神经系统高表达。结论得到HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的基本表达情况,为进一步研究该基因在造血发育过程中的功能奠定了基础。     

PCR引物法及随机引物法标记cDNA探针杂交效率的研究

目的 :为提高原位杂交所用cDNA探针的杂交效率。方法 :采用正义引物PCR法及正义、反义引物PCR法制备地高辛 (Dig)标记的TGF_βcDNA探针。同时采用常规的随机引物法标记上述探针。用斑点杂交及原位杂交法比较三者的效率。结果 :在斑点杂交中 ,正义引物PCR法所标记的单链探针的杂交效率最高 ,高于随机引物法一个数量级。在探针浓度相同条件下 ,正义引物PCR法标记探针的原位杂交效果优于随机引物法标记的探针。正义和反义引物PCR法标记的双链探针的杂交效率次于正义引物PCR法所标记的单链探针     

脂质体介导a1,4-Gal T反义寡核苷酸对人脑胶质瘤细胞系SWO-38的作用

目的研究α1,4半乳糖糖基转移酶(α1,4Gal T)基因反义寡核苷酸(antisense oligonuc1eotide,ASO)对脑胶质瘤细胞系SWO-38细胞的增值与凋亡的影响和与Fas表达的关系.方法采用脂质体介导的基因转染方法将α1,4Gal T基因ASO转入SWO-38细胞中.应用RT-PCR检测对α1,4Gal T mRNA表达的影响,克隆形成试验检测对细胞增值的作用,流式细胞术(FCM)和琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡的发生,FACS检测凋亡相关蛋白Fas表达的变化.结果脂质体介导的ASO转染后,经RT-PCR检测证实α1,4GalTmRNA基因的表达下降;克隆形成试验显示细胞生长明显受到抑制(P＜0.01);DNA电泳图像呈凋亡表现;FCM检测表明,导入α1,4Gal T基因ASO的SWO-38细胞的凋亡明显增加(P＜0.01);Fas蛋白表达水平明显下降(P＜0.01).结论α1,4GalT基因ASO可诱导脑胶质瘤细胞系SWO-38细胞凋亡发生,其机制可能与fas基因调控有关.     

硫代反义脱氧寡核苷酸对脑胶质瘤SWO-38细胞的作用

目的　研究α1,4半乳糖糖基转移酶 (α1,4GalT)基因硫代反义核酸对脑胶质瘤细胞系SWO -3 8细胞的增值与凋亡的影响及其与Bcl -2和Bax表达的关系。方法　采用脂质体介导的基因转染方法将人工合成α1,4GalT基因反义核酸转入SWO -3 8细胞中。应用RT -PCR检测对α1,4GalTmRNA表达的影响 ,应用克隆形成实验检测对细胞增殖的作用 ,应用流式细胞术 (FCM)和琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡的发生 ,应用FCM检测Bax和Bcl -2表达的变化。结果　反义核酸转染后 ,经RT -PCR检测证实α1,4GalTmRNA基因的表达下降 ;克隆形成试验显示细胞生长明显受到抑制 (P <0 .0 1) ;FCM检测表明 ,导入α1,4GalT基因反义核酸的SWO -3 8细胞的凋亡明显增加 (P <0 .0 1) ,Bcl -2蛋白表达显著下降 (P <0 .0 1) ,而Bax蛋白表达显著提高 (P <0 .0 1)。结论　α1,4GalT基因硫代反义核酸可诱导脑胶质瘤细胞系SWO -3 8细胞凋亡 ,其机制与Bcl-2和Bax基因调控有关     

Pax5基因在野生型斑马鱼全胚胎发育早期的表达

[摘要]：目的 构建斑马鱼pCS2+-pax5重组质粒,经体外转录合成斑马鱼pax5基因的反义mRNA探针。方法 提取斑马鱼胚胎总RNA后经RT-PCR克隆斑马鱼pax5基因片段,将得到的pax5基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,通过对重组质粒进行双酶切、菌落PCR以及插入片段序列测定鉴定后,经T3 RNA体外转录体系合成地高辛标记的pax5基因的反义mRNA探针。结果 采用RT-PCR和pCS2+载体等相关技术获得了斑马鱼pax5基因克隆,经酶切、菌落PCR以及测序鉴定证明得到了pCS2+-pax5重组质粒以及pax5基因的反义mRNA探针,经过斑马鱼全胚胎原位杂交技术检测了斑马鱼pax5基因在野生型斑马鱼发育过程中的表达情况。结论 成功构建了pCS2+-pax5重组质粒、制备了pax5基因的反义mRNA探针以及完成了野生型斑马鱼不同时相的全胚胎原位杂交。     

细胞外信号调节激酶在脂多糖诱导内皮细胞β-1，4-半乳糖基转移酶-Ⅰ表达中的作用

目的:研究细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)对脂多糖(LPS)诱导内皮细胞β-1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ(β-1,4-galactosyltransferase-Ⅰ,β-1,4-GalT-Ⅰ)表达的调节作用。方法:应用ERK通路抑制剂U0126预处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)2 h,再用LPS刺激HUVECs 4 h,分别用RT-PCR和Western-blot方法检测β-1,4-GalT-ⅠmRNA及蛋白水平表达变化,并通过内皮-单核细胞黏附试验观察HUVECs黏附能力的改变。结果:U0126显著抑制LPS引起的HUVECsβ-1,4-GalT-Ⅰ表达的上调及其黏附能力的上词。结论:ERK信号转导通路可能参与调节LPS诱导的内皮细胞β-1,4-GalT-Ⅰ的表达,并影响内皮细胞的黏附能力。     

地高辛标记的原位杂交法检测神经肽Y表达的条件优化

目的:优化用地高辛标记的原位杂交法检测小鼠海马结构中神经肽Y的表达.方法:用体外转录法获得地高辛标记的神经肽Y的反义和正义RNA探针.用kainic acid诱导小鼠脑组织中神经肽Y表达,2 h后牺牲小鼠,制备12μm厚的海马组织切片.然后比较不同pH值(7.5～9.5)的固定剂,不同的固定时间,不同的杂交前预处理,以及不同预杂交及杂交液对杂交信号的影响.结果:从pH 7.5～9.5,不同碱性固定液对杂交信号没有明显影响.30 min的固定时间足以获得满意的杂交结果.用蛋白酶K部分消化切片或用TritonX-100打孔反而降低了杂交信号.40 mg/L Salmon sperm DNA或250 mg/L bakers yeast RNA可获得与Denhardt's杂交液相同的杂交信号.结论:通过优化,我们获得了一种简便而又有效的地高辛标记的原位杂交法,用于检测神经肽Y表达.