大肠杆菌表达人MCP-1的活性

0　引言　趋化因子在人类肿瘤的发生及其生物学行为中所起的作用越来越为人们重视 .利用原核表达载体 p GEX- 4T- 1在大肠杆菌中重组表达人单核细胞趋化蛋白 - 1(MCP- 1) ,并在体外和体内实验中对其生物学活性进行了初步的研究 .1　材料和方法1.1　材料　原核表达载体 p GEX- 4T- 1及大肠杆菌菌株JM10 9由本校分子生物学研究所提供 .Balb/ c nu/ nu小鼠 ,6～ 8wk龄 ,雌性 ,体质量 14～ 16 g,由上海肿瘤研究所提供 .胃癌 SGC790 1细胞系由西京医院消化病研究所提供 .1.2　方法1.2 .1　融合蛋白 GST- MCP- 1的表达　将人 MCP- 1基…     

弓形虫GRA7基因在大肠埃希菌中的表达

目的　在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白(GRA7)。方法　将弓形虫GRA7基因克隆入原核表达载体p GEX- 4 T- 1,构建重组质粒p GEX- 4 T- 1/GRA7并转化大肠埃希菌BL2 1。IPTG体外诱导重组质粒菌的表达,对表达的GRA7融合蛋白进行SDS- PAGE和Western- blotting分析。结果　成功构建了p GEX- 4 T- 1/GRA7重组质粒,该重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,该蛋白能与抗GST抗体结合。结论　GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达。     

NNMT基因重组表达质粒的构建以及在大肠杆菌中的表达

目的利用p GEX—4T-2表达系统表达制备尼克酰胺N-甲基转移酶（NNMT）抗原。方法根据NCBI核苷酸数据库编码为gi：12652950人NNMT cDNA序列，设计合成编码NNMT的DNA引物，并分别在5’端和3’端设计BamHI和XhoI位点，利用RT-PCR从人肝组织中克隆NNMT基因，经T—A克隆、亚克隆至p GEx-4T-2表达载体，重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR（DE3），经异丙基-β—D-硫代乳糖苷诱导表达，Glutathione Sepharose 4B亲和层析制备融合蛋白（GST-NNMT）。通过DNA测序来证实质粒p GEX-4T-2／NNMT的正确性，SDS—PAGE电泳以及Western—blot判断GST-NNMT蛋白的准确性。结果限制性内切酶和DNA测序结果表明，编码NNMT蛋白的DNA序列准确插入到 p GEX-4T-2多克隆位点，成功构建表达质粒p GEX-4T-2，NNMT。菌液超声破碎后，融合蛋白主要存在于裂解上清液中，表达量约占菌体总蛋白表达量的20％，每升菌液可表达融合蛋白约4．5mg。Western-blot证实制备的蛋白为GST-NNMT。结论成功地利用基因重组技术制备了NNMT，为制备抗NNMT单克隆抗体和ELISA试剂盒打下基础。     

杀菌/通透性增强蛋白N端cDNA的克隆和表达

目的　克隆杀菌 /通透性增强蛋白 (BPI) N端 c DNA,构建原核和真核表达载体 ,分别在大肠杆菌和 CHO细胞中表达 BPI蛋白 .方法　提取正常人外周血多形核粒细胞 (PMN)总 RNA,经套式 RT- PCR法扩增出 BPI N端 c DNA片段 ,将其克隆入 p GEM- T easy载体中并进行酶切鉴定和序列测定 .然后亚克隆入 p GEX- 4T- 1质粒 ,转化大肠杆菌 ,进行诱导表达 ,表达产物用 Western blot法鉴定 .同时将该基因片断克隆入 pc DNA3质粒 ,通过脂质体转染 CHO细胞 ,免疫荧光法鉴定 BPI的表达 .结果　获得 BPI N端长度为 72 6 bp的基因片断 .序列分析证实该片断中有 4个点突变 ,但均不在活性中心 .在大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量 5 1× 10 3的GST- BPI融合蛋白 ,Western blot反应中在 5 1× 10 3处有显色区带 .G418筛选出的阳性 CHO细胞在免疫荧光反应中产生荧光反应 .结论　我们成功的在大肠杆菌和 CHO细胞中表达了 BPI2 5蛋白 ,为进一步研究 BPI生物学功能奠定了基础     

重组人Grn的克隆与表达

目的 :构建人Grn基因原核表达载体并观察其表达。方法 :从人单核细胞系THP-1细胞c DNA中扩增出Grn片段,通过酶切与连接,将Grn片段构建到p GEX-4T-2质粒载体上,再转化入感受态细胞TOP10,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析,测序正确的重组质粒再转化入感受态细胞DE3中表达蛋白,用Western blot鉴定结果。结果 :构建的p GEX-4T-2表达载体作PCR和双酶切鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与Grn序列设计完全一致,将其转化入DE3中,Western blot结果表明在细菌裂解上清有分子质量为91KD的融合蛋白。结论 :重组人Grn的克隆与表达成功,为进一步研究Grn的功能奠定了基础。     

pGEX-4T-1/HSV2-gG重组质粒的构建及表达

目的 通过基因工程技术,构建含有目的 基因的重组质粒(pGEX-4T-1/HSV2-gG).方法 用PCR技术扩增HSV2-gG基因的免疫优势表位片断;将PCR产物与质粒表达载体pGEX-4T-1连接;然后鉴定含有目的 基因的重组表达载体;并转化大肠杆菌DH5α,诱导表达目的 蛋白;以免疫印迹法检测表达的目的 蛋白.结果 PCR法扩增出1 242 bp的DNA片断;通过PCR法及测序法证实重组质粒中含有1 242 bp的DNA片断.SDS-PAGE和免疫印迹法证实重组蛋白在大肠杆菌中的表达.结论 重组质粒HSV2-gG-pGEX-4T-1的成功构建及表达,为制备HSV-2血清诊断试剂奠定了基础.     

结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达. 方法: 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并转化E.coli JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组表达产物. 结果:成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并表达出约Mr 63 000大小的PPE68/GST融合蛋白,占总菌体的40%. Western Blot检测该融合蛋白能和结核患者多价抗血清发生反应. 结论:成功地构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873,并在大肠杆菌得到表达.     

桥粒芯胶蛋白3前导肽基因的克隆和原核表达

目的：克隆人桥粒芯胶蛋白3前导肽(Dc3p)基因，并进行表达、纯化和鉴定。方法：用PCR法从桥粒芯胶蛋白(Dc)cDNA文库中扩增出Dc3p基因，与pGEX-4T-2载体连接成重组表达质粒pGEX-4T-2／Dc3p；重组质粒转入B121大肠杆菌：经诱导表达谷胱甘肽S-转移酶-Dc3p(GST-De3p)融合蛋白，该蛋白经Glutathione Sepharose4B亲和层析柱纯化，SDS-PAGE和免疫印迹法检测鉴定。结果：经酶切及序列分析鉴定，重组质粒pGEX-4T-2／De3p成功构建，诱导后高表达GST-De3p融合蛋白并得到纯化，免疫印迹法证实表达蛋白为Gsr-Dc3p。结论：获得高表达、高纯度的GST-Dc3p融合蛋白，为De3p的功能及免疫学分析打下基础。     

人神经生长因子基因在大肠杆菌中的表达

目的　为进一步研究神经生长因子 (β- NGF)及其基因的结构及功能奠定基础。方法　自行设计合成一对特异引物 ,直接从人血细胞基因组 DNA中 PCR扩增出 NGF基因片段 ,克隆至 p GEM- T Easy载体 ,p GEM- T- NGF克隆片段再定向插入原核表达载体 p GEX- 5 T,构建的重组体 p5 TNF转化大肠杆菌 JM10 9并经IPTG诱导表达。结果　经限制性酶谱和 DNA测序确证 ,p GEM- T- NGF克隆片段为 β- NGF全长编码序列(380 bp) ;SDS- PAGE、分光光度计扫描和 Western印迹显示 ,p5 TNF转化菌有 40 .5× 10 3u特异区带 ,融合蛋白表达量为 5 0 3.2 mg/ L,占菌体可溶性蛋白总量 (7.4g/ L) 6 .8% ,该产物具 NGF抗原活性。结论　本研究成功克隆 β-NGF基因全长编码序列并在大肠杆菌中获稳定表达 ,同时证实国人 β- NGF基因编码无特殊性     

PA28γ蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备

目的 蛋白酶体激活亚单位3(PA28γ)的表达、纯化及其多克隆抗体的制备.方法 利用pGEX-4T-1原核表达系统表达PA2γ蛋白,经T-A克隆、亚克隆至pGEX-4T-1表达载体;将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),诱导表达PA28γ蛋白,通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白(GST-PA28γ);并用其免疫BALB/c小鼠制备多抗血清,对表达产物和多抗血清进行Western-blot鉴定.结果 成功构建原核表达质粒PA28γ/pGEX-4T-1,且测序正确;获得高纯度的PA28γ蛋白及其高效价的多克隆抗体血清.并得到Western-blot证实.结论 成功利用基因重组技术制备了PA28γ蛋白和抗PA28γ多克隆血清,为该蛋白的生物学功能研究奠定了基础.