STARD7真核表达载体的构建及肝癌细胞HepG1*2稳定转染株的建立及鉴定

SATRD7是一编码295个氨基酸残基,分子量为34.7kDa的新型蛋白质,其生物学功能至今未明。通过生物信息学分析,发现其全长序列中含     

人类基因XAPC7真核表达载体的构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达.方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中.构建好的pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再应用半定量RT-PCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平.结果:pcDNA3.1(-)/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR检测,重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组,证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达.结论:成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株,为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础.     

抗HSPC238单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的制备抗HSPC238的单克隆抗体，为HSPC238的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白HSPC238为抗原，免疫BALB／c小鼠，运用杂交瘤技术制备HSPC238单克隆抗体，并用间接ELISA法和Western—blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果成功建立两株稳定分泌抗HSPC238的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为E001和E002。ELISA检测抗HSPC238单克隆抗体的腹水效价为1：12800和1：25600。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。通过Western—blot实验证实，两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性HSPC238蛋白。结论成功制备了两株效价高、特异性好的抗HSPC238单克隆抗体，制备的抗HSPC238单克隆抗体可用于HSPC238蛋白的鉴定，为HSPC238蛋白的生物学功能研究奠定了基础。     

PA28γ蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备

目的 蛋白酶体激活亚单位3(PA28γ)的表达、纯化及其多克隆抗体的制备.方法 利用pGEX-4T-1原核表达系统表达PA2γ蛋白,经T-A克隆、亚克隆至pGEX-4T-1表达载体;将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),诱导表达PA28γ蛋白,通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白(GST-PA28γ);并用其免疫BALB/c小鼠制备多抗血清,对表达产物和多抗血清进行Western-blot鉴定.结果 成功构建原核表达质粒PA28γ/pGEX-4T-1,且测序正确;获得高纯度的PA28γ蛋白及其高效价的多克隆抗体血清.并得到Western-blot证实.结论 成功利用基因重组技术制备了PA28γ蛋白和抗PA28γ多克隆血清,为该蛋白的生物学功能研究奠定了基础.     

抗PSMA7单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的制备抗蛋白酶体α7亚基(PSMA7)的单克隆抗体,为PSMA7的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白PSMA7为抗原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备PSMA7单克隆抗体,并用间接ELISA法和Western blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果成功建立两株稳定分泌抗PSMA7蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为B013和B001。检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1∶128和1∶256,腹水效价为1∶25600和1∶32000。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。Westernblot及免疫组化实验证实,两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性PSMA7蛋白。结论成功建立了两株效价高、特异性好的抗PSMA7单克隆抗体杂交瘤细胞,制备的单克隆抗体可用于PSMA7蛋白的鉴定,为其生物学功能研究奠定了基础。     

PA28γ蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备

目的蛋白酶体激活亚单位3（PA28γ）的表达、纯化及其多克隆抗体的制备。方法利用pGEX-4T-1原核表达系统表达PA28γ蛋白，经T-A克隆、亚克隆至pGEX-4T-1表达载体；将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR（DE3），诱导表达PA28γ蛋白，通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白（GST-PA28γ）；并用其免疫BALB／c小鼠制备多抗血清，对表达产物和多抗血清进行Westem-blot鉴定。结果成功构建原核表达质粒PA28γpGEX-4T-1。且测序正确；获得高纯度的PA28γ蛋白及其高效价的多克隆抗体血清，并得到Westem-blot证实。结论成功利用基因重组技术制备了PA28γ蛋白和抗PA28γ多克隆血清，为该蛋白的生物学功能研究奠定了基础。     

RalB在多种肿瘤细胞中的表达及意义

目的探讨RalB（v-ral simian leukemia viral oneogene homolog B，ras related；GTP binding protein）蛋白在多种肿瘤细胞中的表达及意义。方法以人胚肾293T细胞为正常细胞对照，选用8种不同组织的肿瘤细胞，采用抗RalB的单克隆抗体通过Western blot方法检测其RalB蛋白的表达。结果RalB在293T细胞中表达明显降低，在乳腺癌细胞株MCF-7、卵巢癌细胞株H08910、宫颈癌细胞株Hela、肺癌细胞株、结肠癌细胞株LOVO、SW480中均有表达，其中RalB蛋白在结肠癌细胞株SW480中表达明显增高。结论RalB可能以组织特异性的方式在不同肿瘤细胞中表达。     

抗人hnRNP A1单克隆抗体的制备及在颅咽管瘤组织中的应用

目的制备核不均一核糖核蛋白Al（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Al，hnRNPAl）的单克隆抗体，探讨hnRNP Al蛋白的生物学功能。方法利用重组hnRNPA1蛋白为免疫原，免疫BALB／c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞SP2／0进行常规融合，通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化。获得鼠抗hnRNPAl单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过ELISA、Western Blot和免疫组织化学实验等方法分别对其效价和特异性进行鉴定。结果成功地建立了3株稳定分泌抗hnRNPAl的单克隆抗体杂交瘤细胞株。分别命名为E006、E009和E012。3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。3株单克隆抗体通过组织化学实验和Western Blot实验都能特异性地结合真核细胞内源性的hnRNPAl蛋白。结论获得了效价高、特异性好的抗hnRNPAl蛋白的单克隆抗体，这为进一步研究hnRNPAl的生物学功能及它在癌发生事件中的作用奠定了基础。     

抗人半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白2单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白2(Cysteine and glycine-rich protein 2,CRP2)的单克隆抗体,探讨CRP2蛋白的生物学功能。方法利用重组CRP2蛋白为免疫原,免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0进行常规融合,通过间接ELISA筛选和有限稀释克隆化,获得鼠抗CRP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过ELISA,Western-blot和免疫共沉淀实验等方法对其特性进行鉴定。结果成功地建立了2株稳定分泌抗CRP2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为F001和F002。两株单克隆抗体与重组抗原有较强的特异性反应。同时,两株单克隆抗体通过Western-Blot实验都能特异性地结合真核细胞内源性的CRP2蛋白,并且,两株抗体都可以应用于免疫共沉淀实验。结论获得了效价高、特异性好的CRP2蛋白的单克隆抗体,为CRP2的生物学功能研究奠定了基础。