聚合酶链反应检测疟疾的研究

目的 建立能鉴别诊断恶性疟原虫间和日疟原虫的PCR检测方法。方法 根据红内期疟原虫SSUr-RNA基因序列，设计合成两对引物，采用PCR技术，检测89份门诊“四热”病人血样，并与镜检法进行比较研究。结果 恶性疟原虫血样能扩增出205bp的特异带，间日疟原虫血样能扩增出120bp的特异带，PCR检测的阳性率为74.16%，镜检法为68.54%,PCR法与镜检法的符合率为94.38%。结论 PCR检测的敏感性和特异性均优于镜检法，对于诊断恶性疟原虫和间日疟原虫以及恶性疟原虫的间日疟原虫的混合感染具有一定的应用价值。     

疟原虫核酸检测技术建立及在献血员筛查应用的研究

目的建立血液中疟原虫检测的核酸技术，探讨应用于献血员筛查的效果。方法根据红细胞内期疟原虫ssurRNA编码基因序列，设计合成三条扩增引物。将5份待检血样混合，采用蛋白酶K消化裂解法制备模板，在同一反应体系中扩增恶性疟原虫和间日疟原虫DNA，诊断鉴别恶性疟和间日疟。与厚血膜镜检法比较评价其灵敏度及特异性。结果将3份恶性疟原虫及10份间日疟原虫感染者的血样随机混入5000份无偿献血者血样中，每5份为一个检测单元，采用PCR方法从感染血样中扩增出分别为436bp和341bp的恶性疟原虫及间日疟原虫特异性的DNA片段，并经序列测定证实扩增片段的正确性；10份间日疟患者血样以及3份恶性疟患者血样均被检出，献血者血样PCR检测结果均为阴性，结果与厚血膜方法完全一致。结论所建立的疟原虫核酸检测技术灵敏度高、特异性好，且可以批量处理，提高了检测的效率，能有效降低疟原虫的输血传播，具有很好的推广使用价值。     

贵州省首例输入性卵形疟病例的鉴定

目的对1例输入性疟疾病例进行鉴定。方法采集病例外周血制作滤纸血样和血涂片。血涂片染色后镜检,同时进行疟疾快速诊断试剂盒(RDT)检测,滤纸血样进行PCR,PCR扩增片段测序后在GenBank中进行Blast分析。结果 RDT检测提示非恶性疟的疟原虫阳性,血涂片镜检可见卵形疟原虫。PCR扩增出大小为880 bp的卵形疟特异条带,Blast分析显示与卵形疟原虫wallikeri亚种的cox3部分基因序列同源性为99.4%。结论依据RDT、镜检、PCR和序列分析等实验室检测结果,结合其流行病学资料,该例输入性疟疾病例确诊为贵州省首次由境外输入的卵形疟病例,且感染的疟原虫虫种是卵形疟原虫wallikeri亚种。     

间日疟原虫红内期SSUrRNA基因片段的扩增、测序及诊断应用

目的：体外扩增间日疟原虫（深圳株）红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因（SSUrDNA）片段，克隆测序分析，并探讨其诊断应用。方法：设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应（PCR）从间日疟患血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段；用PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109；阳性克隆双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列；以SSUrDNA为靶基因，PCR诊断间日疟，双盲法检测40份血样（28份镜检阳性的血样，12份健康血）。结果：间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为341bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；序列测定插入片段为341bp，与SalI株顺序相比，仅在第151位处缺失1个碱基C；以SSUrDNA为靶基因，双盲法检测镜检阳性及健康人血样，结果完全正确。结论：所克隆的间日疟原虫SSUrDNA片段序列在间日疟原虫虫株间高度保守，以其为靶基因建立的PCR检测方法适用于间日疟的诊断。     

应用套式PCR技术检测我国西南部分疟区疟原虫的感染状况

目的　建立鉴别人体四种疟原虫的套式 PCR技术 ,检测我国西南部分疟区疟原虫的感染情况。方法　选用两组疟原虫引物 ,扩增 SSU r DNA特定片段 ,经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色 ,紫外检测凝胶分析仪观察并摄像。结果　采用上述方法扩增出间日疟、恶性疟和三日疟分别为 10 4bp、10 2 bp和 115 bp特异片段。所检测的 138份疟疾患者血样中 ,四川名山县 95份均为间日疟单纯感染 ,筠连县 37份中 10份为与间日疟和 /或恶性疟呈混合感染的三日疟 ,云南金平县的 6份均为合并恶性疟的两种或两种以上疟原虫混合感染。结论　所建立的套式PCR检测系统具有敏感性高、特异性好和稳定可靠等优点 ,在疟疾诊断、虫种鉴别、混合感染的判定、大规模流行病学研究和疫情监控预测等方面具有实际应用价值。     

应用套式PCR技术检测我国西南部分疟区疟原虫的感染状况

目的 建立鉴别人体四种疟原虫的套式PCR技术，检测我国西南部分疟区疟原虫的感染情况。方法 选用两组疟原虫引物，扩增SSUrDNA特定片段，经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，紫外检测凝胶分析仪观察并摄像。结果 采用上述方法扩增出间日疟、恶性疟和三日疟分别为104bp、102bp和115bp特异片段。所检测的138份疟疾患者血样中，四川名山县95份均为间日疟单纯感染，筠连县37份中10份为与间日疟和/或恶性疟呈混合感染的三日疟，云南金平县的6份均为合并恶性疟的两种或两种以上疟原虫混合感染。结论 所建立的套式PCR检测系统具有敏感性高、特异性好和稳定可靠等优点，在疟疾诊断、虫种鉴别、混合感染的判定、大规模流行病学研究和疫情监控预测等方面具有实际应用价值。     

应用双重PCR检测海南疟区发热病人的效果

目的 评价双重PCR检测疟区发热病人的效果。方法 对疟区求诊发热病人，手指取血分别制作厚薄血膜片和滤纸血斑作为检测血样。参照献用恶性疟原虫PF1－2和间日疟原虫PV3－5为特异性引物，同在一个反应体系常规进行PCR，扩增片段分别为206bp和431bp。同时镜检厚血膜作对照。结果 该反应体系最低可检出原虫血症为1个恶性疟原虫／μl血和10个间日疟原虫／μl血的感染；检测132例疟区发热病人血样的阳性率为65．1％，而镜检法为64．4％，且有1例漏诊和3例误诊，两法符合率为97％。结论 双重PCR用于疟区发热病人检测，较镜检敏感、特异，适合我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断，还可用于血检质量的监控。     

恶性疟原虫红内期SSUrRNA编码基因的克隆与序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株红内期小亚单位核糖体核糖核酸SSUrRNA编码基因(SSUrDNA)片段，并进行序列分析。方法根据献报道恶性疟原虫基因序列设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)方法从海南恶性疟患血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSUrDNA目的基因片段，纯化后与PUC19m-T质粒载体连接构建重组子，并导入大肠杆茵JM109；阳性克隆经双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列，并采用ExPASy Proteomicstools软件分析。结果 恶性疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为431bp；阳性克隆重组质粒作双酶切及PCR扩增均得到预期大小的基因片段；测定的SSUrDNA插入片段核酸序列与巴西恶性疟原虫IMTM／7G8相同基因序列对比。未发现碱基的插入或缺失去，同源性为99．3％；第353位碱基由C取代了G，第371位碱基由T取代了C，其余序列相同。结论 成功克隆了恶性疟原虫海南株红内期SSUrDNA基因片段，该序列在不同恶性疟原虫虫株间相对保守。     

间日疟原虫孢子期SSUrRNA基因扩增、鉴定及其诊断应用

目的体外扩增、克隆间日疟原虫孢子期SSUrRNA编码基因特异性片段，分析其分子特征，评价其核酸诊断应用效果。方法根据间日疟原虫基因库相关核酸序列设计引物，采用聚合酶链反应技术从间日疟患者血样DNA提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段，与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109；阳性克隆以双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定分析其序列特征；以SSUrDNA为靶基因，建立间日疟PCR诊断方法，并以镜检法为标准评价其用于间日疟原虫感染的检测效果。蛄果从间日疟患者血样中扩增的SSUrDNA片段大小约为267bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段，含有267个核苷酸，与间日疟原虫Sall株孢子期SSUrRNA基因序列比较，同源性为99．3％，其中第220住为插入了1个碱基“T”，243住碱基由“G”取代了“T”。将纯化的含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以正常人血液核酸提取液倍比稀释成浓度梯度作模板，PER扩增结果显示检测灵敏度至少迭102copy／μl；特异性检验显示仅间日疟原虫患者血样扩增出约267bp的特异性基因片段，而恶性疟原虫、弓形虫、血吸虫、肝吸虫感染患者血样及正常人血未见特异性扩增条带。以镜检法为参照标准，PCR敏感性为100％（102／102），特异性为100％（76／76）。结论所扩增克隆的间日疟原虫孢子期SSUrDNA片段序列具有种特异性且相对稳定，不同地理株间存在单核苷酸多态性，以其为靶基因建立的PCR检测方法敏感、特异，具有良好的推广使用价值。     

多重荧光定量PCR测定疟原虫方法建立

目的建立可同时检测四种疟原虫的多重荧光定量PCR方法。方法 PCR扩增四种疟原虫目的片段,克隆并构建标准质粒,进行梯度稀释。体系按浓度加入五重引物探针,对临床四种疟原虫阳性血样及单一腺病毒和肺炎支原体阳性血样、人基因组进行特异性检测。将本地区优势虫种恶性疟及间日疟阳性血样混合并检测。每个反应做一式三份验证重复性。检测标准品梯度浓度,获得体系最低检测限。结果成功构建四种疟原虫标准质粒。对20份样本进行检测,其中15份恶性疟,3份间日疟,1份三日疟,1份卵形疟,与原有确证结果一致。对单一腺病毒及肺炎支原体阳性血样、人基因组检测结果均为阴性。恶性疟及间日疟阳性血样混合检测显示3条特异性扩增曲线。三个复孔的变异系数在0.17~4.96之间。恶性疟可检测到10~2copies/m L,间日疟、三日疟、卵形疟可检测到10~3copies/m L。结论建立五重荧光定量PCR检测四种疟原虫特异性及重复性均较好,灵敏度高,可用于疟原虫快速筛选及分型鉴定。     

乙型脑炎病毒TaqMan逆转录聚合酶链反应检测方法的建立

目的采用TaqMan技术，研究建立实时荧光逆转录聚合酶链反应技术（RT—PCR）检测乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis，JEV）的效果。方法根据JEV非结构蛋白基因NS3基因序列（GenBank序列号，U15763），结合生物学软件序列比对分析，设计1对特异性引物和TaqMan寡核苷酸探针，优化荧光RT～PCR反应条件后，以模板梯度稀释法及相关毒株对比扩增检验测定方法的敏感度和特异性。结果引物和探针最佳浓度均为0．20uM，复性温度为55℃。方法至少检测出1 copy／止病毒RNA，与流感、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘等病毒均无交叉反应。从病毒核酸提取至完成检测仅需3hr左右。结论所建立的JEV病毒TaqMan荧光RT—PCR方法敏感特异，有助于JEV感染的实验室早期快速诊断。     

聚合酶链反应技术诊断中枢神经系统肠道病毒感染

目的：探讨肠道病毒（ＥＶ）在中枢神经系统感染中的致病情况,建立一种检测ＥＶ感染的方法。方法：采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和病毒分离技术检测４０种ＥＶ标准毒株和４６例无菌性脑膜炎、脑炎病人脑脊液（ＣＳＦ）标本。     

环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的研究

用环介导等温扩增技术(LAMP)快速、灵敏地检测铜绿假单胞菌.利用铜绿假单胞菌gbca基因,特异性设计3对LAMP引物,在反应体系中添加羟基萘酚蓝(HNB)荧光染料,通过反应前后颜色的变化肉眼观察结果,并用琼脂糖凝胶电泳加以验证.对临床标本利用LAMP和PCR法平行检测,验证该法灵敏度、特异性.针对铜绿假单胞菌DNA特异性引物的LAMP法可以扩增,其他无扩增产物.本实验建立的LAMP法具备简便、快速、特异性强和灵敏度高的特点,适于实际应用.     

小细胞肺癌病人外周静脉血中微转移的基因检测及其临床意义

目的 探讨能否在小细胞肺癌(SCLC)病人的外周血中检测到肿瘤特异或相关的基因及其临床意义。方法 收集小细胞肺癌病人的外周血样22份和正常健康人血样20份,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以在小细胞肺癌细胞中高表达神经调节肽B受体(NMB-R)基因作为靶基因对标本进行了检测。结果 检测阈值是10~(-6),在22例小细胞肺癌病人的外周血中有18例(81.8％)检测到了NMB-R基因的表达,而在20个正常人的外周血中仅检测到2例为阳性。其中5例NMB-R基因阳性病人,经化疗后,跟踪复查有3例显示了阴性结果。在预后上外周血中NMB-R基因阳性病人的生存期明显比阴性病人短。结论 用RT-PCR技术检测SCLC病人外周血中NMB-R mRNA是一种敏感且特异的方法,在诊断微转移、判断预后和评估疗效方面也是有益的。     

细胞角蛋白18基因诊断胃癌淋巴结微转移

目的:建立RT-PCR检测细胞角蛋白-18（CK18）mRNA表达的方法,判断胃癌淋巴结内微转移状况,探讨18 mRNA表达在胃癌患者淋巴结微转移中的临床意义。方法:以细胞角蛋白18 mRNA为标志基因,用RT-PCR法检测35例胃癌的298枚淋巴结及良性胃病变的淋巴结20枚。结果:对照的良性胃病变淋巴结无CK18 mRNA表达,胃癌组的298枚淋巴结病理检查阳性99枚（33.2%）,而RT-PCR法检测细胞角蛋白阳性133枚（44.6%）,差异有显著性（P<0.05）。病理检查为阴性的199枚中,经CK18 mRNA RT-PCR法检测有34枚阳性（17.1%）。 结论:用RT-PCR法检测胃癌淋巴结CK18 mRNA是诊断胃癌淋巴结微转移敏感而特异的方法,对判断预后、指导术后治疗有重要意义。     

RT-PCR 扩增MUC1检测胃癌微转移研究

目的 以ＲＴ－ＰＣＲ检测胃周淋巴结胃癌转移细胞并评价其临床应用价值。方法 以ＭＵＣ１ｃＤＮＡ的特异旬为ＲＴ－ＰＣＲ引物,酶切分析法及系列稀释该法的特异性和敏感性进行分析,对临床收集的胃周淋巴样品作ＲＴ－ＰＣＲ检测及产物ＤＮＡ点杂交验证。结果 （１）胃及胃癌组织均存在ＭＵＣ１ｍＲＮＡ的表达;（２）该扩增体系具有较好的特异性;（３）敏感性可达１ｐｇＲＮＡ,相当于从１０＾５个淋巴细胞中检出１个胃癌细胞;     

核酸扩增-液相杂交法检测沙眼衣原体DNA

目的：探讨用核酸扩增（PCR）－液相杂交法检测沙眼衣原体DNA的效果。方法：用PCR－液相杂交法对616份临床标本进行了沙眼衣原体检测，并与培养法比较，对与培养法结果不相符合的标本及部分阴性标本进行连接酶链反应（LCR）复检。结果：PCR－液相杂交相法检测沙眼衣原体特异性良好。灵敏度达到0.1fg，临床标本沙眼衣原体DNA阳性检出率为27.6％，显著高于培养法的6.3%（P＜0.001）。以培养法为标准，此法的灵敏度为100％。以LCR法为标准，此法的灵敏度为97.2％,特异度为80.7%，2者具有较好的相符性。结论：PCR－液相杂交法检测沙眼衣原体DNA操作简便，特异性强，灵敏度高，适合临床应用。     

聚合酶链反应检测汉坦病毒感染的实验研究

目的 早期诊断汉坦病毒感染。方法 根据国际标准株（７６－１１８,３９）Ｍ基因Ｇ１区设计两对公有引物和一条探针,按异硫酸氰胍－酚一步法提取汉坦病毒ＲＮＡ,采用ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ检测病毒细胞培养上清原液及稀释液、１６份对照组血清、４０份ＨＦＲＳ急性期（１～５天）血清标本中的汉坦病毒ＲＡＮ,所有扩增产物采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ或Ｄｏｔ ｂｌｏｔ证实其特异性。结果 汉坦病毒细胞培养液和４０份     

免疫组化法和RT-PCR法检测胃癌淋巴结微转移

目的 :应用免疫组化方法和RT PCR方法检测常规病理检查淋巴结阴性胃癌之淋巴结微转移 ,比较两种检测方法的敏感性同时探讨检测胃癌淋巴结微转移的临床意义。方法 :采用CEA单克隆抗体免疫组织化学方法和CEAmRNART PCR方法分别检测 11例常规病理检查淋巴结阴性胃癌的 2 0 5枚淋巴结。结果 :CEA单克隆抗体免疫组织化学法检出 18枚 (8.8% )微转移淋巴结 ,而CEAmRNART PCR法共检出 46枚 (2 2 .4% )微转移淋巴结 ,两者比较差异显著 (P <0 .0 1)。 11例患者中有 6例存在淋巴结微转移 ,此 6例患者的重新TNM分期均有所上升。随访中发现有 2例微转移阳性患者分别于根治术后第 6、9个月出现复发。结论 :应用CEA单克隆抗体免疫组织化学方法或CEAmRNART PCR法可以检测出常规病理检查遗漏的胃癌淋巴结微转移灶。而且RT PCR法检测胃癌淋巴结微转移较免疫组织化学法更为敏感。检测常规病理检查淋巴结阴性胃癌的淋巴结微转移 ,有助于临床准确分期 ,判断预后及指导治疗。