高致病性禽流感通用和H5亚型荧光定量PCR方法的建立

目的:建立高致病性禽流感H5亚型荧光定量PCR方法.方法:根据禽流感病毒(AIV)M基因和H5-HA基因分别设计AIV通用和H5亚型特异荧光定量PCR引物和探针,优化反应体系和反应条件,分析该试剂的敏感性、特异性、重复性等.结果:经优化反应体系和反应条件后,AIV通用试剂和AIV-H5试剂的敏感性达到1×101.25EID50水平;与细胞培养比较,AIV-H5试剂Kappa吻合系数κ为0.991(P<0.01),统计学显示两种检测结果的吻合度很强;批内和批间精密度CT值的CV值均远小于10%,可重复性良好.结论:本项目研制的AIV通用试剂和AIV-H5试剂的敏感性、特异性、重复性均好,适合在禽流感疫情和疑似H5禽流感病例中检测使用.     

双重荧光实时RT-PCR技术鉴定H9N2亚型禽流感病毒

采用双重荧光实时RT-PCR技术,建立一种简便易行的H9N2亚型禽流感病毒的快速鉴定方法。通过比对GenBank甲型禽流感病毒H9N2亚型的HA和NA基因序列,设计特异性针对HA和NA的引物,分别选用FAM和JOE两种不同荧光标记探针,构建双重实时荧光PCR一步法反应体系,同时检测样本中的HA和NA基因。结果显示:扩增曲线和特异性实验结果显示,该体系具有很好的扩增效率,且仅特异性识别H9N2亚型AIV的HA、NA基因,与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用重组质粒pMD19-T构建HA、NA阳性质粒,10倍梯度稀释液为模板,进行荧光定量PCR。结果证实,本研究所建立的双重荧光定量RT-PCR体系敏感性能达到10个RNA拷贝数。采用本方法检测60份感染动物样品及60份环境样品,与传统PCR方法相比,检测敏感性提高了100倍;与病毒分离鉴定方法比较,二者的鉴定结果完全吻合。该方法具有特异性强、灵敏度高、快速易操作等优点,是H9N2亚型禽流感病毒鉴定的有效方法。     

禽流感病毒H7N2血凝素HA1基因在大肠杆菌中的表达

目的　表达H7N2亚型禽流感病毒 (AIV)HA1基因 ,用于感染H7亚型禽流感病毒抗体的检测和HA1蛋白功能研究。方法　采用RT PCR方法对H7N2亚型AIVHA1基因进行扩增 ,将PCR产物克隆于pGEM T Easy载体 ,将该基因插入pGEX 4T 2中构建HA1基因原核表达载体 ,转化BL2 1大肠杆菌后 ,在IPTG诱导下表达HA1蛋白 ,Westernblot鉴定表达HA1蛋白。电洗脱方法纯化表达HA1蛋白 ,建立间接ELISA方法 ,对感染AIVH7、H9、H5亚型AIV阳性血清进行检测。结果　成功克隆H7N2亚型AIV的HA1基因 ,其核苷酸序列长度 96 6bp ,编码 32 2个氨基酸残基。构建HA1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约 6 1× 10 3的HA1融合蛋白。Westernblot和ELISA方法鉴定表明 :表达HA1蛋白与感染H7亚型AIV鸡血清有反应 ,与H5、H9亚型AIV阳性血清没有反应。结论　本研究在大肠杆菌中成功表达了H7N2亚型AIVHA1基因蛋白 ,具有与感染H7亚型AIV阳性血清反应原性 ,不与H5和H9亚型AIV感染阳性血清发生反应。     

双重荧光定量RT-PCR快速检测流感病毒H1、H3亚型的研究

目的 利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测流感病毒H1、H3亚型的方法.方法 根据H1、H3亚型流感病毒HA基因的相对保守序列,设计两对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立优化反应体系后,将荧光定量RT-PCR的产物采用10倍稀释法,即107～100 copies/μl,再次用荧光定量PCR方法检验建立体系的灵敏度和重复性,并建立相对定量标准曲线;利用多种流感病毒和具有相似临床症状的呼吸道病毒检验建立体系的特异性.结果 H1和H3亚型流感病毒的检测灵敏度为102 copies/μl,扩增效率分别为101.35％和113.28％,标准曲线相关系数大于99％,重复性良好,特异度实验未发现有非特异性扩增.结论 本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H1、H3亚型流感病毒.     

H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价

目的应用Taq Man探针实时荧光RT-PCR技术,建立一种快速检测H7N9禽流感病毒的方法。方法针对H7N9禽流感病毒的HA和NA基因分别设计特异性引物和Taq Man-LNA探针,建立H7N9禽流感病毒特异性实时荧光RT-PCR快速检测方法。结果本研究建立的方法对检测H7N9禽流感病毒株的灵敏度达到10 PFU/ml。该方法特异性强,与其他亚型流感病毒株及呼吸道病原体无交叉反应。与对照方法相比,本研究方法的检测阳性符合率为99.07%,阴性符合率为100%,Kappa值为0.993。结论建立的检测试剂盒具有快速灵敏、结果准确可靠等优点,适用于H7N9禽流感病毒的分子生物学检测和监测。     

龙华新区H7N9禽流感病毒强化监测分析

目的对龙华新区H7N9强化监测的流感病例、外环境监测标本进行H5、H7和H9亚型禽流感病毒检测,了解禽流感病毒的暴露情况。方法利用实时荧光定量PCR对样本进行流感病毒的AB分型和禽流感病毒H5、H7、H9亚型核酸分型检测。结果在1 570份H7N9禽流感病毒强化监测样本中,检测出A型流感病毒阳性136份,阳性率为8.66%;B型流感病毒阳性86份,阳性率为5.48%;H5、H7、H9亚型核酸检测均为阴性。在278份外环境的检测样本中,禽流感病毒H7亚型阳性17份,H5和H9均为阴性。结论在龙华新区农贸市场的外环境中存在禽流感病毒H7亚型,人们存在感染的风险。目前在流感样病例和不明原因肺炎中尚未检出禽流感病毒H7亚型。     

禽流感病毒H5N1亚型NS1基因在大肠杆菌中的表达

目的表达H5N1亚型禽流感病毒(AIV)NS1蛋白,用于AIV感染与注射灭活疫苗鸡的鉴别诊断和NS1蛋白功能研究。方法采用RT_PCR方法对H5N1亚型AIVNS1基因进行扩增,将PCR产物克隆于pGEM_T_easy载体,将该基因插入pGEX_4T_1中构建NS1基因原核表达载体,转化BL21大肠杆菌后,在IPTG诱导下表达NS1蛋白,Westernblot鉴定表达NS1蛋白。结果成功克隆H5N1亚型AIV的NS1基因,其核苷酸序列长度为690bp,编码230个氨基酸残基。构建NS1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约51×103的NS1融合蛋白。Westernblot鉴定表明表达NS1蛋白与H7N2AIV感染鸡血清有反应性。结论在大肠杆菌中成功表达了H5N1亚型AIVNS1基因蛋白,具有与感染H7N2亚型AIV阳性血清反应原性。     

2013年广州市禽流感职业暴露人群及市场环境禽流感病毒H7N9监测分析

目的了解广州市禽流感职业暴露人群中禽流感病毒H7N9、H9、H5亚型隐性感染状况以及禽类市场环境中H7N9病毒污染状况。方法采集从事家禽养殖、宰杀、贩卖等职业暴露人群以及H7N9疫情专项调查人群血清标本,用红细胞凝集抑制试验（HI）检测H7N9、H9、H5亚型抗体;用实时荧光定量PCR方法对禽类市场环境标本进行H7N9禽流感病毒核酸检测。结果2013年采集职业暴露人群常规监测血清394份,广州某市场首次检出H7N9禽流感病毒后采集密接从业人员专项血清259份,H7、H5检测抗体均为阴性,H9抗体阳性血清分别为23份（5.83％）和7份（2.70％）;6264份市场环境标本中共检出流感A阳性标本204份,其中H7N9亚型阳性5份（0.07％）、H5亚型阳性13份（0.20％）、H9亚型阳性80份（1.27％）、A未分型106份（1.69％）。结论广州市禽流感职业暴露人群在2013年市场首次检出H7N9禽流感病毒前后尚未发现H7N9隐性感染者,广州市禽类市场环境中禽流感病毒亚型仍以H9等低致病性亚型为主,但不排除今后H7N9亚型增多的可能。     

甲型H1N1、季节性H1N1及H3N2亚型流感病毒的多重荧光RT-PCR方法的建立

目的构建一种可同时检测甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2亚型流感病毒的多重荧光RT-PCR方法。方法根据不同流感亚型HA与NA的差异,设计五对引物及五条探针,构建合适的检测体系,分析特异性、灵敏度、可重复性、仪器适用性,并将其与常用检测试剂盒进行比对。结果本研究成功构建多重荧光RT-PCR检测体系,能同时检出甲型H1N1、季节性H1N1及H3N2亚型流感病毒,检测灵敏度为101~102拷贝/μl,可重复性好(变异系数为0.47%~4.03%),比常用检测试剂具有更好的荧光值水平,可适用于多种常见的荧光定量PCR仪。结论本方法所构建检测流感亚型体系具有较好的特异性、灵敏度、可重复性、仪器适用性,适用于各基层疾控及医疗机构。     

禽流感病毒分离株NS基因同源性及等位基因类型分析

目的　克隆测定国内具有代表性的禽流感病毒 (AIV)的非结构 (NS)蛋白基因核苷酸序列 ,分析其同源性和等位基因类型 ,为进一步探索禽流感NS蛋白抗体监测方法奠定基础。方法　经RT PCR扩增了国内 3株H9N2、2株H5N1、2株H7N2亚型AIV分离株的NS蛋白基因 ,并把扩增的基因片段克隆到pGEM T载体中测序 ,将测序结果与GenBank中的核苷酸序列进行同源性比较 ,绘制基因进化树。结果　经测序获得了各AIV分离株NS基因的完整编码序列。同源性分析表明 ,3株H9亚型AIV的NS基因之间的同源性为 96 %～ 98% ;两株H5亚型AIVNS基因同源性为 91 6 % ;两株H7亚型AIV的NS基因同源性为 98 9%。H5和H9亚型分离株的NS基因之间的同源性均高于 90 % ;而H7N2亚型分离株与其它两种亚型分离株的NS基因同源性约为 6 0 %～ 70 %。在AIVNS基因系统发育进化树中 ,H5、H9亚型分离株都处于等位基因A群内 ;3株H9亚型分离株的进化关系较近 ,与香港、广东的部分H5N1病毒株起源相同 ,而 2株H5病毒的NS基因则处于不同分枝内 ;2株H7亚型分离株的NS基因都处于等位基因B群内 ,进化关系较近。结论　这 7株国内AIV分离株的NS基因之间的同源性差异较大 ,约为 6 0 %～ 99% ,且包括A、B两种类型的等位基因     

新型甲型H7N9流感病毒血凝素基因进化分析

目的探讨2013年4月流行的新型甲型H7N9禽流感病毒的表面蛋白血凝素(HA)基因的进化,以及氨基酸的变异情况。方法从美国国家生物技术信息中心(NCBI)和全球禽流感基因共享数据库(GISAID)中下载H7N9流感病毒以及有代表性的H7N2、H7N3、H7N7亚型流感病毒的HA基因序列,运用Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)version 5.05软件进行序列分析,用邻接法构建基因进化树;通过氨基酸序列分析HA蛋白受体结合位点、糖基化位点和裂解位点的变化。结果 2013年新型甲型H7N9流感病毒与2011年浙江禽类H7N3流感病毒株(JQ906573.1)的相似性达到95.3%～95.6%;受体结合位点氨基酸发生变异,为Q226L,5个糖基化位点高度保守;HA裂解位点位于aa339和aa340之间,仅有1个碱性氨基酸:R。结论 2013年新型甲型H7N9流感病毒HA基因是由中国禽类H7亚型进化而来,Q226L变异导致的受体结合位点的变化可能是新型流感病毒具有人感染性的原因。     

Phylogenetic and Molecular Analysis of an H7N7 Avian Influenza Virus Isolated in East Dongting Lake in 2012

Objective In March 2012, an H7N7 subtype avian influenza virus (AIV) named A/wild goose/Dongting/PC0360/2012 (H7N7) (DT/PC0360) was recovered from a wild goose in East Dongting Lake. We performed whole-genome sequencing of the isolate, and analyzed the phylogenetic and molecular characterization.
Methods RNA was extracted from environment samples (including fecal samples from wild bird or domestic ducks, and water samples) for detecting the presence of Influenza A Virus targeting Matrix gene, using realtime RT-PCR assay. The positive samples were performed virus isolation with embryonated eggs. The subtype of the isolates were identified by RT-PCR assay with the H1-H16 and N1-N9 primer set. The whole-genome sequencing of isolates were performed. Phylogenetic and molecular characterizations of the eight genes of the isolates were analyzed.
Results Our results suggested that all the eight gene segments of DT/PC0360 belonged to the Eurasian gene pool, and the HA gene were belonged to distinct sublineage with H7N9 AIV which caused outbreaks in Mainland China in 2013. The hemagglutinin cleavage site of HA of DT/PC0360 showed characterization of low pathogenic avian influenza virus.
Conclusion Strengthening the surveillance of AIVs of wild waterfowl and poultry in this region is vital for our knowledge of the ecology and mechanism of transmission to prevent an influenza pandemic.     

禽流感病毒A型和H5亚型RT-PCR检测试剂盒研究

人类和动物是互相依存的，自从地球上有了生物，经过亿万年沧桑幻变，发生过5次物种大灭绝，然后又滋生繁育、又形成了新的生物群落。按照自然竞争适者生存的法则，能存活下来的、尽管是五花八门、种类多的不胜枚举，但冥冥之中却为地球的生物界编组成了互相依存的食物链，准也离不开谁。人类由于发现发展了种植业和养殖业，生产力人人提高，称霸于地球，演变为今日世界。     

H7N9禽流感的病毒特征及其对人类健康的潜在威胁

H7N9病毒是一种来自鸟类的禽流感病毒毒株基因重配的新型病毒。H7N9病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)在种间传播、病毒复制和致病性等方面起着重要作用。新型H7N9病毒最显著的特征之一是在家禽中无明显致病性,却能感染人类并引起较高的病死率。H7亚型禽流感病毒可有不同的NA亚型,具有较强的兼容性,已引起多次人类的感染事件。可以预见这种影响还将会持续并引起严重的公共卫生问题,必须对此加以高度关注。健全的防控网络的建立有助于最大限度地减少禽流感对人类健康和生命的危害。     

认识甲型H7N9禽流感

自2013年3月31日中国疾病预防控制中心首次自3个不明原因肺炎患者标本中分离出甲型H7N9禽流感病毒,并对该病毒进行进一步研究,描述该病毒的基因结构,首次在中国发现并确诊了甲型H7N9禽流感患者。H7N9禽流感对禽类致病性低,而对人类致病性高,目前尚无人间传播的证据。本文就目前对甲型H7N9禽流感的资料进行总结、分析,从临床的角度对甲型H7N9禽流感的病原学、临床及流行病学资料进行整理、分析。