高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株荧光定量PCR检测方法的建立

目的应用荧光定量PCR技术实现高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的快速鉴定。方法利用所报道的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株Nsp2基因片段设计引物和探针,并对该方法进行特异度、灵敏度、重复性等方面的考察。结果用该方法检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的近源种未发生非特异性扩增,最低检出浓度为1.0×103copy/mL。结论用该荧光定量PCR检测方法检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株不仅特异度好、灵敏度高,且快速简便。     

我国首株牛源贾第虫的分子鉴定

目的通过16S及内转录间区(ITS)rDNA基因序列的扩增、克隆以及序列分析,从分子水平对首次在我国分离的一株牛源贾第虫进行种类及基因型鉴定。方法根据GenBank中登录的贾第虫rRNA基因序列,设计引物,采用热启动-降落PCR方法从牛源贾第虫基因组DNA中扩增出目的片段,经TA克隆至pMD18-T载体后测定其核苷酸序列,然后进行序列分析。结果成功地扩增出该株牛源贾第虫的16S rRNA全基因及rDNA ITS序列,大小为1 715 bp,包括1 447 bp的16S rDNA全长序列和243 bp的ITS间区序列,以及25 bp的26S rDNA基因5'末端。序列分析表明此牛源贾第虫为E型蓝氏贾第虫。结论本研究从分子水平鉴定我国首株牛源贾第虫为蓝氏贾第虫(E型),并首次报道了该虫株的rDNA 16S及ITS序列,为牛源贾第虫的进一步研究奠定了基础。     

高致病性禽流感通用和H5亚型荧光定量PCR方法的建立

目的:建立高致病性禽流感H5亚型荧光定量PCR方法.方法:根据禽流感病毒(AIV)M基因和H5-HA基因分别设计AIV通用和H5亚型特异荧光定量PCR引物和探针,优化反应体系和反应条件,分析该试剂的敏感性、特异性、重复性等.结果:经优化反应体系和反应条件后,AIV通用试剂和AIV-H5试剂的敏感性达到1×101.25EID50水平;与细胞培养比较,AIV-H5试剂Kappa吻合系数κ为0.991(P<0.01),统计学显示两种检测结果的吻合度很强;批内和批间精密度CT值的CV值均远小于10%,可重复性良好.结论:本项目研制的AIV通用试剂和AIV-H5试剂的敏感性、特异性、重复性均好,适合在禽流感疫情和疑似H5禽流感病例中检测使用.     

建立禽流感H7和H9亚型荧光定量PCR检测方法

目的建立高致病性禽流感H7和H9亚型荧光定量PCR方法。方法根据禽流感病毒(avian influenzavirus,AIV)HA-H7基因和HA-H9基因分别设计特异AIV H7和H9亚型特异荧光定量PCR引物和探针,优化反应体系和反应条件,分析该试剂的敏感性、特异性、重复性等。结果经优化反应体系和反应条件后,AIV H7试剂和AIV H9试剂的敏感性达到1×104.67EID50和1×103.80EID50水平,特异性与细胞培养敏感性类似;批内和批间精密度Ct值的CV值均远小于10%,可重复性良好。结论本项目研制的AIV H7和H9亚型的敏感性、特异性、重复性均好,适合在禽流感H7和H9亚型疫情和人类疑似禽流感病例中检测使用。