Mamu-B＊ 007：03及其剪切异构体Mamu-B＊ 007：03-sv1基因的表达与细胞内定位

目的 Mamu-B＊007：03-sv1是中国恒河猴主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）I类分子的一种剪切异构体,其α3结构域缺失。本实验初步获得其在细胞内的表达和定位信息,并与全长的Mamu-B＊007：03基因的表达情况进行比较。方法分别构建Mamu-B＊007：03-sv1-myc-pEGFPN3和Mamu-B＊007：03-myc-pEGFPN3的真核表达载体,并将这两种重组质粒分别转染293T细胞。利用Western-blot免疫印迹实验检测这两种基因在细胞内的表达情况,并利用激光共聚焦显微镜技术分别分析这两种基因在细胞内的表达定位。结果 Mamu-B＊007：03-sv1和Mamu-B＊007：03基因均能在293T细胞内正常表达。Mamu-B＊007：03-sv1发生了糖基化的修饰,Mamu-B＊007：03基因在细胞膜上表达,Mamu-B＊007：03-sv1基因在细胞内表达。结论 Mamu-B＊007：03-sv1基因的α3结构域缺失,其细胞内的表达和定位与全长Mamu-B＊007：03基因有明显差异,其功能有待于进一步探索。     

棕头蜘蛛猴Atfu-B基因α2结构域缺失剪切异构体的表达及其细胞内定位

目的Atfu-B＊svl是棕头蜘蛛猴主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）I类分子的-种剪切异构体,其d2结构域缺失。本实验旨在初步获得其在细胞内的表达和定位信息,并与全长的Atfu—B基因的表达情况进行比较,观察两者之间的差异。方法分别构建Atfu-B＊svl以及全长Atfu—B基因Atfu-＊02：03和Atfu—B＊03：01的真核表达载体,并将这三种重组质粒分别转染293T细胞。利用Westernblot免疫印迹实验检测这三种基因在细胞内的表达情况,并利用免疫荧光和激光共聚焦显微镜技术分别分析这三种基因在细胞内的表达定位。结果Atfu—B＊svl、Atfu-B＊02：03和Atfu—B＊03：01均能在293T细胞内正常表达,并且都发生了糖基化的修饰,三种基因都在细胞膜上表达。结论虽然Atfu-B＊svl的仪2结构域缺失,但其细胞内的表达和定位与全长全长Atfu-B基因没有明显差异,其功能有待于进-步探索。     

中国恒河猴Mamu-B*1703/EGFP在K562和B16细胞中的表达及分布

目的分析恒河猴主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子重链的亚细胞分布,建立适于体外研究恒河猴MHCⅠ类分子表达和抗原呈递功能的细胞系。方法将含Mamu-B*1703重链基因真核表达载体pEGFP-N1分别转染K562和B16细胞,细胞收集后以W6/32单克隆抗体或抗Mamu-B*1703抗血清及PE标记二抗染色,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞术分析Mamu-B*1703复合体在细胞内和细胞表面的表达。结果在K562和B16细胞的细胞质内均可观察到与Mamu-B*1703重链基因融合表达的绿色荧光蛋白激发后的绿色荧光,即2种细胞均可表达外源Mamu-B*1703重链分子;但通过藻红蛋白标记的抗MHCⅠ类分子复合体抗体染色显示,Mamu-B*1703复合体仅表达于K562细胞表面,而不表达于B16细胞表面。结论Mamu-B*1703重链可与人K562细胞而不能与小鼠B16细胞内的βm轻链结合组装成复合体,表达于细胞表面,提示研究恒河猴的MHCⅠ分子表达应利用人类的细胞株。     

FKBP25缺失突变体在细胞中的表达与定位

目的研究FKBP25缺失突变体蛋白在细胞内的表达和定位。方法以人 FKBP25全长 cDNA序列的质粒为模板, PCR方法分别扩增出FKBP25缺失突变体序列,然后插入真核表达载体pcDNA3.1中,通过Western blot方法和免疫荧光方法检测其在细胞株中的表达和定位。结果成功构建了FKBP25缺失突变体的真核表达载体,经Western blot检测FKBP25缺失突变体在HEK 293T细胞中能够有效表达,免疫荧光显微镜结果显示 FKBP25缺失突变体在COS7细胞中分布于细胞核和细胞质。结论 FKBP25缺失突变体在HEK 293T、COS7细胞中能够表达,为了解FKBP25缺失突变体的功能提供了一定基础。     

云南宣威肺腺癌细胞XWLC-05转染HLA-A*0201的抗肿瘤研究

目的 在云南宣威肺腺癌细胞XWLC-05中转染并表达外源性云南肺癌患者白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)等位基因高频位点HLA-A*0201基因,以诱导肿瘤抗原特异性的细胞毒作用.方法 采用序列特异性引物扩增(PCR-SSP)法对XWLC-05细胞行HLA-DNA分型,脂质体转染法将真核质粒pcDNA3.1-HLA-A*0201导入XWLC-05细胞并用G418筛选阳性克隆,淋巴细胞分离液提取健康人外周血单个核细胞(PBMNCs)诱导培养为LAK细胞,免疫磁珠分选法提取出CD8+T淋巴细胞(CTLs),MTT法测试肿瘤特异性的细胞毒效应.结果 筛选出稳定表达HLA-A*0201基因的阳性克隆,免疫激活并分选出HLA-A*0201阳性的CTLs,该细胞对转染了HLA-A*0201基因的肿瘤细胞有更强的杀伤活性.结论 HLA-A*0201基因低表达或缺失,在导致肿瘤细胞免疫逃逸方面起重要作用,HLA-A*0201基因可诱导出HLA-A*0201限制的肿瘤特异性T淋巴细胞杀伤效应.     

补体成分 C3及其缺失突变体蛋白的表达及与 CLIC1蛋白共定位的研究

目的：研究补体成分 C3及其缺失突变体 C3（1-840）、C3（824-1663）在真核细胞内的表达及与氯离子通道蛋白（CLIC1）的共定位。方法构建 pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG、pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG 三个真核表达质粒（缺失突变体根据 C3的结构域及其裂解断裂位置设计）,并分别转染至 HEK 293T 细胞中, Western blot 检测表达情况;上述质粒分别瞬时单转至 COS7细胞和分别与 GFP-CLIC1共转至 COS7细胞内,观察共定位情况。结果成功构建带 FLAG 标签的 C3基因及其两个缺失突变体[C3（1-840）、C3（824-1663）]的真核表达载体, Western blot 结果显示它们在 HEK 293T 细胞中均能成功表达;免疫荧光显示它们在 COS7细胞中均主要分布于细胞质,且三个真核表达载体中只有 C3（824-1663）与 CLIC1有共定位。结论补体 C3及其缺失突变体 C3（1-840）和 C3（824-1663）在 HEK 293T、COS7细胞中均能高效表达,且主要分布在细胞质内,C3（824-1663）与 CLIC1蛋白有共定位。     

人phb1基因在哺乳动物细胞株中的转染定位和表达

目的 构建带Flag标签的phb1真核表达载体,将其转染至COS7细胞中观察phb1蛋白在细胞内的定位,并转染至HEK293T细胞检测其表达.方法 以含人phb1全长cDNA序列的质粒pLenti6-phb1为模板,用PCR方法扩增phb1全长序列,连接至T载体,构建pUCm-T-phb1,Kpn Ⅰ和EcoR I双酶切后插入真核表达载体pCDNA3中,将重组表达质粒pCDNA3-Flag-phb1转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位.转染至HEK2931、细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测.结果 经测序鉴定,成功构建了真核表达载体pCDNA3-Flag-phb1,转染后荧光显微镜观察phb1在COS7细胞中主要定位于胞质;经Western blot检测phb1基因在HEK293T细胞中能够有效表达.结论 实验结果为进一步了解phb1的功能打下了基础.     

人环指蛋白11与核因子κB调控蛋白肿瘤坏死因子α诱导蛋白3相互作用蛋白1相互作用的研究

目的泛素化是机体重要的蛋白质的修饰方式,人环指蛋白(ring finger protein,RNF)11是泛素连接酶家族成员之一,可能在肿瘤形成过程中发挥重要的作用。肿瘤坏死因子α诱导蛋白3相互作用蛋白1(tumor necrosis factorα-induced pro-tein 3-interacting protein 1,TNIP1)是重要的核因子κB(nuclear factor kB,NF-κB)调控蛋白,可通过多种途径调控NF-κB的表达及细胞凋亡。文中研究RNF11下游功能及其与TNIP1之间的相互作用,明确RNF11的亚细胞定位。方法用PCR等方法构建人NFκB调控蛋白TNIP1全长及缺失不同位点的突变体,并观测其在293T细胞中的表达。用免疫共沉淀(co-immunoprecipita-tion,co-IP)方法鉴定其与人RNF11的相互作用,并确定其结合位点,用共聚焦显微镜观测其亚细胞定位。结果成功构建了人TNIP1的全长及其缺失不同位点的突变体并使其在293T细胞中表达。证实RNF11与TNIP1存在相互作用并确定其相互结合位点位于TNIP1的第311至535位氨基酸,。确定RNF11的亚细胞定位于细胞质。结论人RNF11可与TNIP1在细胞内相互结合,其主要的结合位点位于311至535位氨基酸。RNF11主要定位于细胞质,可能参与细胞内蛋白的降解过程。     

C端谷氨酰胺富含结构域调节TIAR的细胞内定位

目的阐明核糖核酸（RNA）结合蛋白T细胞内抗原相关蛋白（TIAR）的结构域与细胞内定位之间的关系。方法细胞免疫荧光检测SMCC-7721细胞内源性TIAR的细胞内分布，亚克隆构建TIAR全长及缺失体的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达质粒，脂质体法瞬时转染SMCC-7721细胞，在荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞内的荧光分布情况，免疫印迹检测融合蛋白的表达情况。结果细胞免疫荧光结果显示在SMCC-7721细胞中TIAR主要浓集于细胞核，细胞浆也有少量弥散分布。酶切鉴定及测序结果显示TIAR全长及缺失体的pEGFP-C3重组表达质粒构建成功。EGFP-TIAR^FL（TIAR全长）主要分布于细胞核；而EGFP-TIAR^RRM123（TIAR的N端3个RNA结合结构域）弥散分布于整个细胞；EGFP-TIAR^Q-rich（TIAR的C端谷胺酰胺富含结构域）浓集于细胞核，但浓集程度要比TIAR^FL-EGFP弱。免疫印迹证实过表达的TIAR全长及缺失体的EGFP融合蛋白分子量大小符合预期。结论我们的结果提示C端谷氨酸富含结构域参与TIAR细胞内定位的调节。     

PAM14缺失突变体在哺乳动物细胞中的表达和定位

目的 构建带HA标签(标签序列YPYDVPDYA,源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇)的PAM14缺失突变体PAM14-N和PAM14-C的真核表达载体,将其分别转染至COS7细胞中观察PAM14-N和PAM14-C蛋白在细胞内的定位,并转染至HEK293T细胞检测其是否表达.方法 以含人PAM14全长cDNA序...     

癌光啉对人骨肉瘤MG-63细胞的光动力杀伤效应

目的 探讨癌光啉(PSD-007)在体外对人骨肉瘤MG-63细胞的光动力杀伤效应.方法 不同浓度(0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/mL)的PSD-007与细胞孵育4 h后,以不同能量(1.5、3.0、6.0、12.0 J/cm2)激光照射,采用溴化四氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞的光密度(D)值及存活率;不同浓度(1.0、2.0、4.0μg/mL)的PSD-007与细胞孵育4 h后,以6.0J/cm2能量的可见光照射,于光学显微镜下观察光动力治疗后细胞形态的变化,应用膜联蛋白V(Annexin V)/碘化丙啶(PI)双染色流式细胞仪分析细胞死亡形式.结果 当PSD-007浓度为2.0μg/mL、光照能量为6.0 J/cm2时,细胞在光动力治疗处理后的存活率明显降低,为52.94%.光动力治疗处理后的细胞逐渐变圆,体积变小,核质比增大,折光性减弱,贴壁能力下降,细胞间隙增大,直到细胞漂浮死亡.流式细胞仪分析结果显示,光动力治疗后死亡细胞主要为坏死或晚期的凋亡细胞.结论 在体外,PSD-007对人骨肉瘤MG-63细胞具有光动力杀伤效应.     

光敏剂癌光啉对小鼠骨肉瘤LM-8细胞体外光动力作用的实验研究

目的 观察光敏剂癌光啉(PSD-007)对小鼠骨肉瘤LM-8细胞的体外光动力效应.方法 将不同浓度的光敏剂PSD-007(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/mL)与小鼠骨肉瘤细胞株LM-8共同孵育4 h,再以630 nm波长的激光为光源,采用不同激光能量照射LM-8细胞(激光波长为630 nm,光照能量分别为1.5、3.0、6.0、9.0 J/cm2),与空白对照组(不加光敏剂且不接受激光照射)、暗毒性组(加光敏剂但不接受激光照射)、激光组(不加光敏剂但接受激光照射)比较,24 h后采用溴化四氮唑蓝(MTT)法测定其光密度值(D540)值,计算抑制率,并于光学显微镜下观察光动力疗法(PDT)后24 h细胞形态的变化.结果 单独照光或光敏剂孵育均无杀伤效应,光敏剂浓度及激光能量是影响杀伤效应的重要因素.PSD-007浓度为4.0μg/mL、光照能量为6.0 J/cm2时,对LM-8细胞有明显的光动力杀伤效果,抑制率为73.8%.光学显微镜下可见细胞形态发生明显的变化,呈坏死或凋亡样改变.结论 在体外,PSD-007对小鼠骨肉瘤LM-8细胞具有明显的光动力杀伤作用.PDT是很有前景的治疗骨肉瘤的新方法.     

癌光啉(PSD-007)——激光照射体外净化白血病细胞的实验研究

研究用铜蒸汽激光照射癌光啉（ＰＳＤ－００７）介导的光敏作用，对白血病细胞系（ＨＬ－６０）的杀伤敏感性表明：白血病细胞对光敏作用敏感，在ＰＳＤ－００７１０μｇ·ｍｌ－１，激光照射２Ｊ·ｃｍ－２的处理条件下，ＨＬ－６０被抑制９８％，而正常骨髓细胞存活４０±８％。将正常骨髓单个核细胞与ＨＬ－６０细胞按１００∶１比例混合后，ＨＬ－６０细胞仍能被选择性杀伤。电镜下见光敏作用后的ＨＬ－６０细胞生物膜结构明显受损。结果提示：ＰＳＤ－００７——激光照射能选择性杀伤白血病细胞。     

光敏剂BCPD-17和PSD007对小鼠骨肉瘤的光动力作用

目的：观察630及 670 nm激光激发不同剂量的光敏剂BCPD-17和PSD-007对小鼠皮下移植骨肉瘤的光动力效应,并对两者进行比较,为筛选光动力疗法（PDT）治疗骨肉瘤的新药提供实验数据。方法：C3H小鼠60只,左侧腰骶部接种LM-8小鼠骨肉瘤细胞,待皮下瘤块直径约6～8　mm时,随机分成空白对照组及PDT治疗组。治疗组分为PSD-007组(5 mg•kg^-1,用波长630 nm激光照射)和BCPD-17组;BCPD-17组分设5和10 mg•kg-¹ 2个剂量组,分别用波长630 nm或670 nm激光照射。小鼠尾静脉注射光敏剂后6 h垂直瘤区行激光照射,功率密度200 mW•cm-2、能量密度240　J•cm^-2、照射时间20　min、光斑1.0　cm。照射7　d后测量肿瘤大小,取瘤体称重计算肿瘤抑制率,并行病理检查。结果：病理组织学观察,对照组小鼠骨肉瘤细胞大而深染,核异型明显;PDT治疗组肿瘤细胞出现坏死,细胞内空泡变性,核固缩,BCPD-17组更明显。PDT治疗组小鼠骨肉瘤的肿瘤质量及体积均明显减少,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。在670nm激光照射后,BCPD-17各组的肿瘤抑制率均高于PSD-007组,组间比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：光敏剂BCPD-17和PSD-007对小鼠LM-8骨肉瘤细胞有明确的抑制作用,光敏剂BCPD-17光动力效果更显著。     

江苏地区骨髓库志愿者HLA-B*15组基因多态性研究及临床意义

目的:调查江苏骨髓库志愿者HLA-B*15等位基因的分布特征,研究其可能对临床供体选择的影响以及相关疾病.方法:利用聚合酶链反应-碱基序列直接测序(PCR-SBT)方法对3 238例江苏人群HLA-B位点的2、3、4外显子序列进行分型,计算HLA-B*15等位基因频率,并与不同人群进行比较.结果:本研究中检出的21种H...     

癌光啉体外净化骨髓中残留白血病变后行自体骨髓移植治疗白血病

目的 :为减少白血病患者自体骨髓移植后白血病复发率和提高长期无病存活率。方法 :采用缓解期急性非淋巴细胞白血病患者的骨髓细胞在体外经处理后用癌光啉 (浓度为 10 μg/ ml)加光照净化 ,待患者完成预处理后回输给自身。结果 :10例急性髓细胞白血病患者接受了本净化方法后移植治疗。净化后输入有核细胞中位数1.3 0 ( 0 .7～ 2 .4 5 )× 10 8/ kg,CD3 4 细胞中位数 2 .3 9( 0 .74～ 4 .0 6)× 10 6/ kg,CFU- GM中位数 1.4 4( 0 .3 2～4 .65 )× 10 4/ kg。 10例中 9例造血功能重建 ,WBC升到 >1.0× 10 9/ L中位数时间 2 0 ( 15～ 4 3 ) d,>2 .0×10 9/ L 中位数时间 3 0 ( 2 1～ 5 5 ) d,BPC>5 0× 10 9/ L 中位数时间 4 6( 2 5～ 62 ) d。经中位 2 6个 ( 2 0～ 64 )月随访 ,有 6例仍无病存活 ;3例复发 ,其中 2例复发后失去随访 ;1例嗜碱细胞性白血病经化疗再次取得缓解 ,至今 CR2后又无复发存活 14个月 ;1例死于与移植相关并发症。结论 :初步结果表明 ,用癌光啉加光照净化自体骨髓中残留白血病细胞后行自体骨髓移植治疗白血病是一种安全而有潜力的方法     

武汉籍汉族类风湿关节炎患者HLA-DRB1*04、*01基因分型和临床相关性研究

为探讨人类白细胞抗原(HLA)-DRB1*04、*01基因与武汉籍汉族类风湿关节炎(RA)的相关性.采用聚合酶链反应-序列特异性引物法(PCR-SSP),对78例RA患者和126例健康者的HLA-DRB1*01、*04基因型进行检测.结果显示RA患者DR4基因频率为52.5%,对照组为21.6%,2组有显著性差异(P＜0.01),DR1基因频率两组无差异(P＞0.05).RA患者HLA-DR4的主要亚型为DRB1*0405(32.1%)与对照组(6.3%)有显著性差异(P＜0.01).DR4阳性的RA患者的关节压痛数、关节肿胀数、类风湿因子(RF)阳性率、关节侵蚀性病变明显高于DR4阴性的患者(P＜0.01).提示HLA-DR4基因与RA患者易感性及疾病严重性相关,其主要亚型为DRB1*0405、DRB1*0401.DR4基因检测可作为一项病情严重程度及预后判断的辅助指标.     

Studies on Preclinical Toxicology of a New Tumor Photolocalizing and Photochemotherapeutic Agent, Photocarcinorin(PsD-007)

Photocarcinorin was prepared in our Lab and its composition was differentfrom that of any other hematoporphyrin photosensitizers by TLC and HPLC analyses.The 95% fiducial limits of iv LD in mice were 176-236 mg·kg~(-1).The iv MLD indogs was 171 mg·kg~(-1).The acute and subacutc toxic tests in 37 dogs showed that theintoxicated manifestations were characterized by a complex syndrome always seen inporphyrias.The biological,laboratory and histopathologic findings revealed that theliver,kidney and erythroeytic series were the target organs.The damages were dose-related and reversible within 2 wk.he phototoxicity was determined in mice with UV ra-diation and compared with that of HpD.The extent of its phototoxic reactions waslower than that of HpD's.